Summary
Здесь мы опишем приготовление ринных корно-гиппокампомповых органотипических срезов. При постепенном и контролируемом лишении сыворотки эти срезы изображают развивающиеся эпилептические события и могут считаться моделью эпилептогенеза ex vivo. Данная система представляет собой отличный инструмент для мониторинга динамики спонтанной активности, а также для оценки прогрессирования нейровоспалительных признаков на протяжении всего хода эпилептогенеза.
Abstract
Олово-оловородные культуры срезов широко используются для моделирования расстройств головного мозга и считаются отличными платформами для оценки нейропротекторного и терапевтического потенциала препарата. Оловоорганические срезы получают из эксплантированной ткани и представляют собой сложную многоклеточную среду ex vivo. Они сохраняют трехмерную цитоархитектуру и локальную среду клеток мозга, поддерживают нейронную связь и взаимное взаимодействие нейрон-глия. Органотипические срезы гиппокампа считаются подходящими для изучения основных механизмов эпилептогенеза, но клинические исследования и животные модели эпилепсии показали, что риновая кора, состоящая из периринальной и энторинальной коры, играет соответствующую роль в генерации судорог.
Здесь мы опишем приготовление ринных корно-гиппокампомповых органотипических срезов. Записи спонтанной активности из области CA3 при перфузии с полной средой роста, при физиологической температуре и при отсутствии фармакологических манипуляций показали, что эти срезы изображают развивающиеся эпилептические события на протяжении всего времени в культуре. Также наблюдалось увеличение гибели клеток через анализ поглощения йодида пропидия и глиоз, оцененный с помощью иммуногистохимии, связанной с флуоресценцией. Представленный экспериментальный подход подчеркивает ценность органотипических культур срезов ринальной коры-гиппокампа как платформы для изучения динамики и прогрессирования эпилептогенеза и скрининга потенциальных терапевтических мишеней для этой патологии головного мозга.
Introduction
Эпилепсия, одно из самых распространенных неврологических расстройств во всем мире, характеризуется периодическим и непредсказуемым возникновением синхронизированной и чрезмерной нейронной активности в головном мозге. Несмотря на различные доступные противоэпилептические препараты (ПЭП), одна треть пациентов с эпилепсией рефрактерны к терапии1 и продолжают испытывать судороги и снижение когнитивных функций. Кроме того, имеющиеся ТПЗ препятствуют познанию из-за их относительно обобщенного действия на активность нейронов. Эпилептогенез трудно изучать на людях из-за множественных и гетерогенных эпилептогенных повреждений, длительных латентных периодов, длящихся от месяцев до десятилетий, и вводящих в заблуждение эффектов противосудорожного лечения после первого спонтанного припадка.
Выявление потенциальных терапевтических агентов для лечения эпилепсии стало возможным благодаря животным моделям эпилепсии: 1) генетическим моделям, в которых используются генетически предрасположенные животные, у которых судороги возникают спонтанно или в ответ на сенсорный раздражитель; 2) модели судорог, вызванных электростимуляцией; и 3) фармакологические модели индукции судорог, в которые используются пилокарпин (агонист мускариновых рецепторов), каинат (агонист рецептора каината) или 4-аминопиридин (блокатор калиевых каналов), среди прочих. Эти модели имели решающее значение для понимания поведенческих изменений, а также молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, и они привели к открытию многих AED2.
Препараты ex vivo также являются мощным инструментом для изучения механизмов, лежащих в основе эпилептогенеза и иктогенеза. Острые срезы гиппокампа, которые позволяют проводить электрофизиологические исследования живых клеток в течение 6-12 ч периода, и органотипические срезы гиппокампа, которые могут сохраняться в инкубаторе в течение нескольких дней или недель, широко использовались в исследованиях эпилептиформной активности3.
Органотипические срезы мозга получают из эксплантированной ткани и представляют собой физиологическую трехмерную модель мозга. Эти срезы сохраняют цитоархитектуру интересуемой области и включают все клетки мозга и их межклеточную связь4. Наиболее используемой областью для долгосрочных органотипических культур является гиппокамп, так как эта область подвержена потере нейронов в нескольких нейродегенеративных состояниях. Они широко используются для моделирования расстройств головного мозга и считаются отличными инструментами для оценки нейропротекторного и терапевтического потенциала препарата5,6. Модели эпилептогенеза, инсульта и Aβ-индуцированной токсичности были описаны в органотипических срезах гиппокампа7,8,9,10. Болезнь Паркинсона исследовали в вентральном мезенцефалоне и полосатом теле, а также коре-телец, мозолистом теле- полосатом теле, субстанции нигры, органотипических срезах11. Органотипические культуры срезов мозжечка имитируют многие аспекты миелинизации аксонов и мозжечковых функций и являются широко распространенной моделью для исследования новых терапевтических стратегий при рассеянном склерозе12.
Тем не менее, клинические исследования и животные модели эпилепсии показали, что риновая кора, состоящая из периринальной и энторинальной коры, играет роль в припадкахпоколения 13. Таким образом, модель эпилептогенеза в эринных корно-гиппокампомповых органотипических срезах была установлена14. При постепенном и контролируемом лишении сыворотки органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают развивающиеся эпилептические события, в отличие от аналогичных срезов, всегда хранящихся в сывороточной среде.
При эпилепсии, как и при многих острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы, нейроцентрическое зрение не в состоянии прояснить механизмы, лежащие в основе начала и прогрессирования заболевания. Клинические и экспериментальные данные указывают на воспаление мозга, в котором микроглия и астроциты играют соответствующую роль, как один из ключевых игроков, способствующих эпилептическому процессу. Фармакологические эксперименты на животных моделях эпилепсии показывают, что антиэпилептогенные эффекты могут быть достигнуты путем нацеливания на провоспалительные пути, и в настоящее время нейровоспаление рассматривается как новый вариант для разработки терапевтических подходов к эпилепсии15.
Здесь мы подробно опишем подготовку ринных корно-гиппокампообразных олово-срезовых культур, а также детали для регистрации спонтанной эпилептиформной активности у них. Мы подчеркиваем, что эта система имитирует несколько нейровоспалительных аспектов эпилепсии, таким образом, подходя для изучения роли глиальных клеток и нейровоспаления в этой патологии. Кроме того, он представляет собой простую в использовании платформу для скрининга потенциальных терапевтических подходов к эпилепсии.
Protocol
Португальское законодательство и руководящие принципы Европейского союза (2010/63/EU) соблюдались во всех процедурах, касающихся защиты животных в научных целях. Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным органом по защите животных iMM (ORBEA-iMM) и Национальным компетентным органом (DGAV - Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Приготовление срезов ринальной коры-гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении срезов ринальной коры-гиппокампа используются крысы P6-7 Sprague-Dawley.
- Настройка культуры и подготовка среды
- За день до посева подготовьте необходимые носители и поместите их при 4 °C.
- Приготовьте среду для рассечения: 25 мМ глюкозы в растворе сбалансированной соли Gey 's Balanced Salt Solution (GBSS).
- Приготовить культурную среду: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% конская сыворотка (HS), 25 мМ глюкозы, 30 мкг/мл гентамицина.
- Подготовьте поддерживающую среду: Нейробазаль-А (НБА), 2% B27, 1 мМ L-глутамина, 30 мкг/мл Гентамицина, HS (15%, 10%, 5% и 0%).
- Сбор мозгов
- Непосредственно перед началом посева добавьте 1,1 мл питательной среды в каждую скважину 6-скважинной пластины с пипеткой P1000 и поместите ее при 37 °C.
- Поместите все оборудование (рассеченный микроскоп, измельчитель тканей, рассекающую лампу, рассекающие инструменты, электроды, пластины, вкладыши и фильтровальные бумаги) внутрь шкафа биологической безопасности и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
- Отрегулируйте толщину среза до 350 мкм.
- Вынимаем GBSS из холодильника. Добавьте 5 мл GBSS к шести чашкам Петри. На каждое животное потребуется шесть чашек Петри.
- Усыплите щенка крысы. Выполните обезглавливание с помощью острых ножниц у основания ствола мозга животного.
- Трижды вымойте голову животного в холодном СГБ И возьмите внутрь шкафа безопасности.
- Выделение тканей и подготовка срезов
- Плотно вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удержать голову.
- Тонкими ножницами разрезаем кожу/кожу головы вдоль средней линии, начиная от позвоночного ямника к лобным долям, и отложите ее в сторону.
- Разрезают таким же образом череп и вдоль мозговой поперечной трещины (пространство между мозгом и мозжечком). С изогнутыми длинными щипцами раздвинуйте его.
- Отбросьте обонятельные луковицы шпателем. Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной GBSS с дорсальной поверхностью, обращенной вверх(рисунок 1A).
- Вставьте тонкие щипцы в мозжечок и пройдите по средней линии, при этом шпатель очень осторожно открывает каждое полушарие(рисунок 1B).
- С помощью коротких кривых щипцов осторожно удалите лишнюю ткань, которая покрывает гиппокамп, не касаясь структуры гиппокампа. Затем шпателем, разрезаем под каждым гиппокампом(рисунок 1С).
- Возьмите одно полушарие и поместите его, с гиппокампом вверх, на фильтровальную бумагу. Повторите процедуру с другим полушарием и поместите его параллельно первому, в фильтровальную бумагу. Положите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей, с полусферами, перпендикулярными лезвию, и разрежьте полусферы на 350 мкм слайсов(рисунок 1D).
- Поместите нарезанную ткань в чашку Петри с холодным GBSS(рисунок 1E).
- Аккуратно отделите срезы с помощью электродов с круглым наконечником(рисунок 1F). Хранят только срезы со структурно неповрежденной ринальной корой и гиппокампом. Области DG и CA должны быть идеально определены, а также энторинальная и периринальная кора(рисунок 1G).
- Поместите каждый срез на вставку(рисунок 1H-I)шпателем и электродом с круглым наконечником. Удалите лишнюю среду для рассечения вокруг каждого среза пипеткой P20(рисунок 1J). Четыре среза ринальной коры-гиппокампа могут быть культивированы в одной вставке(рисунок 1K).
- Поддержание культуры
- Меняйте среду через день.
- Прогрейте среду при 37 °C.
- Возьмите тарелки из инкубатора. Подберите каждую вставку, удерживая пластиковый край щипцами(рисунок 1L).
- Используйте свободную руку, чтобы аспирировать среду из колодца. Поместите вставку обратно в колодец и добавьте 1 мл с пипеткой P1000 свежей подогретой среды(рисунок 1M). Повторите для всех вставок. Убедитесь, что между мембраной и средой не задерживаются пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпилептические срезы подвергаются постепенному и контролируемому лишению сыворотки в среде. Начиная с 9 Days In Vitro (DIV), срезы поддерживаются в NBA без HS14.
Рисунок 1: Детальная процедура приготовления органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. (A) Удалите мозг из головы и поместите его в ледяной GBSS с дорсальной поверхностью, обращенной вверх. (B) Вставьте щипцы в мозжечок. Откройте мозг через среднюю линию и удалите лишнюю ткань над гиппокампом. (C) Шпателем, вырезанным ниже гиппокампа, как указано стрелками. (D) Поместите оба гиппокампа лицом вверх и параллельно друг другу на фильтровальную бумагу и вырежьте 350 мкм ломтики на измельчителье ткани. (E) Поместите нарезанный гиппокамп в ледяной GBSS. (F) Отделяйте срезы с помощью круглых стеклянных электродов. (G) Выбирайте только срезы, которые изображают неповрежденную кору ринального мозга и гиппокамп. (H, I) С помощью круглого стеклянного электрода протолкнуть каждый ломтик к шпательу и поместить его на вставку. (J) Удалите GBSS, окружающий фрагмент. (K) Поместите по четыре фрагмента на вставку. (L) Чтобы изменить среду, поднимите вставку и аспирировать среду стеклянной пипеткой. (M)Добавить свежую среду, поместив пипетку между вставкой и стенками плиты из 6 скважин. Убедитесь, что под срезами нет пузырьков воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Электрофизиологические записи
ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофизиологические записи проводились в органотипических срезах ринальной коры-гиппокампа при 7, 14 и 21 DIV в камере интерфейсного типа. Записи были получены с помощью усилителя, оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения. Все записи были полосовой фильтрацией (восьмиполюсный фильтр Бесселя при 60 Гц и гауссовский фильтр при 600 Гц).
- Подготовка к установке
- Приготовьте 50 мл среды NBA с 1 мл B27 и 250 мкл L-глутамина. Прогреть при 37 °C.
- Установите электрофизиологическую установку в замкнутый контур. Проверьте, составляет ли расход 2 мл/мин.
- Откройте клапан carbox (5% CO2/95% O2)и проверьте уровень воды в системе.
- Поместите фильтровальную бумагу в интерфейсную камеру записи, чтобы слить лишнюю среду, и бумагу для очистки объектива под рамку, чтобы подать среду в срез.
- Включите регулятор температуры, усилители и микроманипулятор.
- Позвольте температуре в интерфейсной камере стабилизироваться при 37 °C перед началом записи.
- Готовят искусственную спинномозговую жидкость (aCSF: 124 мМ NaCl, 3mM KCl, 1,2 мМ2PO4,25 мМ NaHCO3,10 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl2,1 мМ MgSO4 с рН 7,4) и используют ее для заполнения стеклянного электрода шприцем. Поместите его в приемный электрод.
- Записи спонтанной активности
- Как только температура стабилизируется, снимите пластину с инкубатора и вырежьте один кусочек со вставки очень острым лезвием. Поместите его в пластину толщиной 60 мм с каплей среды. Отнести его в интерфейсную камеру записи.
- Поместите срез в интерфейсную камеру с гиппокампом в правом нижнем углу. Поместите приемный электрод в слой пирамидальной ячейки CA3.
- Переходите к протоколу непрерывного сбора и записывайте в течение 30 минут.
3. Анализ поглощения PI
ПРИМЕЧАНИЕ: Гибель клеток оценивали путем мониторинга клеточного поглощения флуоресцентного красителя пропидия йодида (PI). PI представляет собой полярное соединение, которое проникает в клетки с поврежденными клеточными мембранами и взаимодействует с ДНК, испуская красную флуоресценцию (поглощение 493 нм, излучение 630 нм). Поскольку PI не проницаем для живых клеток, он используется для обнаружения мертвых клеток в популяции.
- Инкубация ПИ
- Приготовьте в питательной среде свежее разбавление бульона ПИ в 1:10.
- Для анализа поглощения PI снимите пластину с инкубатора и осторожно поднимите вставку. Добавьте 13 мкл PI к среде пипеткой P20, получив конечную концентрацию 2 мкМ. Медленно перемешайте пластину, прежде чем вернуть вставку на место. Убедитесь, что под срезами нет пузырьков.
- Поместите ломтики обратно в инкубатор при 37 °C на 2 ч.
- Приступайте к протоколу иммуногистохимии, как описано в следующем разделе. Накройте пластины алюминием, так как PI светочувствительна.
4. Иммуногистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: В иммуногистохимии нейрон-специфическое антитело, а также антитела, способные различать покоящиеся и реактивные фенотипы микроглии и астроцитов, использовались для оценки распространения гибели и глиоза нейронов в эпилептикоподобных срезах коры головного мозга-гиппокампа.
- Фиксация тканей
- Извлеките пластину из инкубатора и аспирировать среду. Зафиксируйте ломтики 4% параформальдегидом (PFA) в течение 1 ч при RT, добавив 1 мл PFA под и над ломтиками, с пипеткой P1000.
- Удалите PFA и добавьте 1 мл PBS. Также добавьте PBS под и над фрагментами.
- Держите ломтики при 4 °C, в PBS, до дальнейшего использования. Всегда надевайте парапленку вокруг пластин, чтобы избежать высыхания.
- Иммуноокрашивающие этапы
- Промывайте дважды, по 10 минут каждый раз, 1 мл PBS.
- Готовят пермеабилизирующий/блокирующий раствор, содержащий 1% тритон-Х100, 10% ГС и 10% БСА в ПБС. Готовят 5% раствор БСА.
- Нарисуйте гидрофобным пером два прямоугольника(рисунок 2А). Вырежьте ломтики из вкладыша(рисунок 2B)очень острым лезвием. Положите по два ломтика на слайд(рисунок 2C)и добавьте 140 мкл пермеабилизирующего/блокирующего раствора поверх каждого среза, используя пипетку P200. Инкубировать в течение 3 ч при РТ.
- Разводят первичные антитела к рабочему разведению в 5% BSA в PBS. Инкубировать с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
- Инкубируют с вторичными антителами в течение 4 ч при РТ. С этого шага защитите пластину от света, так как с флуорофорами работают.
- Поместите каплю раствора Hoechst по 50 мкл поверх каждого ломтика и инкубировать в течение 20 мин при RT.
- Промывайте между инкубациями. Всегда мойте три раза, по 10 минут каждый раз, с PBS-T.
- Удалите Hoechst и мойте, как рекомендуется.
- Добавьте 50 мкл монтажной среды поверх каждого среза. Накройте стеклянной крышкой и окружить лаком для ногтей(рисунок 2D).
- Дайте ему высохнуть на RT в течение 24 ч.
- Визуализируйте иммуноокрашивание под конфокальным микроскопом. Держите окрашенные ломтики при -20 °C.
Рисунок 2: Специфическая процедура иммуногистохимического анализа. (A) Гидрофобным пером нарисуйте два квадрата на слайде. (B) Вырежьте кусок вставки, содержащий срез. (C) Поместите каждый срез в квадраты, нарисованные гидрофобной ручкой, и начните этап пермеабилизации/блокировки. (D)После заключения протокола завершите монтаж срезов в монтажной среде, покрыв стеклянной крышкой и окружив ее лаком для ногтей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Representative Results
Основываясь на предыдущих описаниях анализа эпилептических сигналов в органотипических срезах гиппокампа, междожественные эпилептиформные разряды здесь определяются как пароксизмальные разряды, которые четко отличаются от фоновой активности, с резким изменением полярности и происходящие на низкой частоте (<2 Гц). Пароксизмальные разряды, длящиеся более 10 с и происходящие на более высокой частоте (≥2 Гц), характеризуются как иктальная эпилептиформная активность. Если иктальное событие происходит в течение 10 с после предыдущего, эти два события рассматриваются только как одно иктальное событие.
Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа при 7 DIV(рисунок 3A)изображают смешанную межиктальную и иктал-подобную активность. При 14 DIV(рисунок 3B)спонтанная активность характеризуется иктальными разрядами, которые эволюционируют в подавляющую иктальную активность при 21 DIV, при этом иктальные события длятся >1 мин(рисунок 3C).
Рисунок 3: Спонтанная эпилептиформная активность органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Репрезентативные электрографические судорожные события, регистрируемые из области CA3 в камере интерфейсного типа, после(A)7 DIV,(B)14 DIV и(C)21 DIV. Детали захвата показаны в более низких следах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализ поглощения PI с последующим иммуногистохимией против нейронального маркера NeuN, направленным на идентификацию гибели нейронов. Поглощение PI гранулярными и пирамидальными нейронами наблюдалось в 7 срезах DIV (стрелки на рисунке 4A),но количество PI+ нейронов увеличилось на 14 DIV (стрелки на рисунке 4B),что подтверждает повышенную гибель нейронов прогрессированием эпилептогенеза.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения NeuN и PI окрашенных эринной коры-гиппокампа органотипическими срезами. Изображения окрашенных NeuN зрелых нейронов и PI-положительных клеток были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV, на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Стрелки указывают на гибель нейронов (оранжевый). Шкала-бар, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Двойное окрашивание Iba1 вместе с CD68 использовалось для оценки фенотипа микроглии. Iba1 является маркером микроглии / макрофагов, в то время как CD68 представляет собой лизосомальный белок, экспрессируемый в высоких уровнях реактивной микроглией и в низких уровнях микроглией покоя. При 7 DIV срезах разветвленная микроглия с низкой экспрессией CD68 (стрелки на рисунке 5A)более распространены, чем Iba1+/CD68+ реактивная микроглия (наконечники стрел на рисунке 5A),тогда как при 14 DIV во всех областях гиппокампа микроглия Iba1+/CD68+ кустистая/амебоидная микроглия M1 (наконечники стрел на рисунке 5B)превосходят микроглию с низкой экспрессией CD68 (стрелки на рисунке 5B). При 14 DIV некоторые Iba1+/CD68+ клетки с гиперрементификацией могут быть точно определены (открытые наконечники стрел на рисунке 5B),что может свидетельствовать о возникновении противовоспалительного фенотипа микроглии M2. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Недавние исследования показали, что различные инициирующие повреждения ЦНС могут вызывать, по крайней мере, два типа реактивных астроцитов, A1 и A2, причем астроциты A1 являются нейротоксичными16. Подтип астроцитов А1 характеризуется повышенной экспрессией комплемента С316,17,18. Комплемент C3, который играет центральную роль в активации системы комплемента, генерирует C3b, который в дальнейшем деградирует до iC3b, C3dg и C3d19. Таким образом, для оценки астроглиоза было использовано двойное окрашивание GFAP и C3d. При 7 DIV экспрессия C3d едва обнаруживается(рисунок 6A),в то время как в 14 DIV-срезах можно наблюдать гипертрофические GFAP+/ C3d+ астроциты (наконечники стрел на рисунке 6B),предполагая прогрессирующую активацию астроцитов A1.
Результаты демонстрируют прогрессирующую активацию микроглии и астроцитов на протяжении всего хода эпилептогенеза, имитируя события, описанные у пациентов с эпилепсией и на животных моделях этой патологии.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения Iba1 и CD68 окрашенных органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Изображения окрашенных микроглией Iba1 и CD68 и окрашенных ядрами Hoechst были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Стрелки указывают на Iba1+/CD68- покоящейся микроглии, наконечники стрел указывают на Iba1+/CD68+ кустистую/амебоидную микроглию, а открытые наконечники стрелок показывают Iba1+/CD68+ гипер-разветвленную микроглию. Шкала-бар, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные изображения GFAP и C3d окрашенных органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Изображения астроцитов, окрашенных GFAP и C3d, а также окрашенных ядрами Hoechst, были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Наконечники стрел указывают на GFAP+/C3d+ реактивные А1 астроциты (желтого цвета). Шкала-бар, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Животные модели эпилепсии имели решающее значение для открытия многих БЭП, однако они требуют многих животных, и большинство из них отнимают много времени из-за латентного периода начала припадка. Низко магниевая индукция эпилептиформной активности при острых срезах гиппокампа также была тщательно пересмотрена в литературе3,но острые срезы имеют жизнеспособность 6-12 ч, что делает невозможным оценку долгосрочных изменений. Олово-ломтики могут сохраняться в культуре от дней до недель, что позволяет преодолевать короткие сроки жизнеспособности острых срезов, а предложены модели эпилептогенеза в органотипических срезах гиппокампа3,7,8.
Здесь мы описываем подготовку органотипических срезов, включающих ринную кору и гиппокамп. Эти ломтики занимают 15-20 мин для приготовления каждого животного, начиная от жертвоприношения животного до размещения ломтиков на вставках, и можно получить 6-8 ломтиков на полусферу. Особую осторожность необходимо соблюдать при вскрытии полушария для обнажения гиппокампа и при удалении ткани из фильтровальной бумаги после нарезки. Избыток ткани над гиппокампом также может поставить под угрозу целостность среза во время нарезки.
Ринная кора-гиппокамп органотипические срезы изображают развивающуюся эпилептикоподобную активность, напоминающую in vivo эпилепсию. После одной недели в культуре большинство срезов изображают смешанную межиктальную и иктальную активность, которая со временем в культуре прогрессирует до исключительно иктально-подобных событий. До сих пор мы зафиксировали несколько межстворных выделений в срезах за 2-3 недели. В этой системе эпилептическая активность, по-видимому, развивается быстрее, чем в органотипических срезах гиппокампа. Это может быть связано с наличием ринальной коры, которая сохраняет большую часть функционального входа в гиппокамп. Для полного решения этой проблемы в настоящее время проводится полная характеристика эпилептических сигналов, отображаемых этими срезами на протяжении всего времени в культуре, таких как количество и продолжительность иктальных событий вместе с их амплитудой и частотой.
Эта система может поддерживаться в культуре более трех недель и имитирует многие молекулярные корреляты эпилепсии, такие как гибель нейронов, активация микроглии и астроцитов и повышенная выработка провоспалительных цитокинов14,что позволяет долгосрочно охарактеризовать эти аспекты. Он также представляет собой простую в использовании платформу скрининга, где могут быть реализованы фармакологические вмешательства, нацеленные на конкретные клеточные пути, и могут быть протестированы потенциальные терапевтические мишени. Несомненно, представленная здесь система может помочь в дальнейшем просветить механизмы эпилептогенеза.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Отдел биовизуализации Молекулярного института медицины Жуана Лобо Антунеса за все предложения, касающиеся получения изображений.
Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 952455, Фонда за десятые технологии (FCT) через проект PTDC / MEDFAR / 30933/2017 и Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. Inflammation and prevention of epileptogenesis. Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
