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Neuroscience

मस्तिष्क स्लाइस में अभिवाही मार्गों का ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण और वाष्पशील संवेदनाहारी द्वारा प्रतिक्रियाओं का मॉडुलन

Published: July 23, 2020 doi: 10.3791/61333
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Wisconsin, 2Department of Anesthesiology, Rambam Health Care Campus, the Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग अभिवाही इनपुट के लिए प्रतिक्रियाओं पर वाष्पशील संवेदनाहारी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। ऑप्टोजेनेटिक्स को गैर-प्राथमिक नियोकॉर्टेक्स के लिए थैलेमोकोर्टिकल और कॉर्टिकोकोर्टिकल अभिवाही को स्वतंत्र रूप से सक्रिय करने के लिए नियोजित किया जाता है, और सिनैप्टिक और नेटवर्क प्रतिक्रियाओं को आइसोफ्लूरेन के साथ संशोधित किया जाता है।

Abstract

एनेस्थेटिक्स थैलेमोकोर्टिकल सर्किट पर अपने कार्यों के माध्यम से भाग में चेतना को प्रभावित करते हैं। हालांकि, वाष्पशील संवेदनाहारी इन सर्किटों के अलग-अलग सेलुलर और नेटवर्क घटकों को किस हद तक प्रभावित करती है, यह स्पष्ट नहीं है। पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस एक साधन प्रदान करते हैं जिसके द्वारा जांचकर्ता जटिल नेटवर्क के असतत घटकों की जांच कर सकते हैं और प्रतिक्रियाओं पर वाष्पशील संवेदनाहारी के प्रभावों को अंतर्निहित संभावित तंत्र को अलग कर सकते हैं। मस्तिष्क स्लाइस में संभावित सेल प्रकार- और मार्ग-विशिष्ट दवा प्रभावों को अलग करने के लिए, जांचकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से अभिवाही फाइबर मार्गों को सक्रिय करने, कोशिकाओं की गैर-अतिव्यापी आबादी की पहचान करने और जलीय घोल में ऊतक पर वाष्पशील संवेदनाहारी लागू करने में सक्षम होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में नियोकॉर्टेक्स के लिए दो स्वतंत्र अभिवाही मार्गों के लिए ऑप्टोजेनेटिक रूप से विकसित प्रतिक्रियाओं को मापने के तरीकों का वर्णन किया गया है। बाह्य प्रतिक्रियाओं को नेटवर्क गतिविधि परख करने के लिए दर्ज किया जाता है और लक्षित पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग सोमाटोस्टैटिन- और परवल्ब्यूमिन-पॉजिटिव इंटरन्यूरॉन्स में आयोजित की जाती है। सेलुलर और नेटवर्क प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने के लिए कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल तरल पदार्थ के माध्यम से आइसोफ्लूरेन की शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता का वितरण वर्णित है।

Introduction

वाष्पशील संवेदनाहारी का उपयोग एक सदी से अधिक समय से विभिन्न नैदानिक और अकादमिक सेटिंग्स में सर्वव्यापी रूप से किया गया है। एनेस्थेटिक्स के अलग-अलग वर्गों में अद्वितीय, अक्सर गैर-अतिव्यापी आणविक लक्ष्य 1,2,3 होते हैं, फिर भी उनमें से लगभग सभी बेहोशी पैदा करते हैं। जबकि उनके व्यवहार प्रभाव काफी अनुमानित हैं, तंत्र जिसके द्वारा संवेदनाहारी चेतना के नुकसान को प्रेरित करते हैं, काफी हद तक अज्ञात हैं। एनेस्थेटिक्स अंततः कॉर्टिकोथैलेमिक सर्किट पर क्रियाओं के माध्यम से चेतना के स्तर और सामग्री दोनों को प्रभावित कर सकता है, कॉर्टिकल पदानुक्रम 4,5,6,7,8,9 में जानकारी के एकीकरण को बाधित कर सकता है। अधिक मोटे तौर पर, कॉर्टिकोथैलेमिक सर्किट का मॉडुलन प्रयोगात्मक रूप सेचेतना के 10 या औषधीय रूप से11 परिवर्तित राज्यों में भूमिका निभा सकता है, और नींद12 और चेतना13,14 के पैथोफिजियोलॉजिकल विकारों में भी फंसाया जा सकता है।

संज्ञाहरण के दौरान हानि और चेतना की वापसी अंतर्निहित तंत्र की मायावीता को आंशिक रूप से सेलुलर, नेटवर्क और सिस्टम स्तर15 पर एनेस्थेटिक्स के गैर-रैखिक, सहक्रियात्मक कार्यों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आइसोफ्लूरेन चयनित मस्तिष्क क्षेत्रों 16,17,18 के भीतर गतिविधि को दबाता है, दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों 19,20,21,22,23 के बीच कनेक्टिविटी को बाधित करता है, और मार्ग-विशिष्ट तरीके से अन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं को कम करता है 24,25 . चेतना के नुकसान को प्रभावित करने के लिए आणविक से सिस्टम स्तर तक एनेस्थेटिक्स के कौन से प्रभाव आवश्यक या पर्याप्त हैं, यह स्पष्ट नहीं है। गैर-इनवेसिवतकनीकों 19,20,26 का उपयोग करके चेतना की ठोस नैदानिक जांच के अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि प्रयोगकर्ता विशिष्ट सेलुलर और नेटवर्क इंटरैक्शन को अलग करना चाहते हैं जो सचेत अनुभव को वश में करते हैं।

बरकरार मस्तिष्क में पाए जाने वाले जटिल इंटरैक्शन को सरल बनाकर, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस मस्तिष्क की गतिशील प्रणालियों के पृथक घटकों के अध्ययन की अनुमति देतेहैं 9. एक कम टुकड़ा तैयारी इन विट्रो जोड़तोड़ की बहुमुखी प्रतिभा के साथ स्थानीय तंत्रिका सर्किट की अपेक्षाकृत बरकरार शारीरिक संरचनाओं के लाभों को जोड़ती है। हालांकि, हाल ही में, पद्धतिगत बाधाओं ने मस्तिष्क स्लाइस27,28 में लंबी दूरी के इनपुट के अन्तर्ग्रथनी और सर्किट गुणों के अध्ययन को रोक दिया है; कॉर्टिकोथैलेमिक फाइबर ट्रैक्ट्स के यातनापूर्ण पथ ने विद्युत उत्तेजना द्वारा स्वतंत्र अभिवाही मार्गों की सक्रियता को असंभव बना दिया।

मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी पर संवेदनाहारी एजेंटों के प्रभावों की जांच करना अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करता है। एक बरकरार श्वसन और संचार प्रणाली अनुपस्थित, संवेदनाहारी एजेंटों को स्नान-लागू किया जाना चाहिए, और सांद्रता को अनुमानित प्रभाव साइट सांद्रता से सावधानीपूर्वक मिलान किया जाना चाहिए। कई अंतःशिरा संवेदनाहारी एजेंटों के लिए, ऊतक में संतुलन की धीमी दर पारंपरिक औषधीय जांचको श्रमसाध्य 29,30 प्रदान करती है। पूर्व विवो तैयारी में वाष्पशील गैस एनेस्थेटिक्स के प्रभावों की जांच करना अधिक ट्रैक्टेबल है, लेकिन चुनौतियां भी प्रस्तुत करता है। इनमें साँस के आंशिक दबाव की खुराक को जलीय सांद्रता में परिवर्तित करना, और कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव31 के माध्यम से ऊतक को दवा की संशोधित वितरण प्रणाली की आवश्यकता शामिल है।

यहां, विधियों का वर्णन किया गया है जिनके द्वारा जांचकर्ता पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस के लिए दवा वितरण के लिए वाष्पशील संवेदनाहारी आइसोफ्लूरेन के अच्छी तरह से प्रलेखित भौतिक रासायनिक गुणों को भुना सकते हैं, उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ब्याज के कॉर्टिकल क्षेत्र में मार्ग- और परत-विशिष्ट इनपुट को सक्रिय कर सकते हैं, और न्यूरॉन्स की चुनिंदा आबादी से एक साथ लामिना रिकॉर्डिंग और लक्षित पैच क्लैंप का संचालन कर सकते हैं। संयुक्त, ये प्रक्रियाएं जांचकर्ताओं को सिनैप्टिक से स्थानीय नेटवर्क स्तर तक कई अवलोकन योग्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रिया गुणों में वाष्पशील संवेदनाहारी-प्रेरित परिवर्तनों को मापने की अनुमति देती हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को विस्कॉन्सिन-मैडिसन स्कूल ऑफ मेडिसिन और सार्वजनिक स्वास्थ्य पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. इंटरन्यूरॉन उप-जनसंख्या में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रजनन चूहों

  1. समरूप, क्रे-निर्भर टीडीटोमैटो पुरुष माउस को समरूप एसओएम-क्रे मादा या समरूप पीवी-क्रे मादा माउस के साथ जोड़ी।
    नोट: अन्य विशिष्ट न्यूरोनल आबादी उपयुक्त क्रे लाइनों का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है।
  2. आगे बढ़ने से पहले विषमयुग्मजी संतानों को कम से कम 3 सप्ताह की उम्र तक परिपक्व होने दें। यहां वर्णित प्रयोगों के लिए, जीनोटाइपिंग आवश्यक नहीं है, क्योंकि समरूप माता-पिता संतान पैदा करते हैं जो सेल प्रकार-विशिष्ट क्रे पुन: संयोजक और क्रे-निर्भर रिपोर्टर एलील दोनों के लिए सभी विषमयुग्मजी होते हैं।

2. वायरल निर्माण के एकतरफा स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का प्रदर्शन करना

  1. उपकरण उपयोगकर्ता मैनुअल में इंगित इंजेक्शन पिपेट के लिए माइक्रोपिपेट खींचनेवाला की सेटिंग्स समायोजित करें (अनुशंसित सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें)। ग्लास माइक्रोपिपेट खींचें।
  2. पिपेट के तेज अंत की नोक को तोड़ें जैसे कि टिप व्यास कई मिलीमीटर से अधिक न्यूनतम टेपर के साथ लगभग 30 μm है।
  3. पहले प्रलेखित प्रक्रियाओं का उपयोग करके, इंजेक्शन लगाए जाने वाले वायरस के उचित टिटर और मात्रा पर निर्णय लें। यहां वर्णित प्रयोगों में, 1.0 μL (टिटर: 3.1-5.7 टीयू / एमएल) एकतरफा इंजेक्शन ने अच्छे परिणाम दिए।
  4. खनिज तेल के साथ पिपेट की पूरी मात्रा को बैकफिल करें। माइक्रोसिरिंज पर पिपेट लोड करें और टिप के माध्यम से खनिज तेल की एक छोटी मात्रा प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए टिप भरा नहीं है।
  5. वायरल निर्माण के कम से कम 1.0 μL फ्रंटफिल करें। इन प्रयोगों में उपयोग किया जाने वाला पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल वेक्टर एएवी 2-एचएसआईएन-एचएसीएचआर 2 (एच 134 आर) -ईवाईएफपी था।
  6. एक सर्जिकल क्षेत्र में बाँझ पर्दे की व्यवस्था करें। स्टीरियोटैक्सिक प्रक्रिया के लिए उपकरण बाँझ करें और इसे पर्दे पर रखें।
  7. आइसोफ्लूरेन (प्रेरण के लिए 3%, रखरखाव के लिए 1.5-2%) और ऑक्सीजन मिश्रण का उपयोग करके एसओएम-टीडीटोमैटो या पीवी-टीडीटोमैटो विषमयुग्मजी जानवर को संवेदनाहारी करें। समय-समय पर सर्जरी के दौरान पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण के सर्जिकल स्तर की पुष्टि करें। सुनिश्चित करें कि जानवर हर 10-15 मिनट में श्वसन की निगरानी करके संज्ञाहरण की सर्जिकल योजना से आगे नहीं बढ़ता है।
  8. जानवर के सिर के ऊपरी हिस्से को दाढ़ी दें। झिल्ली के सूखने को रोकने के लिए सर्जिकल क्षेत्र और नेत्र मरहम को नेत्र मरहम के लिए 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल और आयोडीन-आधारित समाधान उदारतापूर्वक लागू करें। लिडोकेन (1: 1 अनुपात, 1.0 मिलीग्राम / किग्रा) को स्थानीय संवेदनाहारी के लिए सर्जिकल साइट के लिए चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
  9. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में फिट करें।
  10. खोपड़ी की पृष्ठीय सतह के ऊपर त्वचा के धनु अक्ष के साथ चीरा बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। संदंश का उपयोग कर त्वचा वापस लें। आवश्यकतानुसार 0.9% खारा के साथ हाइड्रेट खोपड़ी।
  11. खोपड़ी की सतह पर, पेंसिल में एक क्रॉस के साथ पूर्वकाल और पार्श्व निर्देशांक के चौराहे को हल्के ढंग से चिह्नित करें। अनुप्रस्थ विमान में उपयुक्त निर्देशांक पर एक छेद ड्रिल करें (ब्रेग्मा के सापेक्ष मिमी में, सिंगुलेट कॉर्टेक्स (सीजी) इंजेक्शन के लिए: पूर्वकाल 0.2, पार्श्व 0.3; पीछे के थैलेमस (पीओ) इंजेक्शन के लिए: पीछे 2.25, पार्श्व 3.4)।
    नोट: मार्किंग पिपेट के सटीक प्लेसमेंट के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए गड़गड़ाहट छेद की सीमाओं से परे विस्तार करना चाहिए।
  12. चालू करें और एयर टेबल को संतुलित करें।
  13. सीजी में इंजेक्शन के लिए 0 ° पर स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के इलेक्ट्रोड मैनिपुलेटर को पुनर्स्थापित करें, या पीओ में इंजेक्शन के लिए कोरोनल प्लेन में 45 ° ।
  14. इलेक्ट्रोड मैनिपुलेटर के लिए सिरिंज पंप संलग्न करें। सिरिंज पंप करने के लिए माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक संलग्न करें।
  15. चरण 2.11 में बनाए गए चिह्नों के चौराहे पर, मस्तिष्क की सतह के पास विंदुक टिप नेविगेट करें (लेकिन स्पर्श नहीं)। मस्तिष्क में अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ लगभग 1 मिमी / सेकंड पर विंदुक अग्रिम या तो 0.9 मिमी (सीजी में इंजेक्शन) या 3.1 मिमी (पीओ में इंजेक्शन)। आगे बढ़ने से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  16. 10 मिनट (100 एनएल / मिनट) की अवधि में वायरल निर्माण के 1.0 μL इंजेक्ट करें। यदि पिपेट सम्मिलन साइट से वायरस की भलाई देखी जाती है, तो इंजेक्शन दर को 50 एनएल /
  17. इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे इंजेक्शन विंदुक वापस लेने से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  18. खोपड़ी चीरा को बंद करने के लिए सिवनी और चमड़े के नीचे 2-5 मिलीग्राम /
  19. संज्ञाहरण से उद्भव के दौरान आइसोफ्लूरेन बंद करें और जानवर की निगरानी करें। एनाल्जेसिक के आगे प्रशासन सहित संस्थान की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार ठीक होने की अनुमति दें।

3. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

  1. ऊतक की कटाई से पहले वायरल निर्माण की अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 3 सप्ताह की अनुमति दें।
  2. टुकड़ा करने की प्रक्रिया (कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ, एसएसीएसएफ टुकड़ा करने की क्रिया) के लिए कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ के 1 एल तैयार करें। सामग्री के लिए तालिका 2 देखें।
  3. टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान, भंग 95% ओ 2/5% सीओ 2 मिश्रण के साथ एसएसीएसएफ की आपूर्ति करें, गैस फैलाव ट्यूब के माध्यम से वितरित किया जाता है।
  4. कंपन ब्लेड माइक्रोटोम के लिए बर्फ ठंडा स्नान तैयार करें। माइक्रोटोम पर बर्फ-ठंडा नमूना चरण माउंट करें और ऊतक सेक्शनिंग के लिए नीलमणि ब्लेड को ठीक करें।
  5. सही पलटा के नुकसान तक 3% आइसोफ्लूरेन और ऑक्सीजन के साथ एनेस्थेटाइज माउस।
  6. गिलोटिन का उपयोग करके माउस को नष्ट करें और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस एसएसीएसएफ में सिर को डुबो दें। ऊतक के स्वास्थ्य को संरक्षित करने के लिए, निम्नलिखित चरणों को जितनी जल्दी हो सके पूरा करें।
  7. खोपड़ी के आधार पर एक छोटा चीरा बनाकर और धीरे-धीरे प्रत्येक खोपड़ी प्लेट को हटाकर खोपड़ी गुहा खोलें। धीरे अंतर्निहित ड्यूरा मेटर को हटा दें।
  8. जबकि मस्तिष्क अभी भी खोपड़ी गुहा में है, सेरिबैलम को हटाने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। बाएं गोलार्ध में धनु विमान के साथ एक दूसरा ऊर्ध्वाधर कटौती करें, बस मध्य रेखा के पार्श्व।
  9. सेक्शनिंग के लिए ऊतक ब्लॉक तैयार करें।
    1. धीरे खोपड़ी गुहा से मस्तिष्क उठाओ। मस्तिष्क को फ्लैट, धनु विमान के साथ फिल्टर पेपर पर रखें। अवरुद्ध टेम्पलेट पर फ़िल्टर पेपर गाइड करें और मस्तिष्क को अंतर्निहित टेम्पलेट रूपरेखा (पूरक चित्रा 1) में संरेखित करें।
    2. टेम्पलेट पर लाइनों द्वारा इंगित के रूप में कोरोनल विमान में दो समानांतर कटौती करें। यदि आवश्यक हो, तो फिल्टर पेपर को गीला रखने के लिए एसएसीएसएफ की एक छोटी बूंद जोड़ें।
    3. चरण 3.8.4 आयोजित किया जाता है, जबकि संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस एसएसीएसएफ में ऊतक ब्लॉक रखें।
    4. बर्फ-ठंडे नमूना चरण में सुपर गोंद की एक छोटी मात्रा लागू करें।
    5. ठंड एसएसीएसएफ से ऊतक ब्लॉक उठाएं। अतिरिक्त एसएसीएसएफ को दूर करने के लिए एक शोषक तौलिया के कोने का उपयोग करें। नीलमणि ब्लेड का सामना करने वाले मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह के साथ, नमूना चरण में ऊतक ब्लॉक के पीछे के कोरोनल विमान को गोंद करें।
  10. 500 μm मोटी कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस ले लीजिए। 34 डिग्री सेल्सियस एसएसीएसएफ में नायलॉन जाल (पूरक चित्रा 2) पर ब्याज के स्लाइस रखें और कंटेनर को कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
    नोट: यहां वर्णित प्रयोगों के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग एक गैर-प्राथमिक संवेदी क्षेत्र, औसत दर्जे का माध्यमिक दृश्य प्रांतस्था (वी 2 एमएम) का अध्ययन करने के लिए ब्रेग्मा के लगभग 2.25 मिमी पीछे केंद्रित एक कोरोनल सेक्शन से एकत्र की गई थी।

4. भंग वाष्पशील संवेदनाहारी आइसोफ्लूरेन युक्त प्रयोगात्मक कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (ईएसीएसएफ) बैग की तैयारी

  1. 3.0% आइसोफ्लूरेन के स्टॉक मिश्रण का 300 मिलीलीटर तैयार करें।
    1. एक सील पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन गैस बैग में, 95% ओ 2/5% सीओ2 गैस मिश्रण के ~ 100 मिलीलीटर को 20-30 मिलीलीटर तरल आइसोफ्लूरेन और 0.9% खारा की एक छोटी मात्रा में जोड़ें। तरल और गैस चरणों के बीच आइसोफ्लूरेन के संतुलन की अनुमति देने के लिए कम से कम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके स्टॉक बैग में जोड़ने के लिए संतृप्त आइसोफ्लूरेनगैस, वी की मात्रा ज्ञात कीजिये:
      Equation 1
      जहां पी% स्टॉक स्टॉक गैस (इस मामले में 3%) की लक्ष्य संरचना है, वीस्टॉक स्टॉक स्टॉक गैस बैग की अंतिम मात्रा है, पीआइसोफ्लूरेन कमरे के तापमान (~ 240 मिमीएचजी) पर आइसोफ्लूरेन का आंशिक दबाव है, और पीकुल वायुमंडलीय दबाव (~ 760 मिमीएचजी) है।
    3. एक खाली गैस बैग में संतृप्त गैस की गणना की गई मात्रा जोड़ें और स्टॉक बैग की कुल मात्रा को 300 एमएल तक लाने के लिए बैग को 95% ओ 2/5% सीओ2 गैस मिश्रण की मात्रा से भरें।
  2. प्रयोग (प्रयोगात्मक एसीएसएफ, ईएसीएसएफ) के दौरान टुकड़ा के छिड़काव के लिए कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ के 2 एल तैयार करें। सामग्री के लिए तालिका 2 देखें। घोल में 95% हे2/5% सीओ2 गैस मिश्रण भंग करें।
  3. नियंत्रण और आइसोफ्लूरेन समाधान के दो अलग-अलग बैग तैयार करें।
    1. एक खाली पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन गैस बैग में, 600 एमएल ईएसीएसएफ और 95% ओ 2/5% सीओ 2 गैस मिश्रण के 600 एमएल जोड़ें। इस बैग को नियंत्रण के रूप में लेबल करें।
    2. एक और खाली पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन गैस बैग में, ईएसीएसएफ के 300 एमएल जोड़ें। इस बैग को आइसोफ्लूरेन के रूप में लेबल करें।
    3. आइसोफ्लूरेन की शारीरिक रूप से प्रासंगिक संतुलित गैस चरण एकाग्रता चुनें। 1.3% आइसोफ्लूरेन के बराबर गैस सांद्रता का उपयोग करके प्रयोग किए गए थे। चूहे 0.9% साँस आइसोफ्लूरेन पर राइटिंग रिफ्लेक्स, और संभवतः चेतना खो देते हैं।
    4. कमरे के तापमान पर समकक्ष गैस चरण एकाग्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें, पी% (टीरूम)31:
      Equation 2
      जहां पी% (टीबॉडी) चरण 4.3.3 में चुनी गई शारीरिक रूप से प्रासंगिक गैस चरण एकाग्रता है, टीकमरा 25 डिग्री सेल्सियस है, और टीबॉडी 37 डिग्री सेल्सियस है।
    5. आइसोफ्लूरेन समाधान में जोड़ने के लिए स्टॉक गैस बैग, वीस्टॉक से गैस की मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें।
      Equation 3
      जहां वीसमाधान आईएसओफ्लूरेन बैग (300 एमएल) में ईएसीएसएफ की मात्रा है, पी% (टीरूम) समीकरण (2) से दर्ज किया जाता है, ω आइसोफ्लूरेन (λ = 1.232) का खारा / गैस ओस्टवाल्ड विभाजन गुणांक है, और पी% स्टॉक स्टॉक गैस बैग (पी% स्टॉक = 3.0%) की गैस चरण एकाग्रता है।
    6. आइसोफ्लूरेन समाधान बैग में, चरण 4.3.5 में गणना की गई स्टॉक गैस बैग, वीस्टॉक से गैस की मात्रा जोड़ें।
    7. आइसोफ्लूरेन समाधान बैग में, आइसोफ्लूरेन समाधान बैग में गैस की कुल मात्राको 300 एमएल तक लाने के लिए 95% ओ 2/5% सीओ2 गैस मिश्रण की मात्रा जोड़ें।
  4. आइसोफ्लूरेन चरण संतुलन की अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए शेकर पर नियंत्रण और आइसोफ्लूरेन बैग दोनों को हिलाएं।
  5. सभी डेटा एकत्र किए जाने के बाद, बैग में शेष समाधान के ऊपर आइसोफ्लूरेन की संतुलित गैस एकाग्रता को मापने के लिए एक संवेदनाहारी गैस मॉनिटर का उपयोग करके सही एकाग्रता को सत्यापित किया जा सकता है।
  6. जलीय इकाइयों में वाष्पशील गैसों की प्रयोगात्मक सांद्रता की रिपोर्ट करें, क्योंकि मिलीमोलर सांद्रता तापमान में परिवर्तन के लिए अधिक मजबूत होती है। कमरे के तापमान गैस चरण एकाग्रता, पी% (टीकमरे), बराबर जलीय एकाग्रता (सीजलीय, एमएम में) 31 को परिवर्तित करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
    Equation 4
    जहां α 25 डिग्री सेल्सियस32 पर आइसोफ्लूरेन के लिए खारा / गैस बनसेन विभाजन गुणांक है।

5. मल्टी-चैनल रिकॉर्डिंग के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर की तैयारी

  1. निर्माता निर्देशों के अनुसार 16-चैनल डेटा अधिग्रहण प्रणाली स्थापित करें।
    नोट: कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एम्पलीफायरों और डेटा अधिग्रहण प्रणालियों का उपयोग मल्टी-चैनल रिकॉर्डिंग एकत्र करने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रयोगों में, एनालॉग सिग्नल को इलेक्ट्रोड संदर्भ पैनल के माध्यम से दो एम्पलीफायरों तक पहुंचाया जाता है, जहां उन्हें प्रवर्धित (2000x) और फ़िल्टर किया जाता है (0.1-10kHz)। डेटा अधिग्रहण प्रणाली के एनालॉग इनपुट 40 किलोहर्ट्ज पर डिजिटाइज किए जाते हैं।
  2. माइक्रोस्कोप माइक्रोमैनिपुलेटर के लिए उपयुक्त 16-चैनल हेडस्टेज एडाप्टर को जकड़ें। एडाप्टर को इस तरह उन्मुख करें कि महिला कनेक्टर बंदरगाह नीचे की ओर सामना कर रहे हों।
  3. इस माइक्रोमैनिपुलेटर के संचालन के कोण को समायोजित करें जैसे कि यह क्षैतिज के सापेक्ष लगभग 70 ° कोण पर रिकॉर्डिंग कक्ष की ओर नीचे की ओर उन्मुख हो।
  4. माइक्रोमैनिपुलेटर के लिए लंगर डाले हेडस्टेज एडाप्टर के माध्यम से इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए हेडस्टेज इनपुट को 16 x 1 जांच से कनेक्ट करें।
  5. हेडस्टेज आउटपुट कनेक्टर को डेटा अधिग्रहण प्रणाली से कनेक्ट करें।
  6. डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर स्थापित करें। पहले 15 मल्टी-चैनल जांच संपर्कों से इनपुट संकेतों के अनुरूप 15 इनपुट चैनलों को कॉन्फ़िगर करें। इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोड से इनपुट प्राप्त करने के लिए शेष चैनल को कॉन्फ़िगर करें।
    नोट: डेटा एकत्र करने और विश्लेषण करते समय इलेक्ट्रोड और एडाप्टर मानचित्रों पर विचार करने के लिए ध्यान रखें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उपयुक्त सिग्नल इलेक्ट्रोड संपर्क से मेल खाता है जिससे इसे एकत्र किया गया था।

6. प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल का विन्यास

  1. प्रकाश वितरण प्रणाली स्थापित करें और साथ में सॉफ़्टवेयर स्थापित करें।
  2. सॉफ़्टवेयर खोलें। हार्डवेयर वायरिंग कॉन्फ़िगरेशन चुनें जिसमें एक ट्रिगर स्रोत (डिजिटल / टीटीएल आउट) प्रकाश वितरण प्रणाली को ट्रिगर इन सिग्नल प्रदान करता है, और प्रकाश वितरण प्रणाली 470 एनएम एलईडी को ट्रिगर आउट सिग्नल प्रदान करती है।
  3. माउंट उच्च शक्ति उद्देश्य लेंस। डिजिटल कैमरे का उपयोग करके, प्रकाश वितरण प्रणाली के साथ उपयोग के लिए उच्च शक्ति उद्देश्य को कैलिब्रेट करें।
  4. प्रकाश उत्तेजना प्रोफाइल के नए प्रोफ़ाइल अनुक्रम बनाएँ।
    1. पसंद का एक पैटर्न बनाएं। यहां वर्णित प्रयोगों में, अक्षतंतु टर्मिनलों की परत-विशिष्ट सक्रियण की अनुमति देने के लिए व्यास 150 μm के एक चक्र का उपयोग किया जाता है।
    2. प्रोफ़ाइल अनुक्रम बनाने के लिए, किसी भी संख्या में परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए इस प्रोफ़ाइल को कॉपी और पेस्ट करें।
    3. एक तरंग सूची बनाएं जिसमें किसी भी प्रकाश तीव्रता, नाड़ी अवधि या नाड़ी संख्या के तरंग रूप हों।
    4. बेतरतीब ढंग से प्रत्येक प्रोफ़ाइल के लिए तरंगों को असाइन करें। अपने असाइन किए गए तरंग के साथ प्रत्येक प्रोफ़ाइल डिजिटल टीटीएल इनपुट, या एक परीक्षण से एक ट्रिगर पल्स से मेल खाती है।
    5. प्रोफ़ाइल अनुक्रम सहेजें।
  5. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में, एक नया प्रोटोकॉल बनाएँ।
    1. अभी बनाए गए प्रोफ़ाइल अनुक्रम में प्रोफाइल की संख्या के बराबर परीक्षणों की संख्या सेट करें।
    2. चरण 5.6 में कॉन्फ़िगर किए गए लोगों से मेल खाने के लिए सिग्नल इनपुट चुनें। एक प्रोटोकॉल कॉन्फ़िगर करें जो एक एकल डिजिटल टीटीएल आउटपुट प्रदान करता है, डिजिटल ट्रिगर से पहले और बाद में उचित समय के लिए इन 16 इनपुट चैनलों से रिकॉर्डिंग करता है।

7. पूर्व विवो मस्तिष्क ऊतक टुकड़ा में मल्टी-चैनल जांच रखना

  1. मिनट पर बुलबुला ईएसीएसएफ (सील बैग में नहीं) 3-6 एमएल /
  2. माइक्रोस्कोप छिड़काव कक्ष में मेष ग्रिड पर ब्याज के क्षेत्र युक्त मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण। प्लैटिनम वीणा के साथ लंगर ( पूरक चित्रा 3 देखें)।
  3. मेष ग्रिड को घुमाएं जैसे कि मल्टी-चैनल जांच के डिस्टल छोर पर इलेक्ट्रोड संपर्कों की रेखा पियाल सतह के लगभग लंबवत है।
  4. ब्रॉडफील्ड रोशनी के तहत और माइक्रोमैनिपुलेटर के ठीक नियंत्रण में, स्लाइस की सतह की ओर मल्टी-चैनल जांच को कम करें।
  5. कॉर्टिकल अभिवाही के अक्षतंतु टर्मिनलों में व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के दृश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर घन संलग्न करने के लिए फिल्टर घन बुर्ज घुमाएँ। यदि आवश्यक हो, तो पियाल सतह के साथ जांच को अधिक सटीक रूप से संरेखित करने के लिए टुकड़ा घुमाएं।
  6. टुकड़ा के विमान के ठीक ऊपर जांच की स्थिति, एक्स अक्ष के साथ अंतिम लक्ष्य स्थिति से ~ 200 μm कम, ऊतक के क्षेत्र की सीमा के बाहर कम से कम एक चैनल छोड़कर दर्ज किया जा रहा है
  7. धीरे-धीरे अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ मैनिपुलेटर को स्थानांतरित करके टुकड़े में जांच डालें। ऊतक को नुकसान को कम करने के लिए, केवल जांच को इस हद तक आगे बढ़ाएं कि तेज युक्तियां ऊतक की सतह के नीचे दिखाई देती हैं। यह ऊतक को नुकसान को कम करेगा, जबकि अभी भी यह सुनिश्चित करेगा कि इलेक्ट्रोड संपर्क ऊतक के संपर्क में हैं।

8. पैच क्लैंपिंग लक्षित न्यूरॉन्स और पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन प्राप्त करना

  1. बैग नियंत्रण समाधान के लिए ईएसीएसएफ स्रोत स्विच करें।
  2. लक्षित पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल सेल की पहचान करें।
    1. एपर्चर आईरिस डायाफ्राम को सबसे छोटे व्यास तक सीमित करें। एक कम शक्ति उद्देश्य लेंस संलग्न करें और ऊतक को फोकस में लाएं।
    2. मल्टी-चैनल जांच से सटे ऊतक के क्षेत्र पर प्रकाश को केंद्रित करें (लेकिन अतिव्यापी नहीं)।
    3. मल्टी-चैनल जांच और उद्देश्य लेंस के बीच संपर्क से बचने के लिए सावधानी का उपयोग करके, उच्च शक्ति (40x या 60x) जल विसर्जन उद्देश्य को संलग्न करें।
    4. क्रे-निर्भर फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की इमेजिंग की अनुमति देने के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट को संलग्न करने के लिए फ़िल्टर क्यूब बुर्ज को घुमाएं।
    5. पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक लक्ष्य के रूप में फ्लोरोसेंटली लेबल सेल की पहचान करें। एक पैच पिपेट को कम करने के लिए पर्याप्त जगह बनाने के लिए उद्देश्य लेंस बढ़ाएं।
  3. आंतरिक समाधान (तालिका 2) के साथ एक पैच पिपेट लोड करें (तालिका 1 देखें) और इलेक्ट्रोड धारक में विंदुक माउंट करें। 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, ~ 0.1 एमएल हवा के अनुरूप सकारात्मक दबाव लागू करें।
  4. समाधान में कम पैच पिपेट। दृश्य मार्गदर्शन के तहत फोकस में विंदुक टिप लाओ।
  5. पहले प्रदर्शित चरणों का उपयोग करके लक्षित सेल से पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करें33.
  6. यदि सेल के आंतरिक गुणों में परिवर्तन का आकलन करने की योजना बना रहे हैं (उदाहरण के लिए, इनपुट प्रतिरोध, वर्तमान चरणों के जवाब में एक्शन पोटेंशियल फायरिंग दर), इन रिकॉर्डिंग का संचालन करें। अन्यथा, नीचे अक्षतंतु उत्तेजना प्रोटोकॉल पर जाएं।

9. अक्षतंतु टर्मिनलों की परत-विशिष्ट ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण

  1. टुकड़ा पर वांछित स्थान के साथ प्रकाश उत्तेजना प्रोफ़ाइल संरेखित करने के लिए एक्स-वाई विमान में देखने के क्षेत्र में हेरफेर करें।
  2. लोड प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल और एक डिजिटल टीटीएल पल्स प्राप्त करने के लिए प्रकाश वितरण प्रणाली तैयार करते हैं।
  3. ऑप्टोजेनेटिक रूप से अक्षतंतु टर्मिनलों को सक्रिय करते हुए एक साथ बाह्य क्षेत्र क्षमता और इंट्रासेल्युलर झिल्ली में उतार-चढ़ाव रिकॉर्ड करते हैं।
  4. आइसोफ्लूरेन समाधान के लिए ईएसीएसएफ स्रोत स्विच करें और 15 मिनट के लिए दवा धो लें। यदि आवश्यक हो, तो वॉश-इन के दौरान सहज रिकॉर्डिंग एकत्र करें।
  5. चरण 9.2-9.3 दोहराएँ।
  6. ईएसीएसएफ स्रोत को नियंत्रण समाधान में स्विच करें और 20 मिनट के लिए दवा धो लें। यदि आवश्यक हो, तो वॉश-आउट के दौरान सहज रिकॉर्डिंग एकत्र करें।
  7. चरण 9.2-9.3 दोहराएँ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों की एक समयरेखा चित्रा 1 में दिखाया गया है। उच्च क्रम कॉर्टिकल क्षेत्रों या गैर-प्राथमिक थैलेमिक नाभिक से आने वाले कॉर्टिकल इनपुट में गैर-प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था24 की परत 1 में आंशिक रूप से अतिव्यापी टर्मिनल फ़ील्ड होते हैं। स्वतंत्र थैलेमोकोर्टिकल या कॉर्टिकोकोर्टिकल अभिवाही मार्गों को अलग करने के लिए, सीएचआर 2 युक्त एक वायरल वेक्टर और पीओ या सीजी में एक ईवाईएफपी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन त्रिज्या के भीतर कोशिकाएं वायरल वेक्टर लेती हैं और, 2-4 सप्ताह के बाद, गैर-विशिष्ट उद्धरण चैनल सीएचआर 2 और सोमा और प्रोजेक्टिंग अक्षतंतु (चित्रा 2 ए) दोनों में रिपोर्टर को व्यक्त करती हैं। कोरोनल स्लाइस एकत्र किए गए थे। उपयुक्त फिल्टर घन लगे हुए के साथ, वायरल निर्माण को व्यक्त करने वाले अक्षतंतु (चित्रा 2 बी) इमेज किए गए थे। एक्सॉन टर्मिनलों को सक्रिय करने के लिए सीएचआर 2 का उपयोग संलग्न सोमा के लिए शर्त के बिना अभिवाही के सक्रियण की अनुमति देता है।

यहां वर्णित प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जानवर एसओएम-टीडीटोमैटो या पीवी-टीडीटोमैटो हाइब्रिड जानवर थे, जो क्रमशः सोमाटोस्टैटिन- (एसओएम +) या परवल्ब्यूमिन-पॉजिटिव (पीवी +) इंटरन्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन टीडीटोमैटो को व्यक्त करते हैं। परत 2/3 में एसओएम + या पीवी + इंटरन्यूरॉन्स को उपयुक्त फिल्टर क्यूब लगे (लेयर 1 सी) के साथ दृश्य मार्गदर्शन के तहत पैच क्लैंपिंग के लिए लक्षित किया गया था। इन इंटरन्यूरॉन्स में परत 1 में डेंड्राइट होते हैं और कॉर्टिकोकोर्टिकल इनपुट (चित्रा 3 ए) के लक्ष्य होते हैं।

एक सील बैग में 3.0% आइसोफ्लूरेन गैस के 125 एमएल और 95% ओ2/5% सीओ2 के 175 एमएल के अलावा 1.3% की गैस की पूर्व-संतुलन एकाग्रता हुई। गैस अपने विभाजन गुणांक के अनुसार ईएसीएसएफ में भंग हो गई; कमरे के तापमान पर आइसोफ्लूरेन की अनुमानित गैस चरण संतुलन एकाग्रता 0.6% (चित्रा 2 डी) थी। गैस मॉनिटर के जरिए इसकी पुष्टि हुई।

ऊतक टुकड़ा रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया था और 16x1 मल्टी-चैनल रिकॉर्डिंग जांच को ऑर्थोगोनली कॉर्टिकल लामिना (चित्रा 2 ई) में रखा गया था। कॉर्टिकल लेयर 1 पर केंद्रित 470 एनएम प्रकाश का 150 μm सर्कल उद्देश्य प्रकाश पथ के माध्यम से वितरित किया गया था, जबकि बाह्य क्षेत्र क्षमता 16 x 1 मल्टी-चैनल जांच का उपयोग करके एकत्र की गई थी और लक्षित पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग इंटरन्यूरॉन्स में आयोजित की गई थी। रिकॉर्डिंग सेट-अप का एक योजनाबद्ध चित्रा 2 एफ में दिखाया गया है।

प्रकाश के चार 2 एमएस दालों (10 हर्ट्ज) की एक ट्रेन के जवाब में इंटरन्यूरॉन्स में पोस्ट-सिनैप्टिक क्षमता (पीएसपी) देखी गई; चित्रा 3 ए)। स्थानीय क्षेत्र क्षमता भी दर्ज की गई थी (चित्रा 3 बी)। वर्तमान स्रोत घनत्व (सीएसडी; चित्रा 3 सी) और बहु-इकाई गतिविधि (एमयूए; चित्रा 3 डी) स्थानीय क्षेत्र क्षमता से निकाले गए थे। पोस्ट हॉक विश्लेषण करने के लिए कई अलग-अलग प्रकाश तीव्रता पर दस परीक्षणों का उपयोग किया गया था। सीएसडी से निकाले गए वर्तमान सिंक का आयाम प्रकाश तीव्रता (चित्रा 4 ए) के एक समारोह के रूप में बढ़ गया। एक तीन-पैरामीटर नॉनलाइनियर लॉजिस्टिक समीकरण मार्गों में तुलना के लिए डेटा के लिए फिट था। पीएसपी आयाम भी वर्तमान सिंक आयाम (चित्रा 4 बी) के साथ वृद्धि हुई है।

थैलेमोकोर्टिकल और कॉर्टिकोकोर्टिकल इनपुट के लिए सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रण, आइसोफ्लूरेन (0.28 एमएम), और वसूली की स्थिति के दौरान मापा गया था। कॉर्टिकोकोर्टिकल उत्तेजनाओं के लिए सोमाटोस्टैटिन- (चित्रा 5 ए) की पोस्ट-सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को आइसोफ्लूरेन के दौरान दबा दिया गया था, जैसा कि वर्तमान सिंक (चित्रा 5 बी) विकसित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों की एक योजनाबद्ध रूपरेखा समयरेखा।
लट्टू: ट्रांसजेनिक जानवरों के प्रजनन और वायरल वेक्टर की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक चरणों की समयरेखा का वर्णन करता है। नीचे: सामग्री तैयार करने और टुकड़ा तैयार करने के दिन प्रयोग करने के लिए चरणों और समयरेखा को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वायरल वेक्टर का इंजेक्शन और तैयारी पूर्व विवो कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस।
(ए) एसओएम-टीडीटोमैटो या पीवी-टीडीटोमैटो हाइब्रिड चूहों में वायरल वेक्टर के इंजेक्शन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) औसत दर्जे का पार्श्विका संघ क्षेत्र (एमपीटीए) के कोरोनल स्लाइस काटे गए थे, और थैलेमोकोर्टिकल (शीर्ष) या कॉर्टिकोकोर्टिकल (नीचे) अभिवाही फाइबर की पहचान परत 1 में उनके ईवाईएफपी रिपोर्टर द्वारा की गई थी। यह आंकड़ा24 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। (सी) सतही परत 2/3 में परत 1 (हरा) और टीडीटोमैटो-लेबल वाले एसओएम + इंटरन्यूरॉन्स (लाल) में ईवाईएफपी-लेबल वाले अक्षतंतु टर्मिनलों का ओवरले। (डी) सील बंद बैग 50:50 समाधान-से-गैस मिश्रण के साथ तैयार किए गए थे। (ई) एमपीटीए (काली रूपरेखा) में 16 x 1 जांच की नियुक्ति। (एफ) कॉर्टिकल स्लाइस में रिकॉर्डिंग सेट-अप की योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कॉर्टिकल स्लाइस में एक साथ इंट्रासेल्युलर और मल्टी-चैनल बाह्य रिकॉर्डिंग।
(ए) एक परत 2/3 पीवी + इंटरन्यूरॉन के सोमा से पूरे सेल वर्तमान क्लैंप पैच रिकॉर्डिंग। 10 हर्ट्ज पर नीली रोशनी (2.2 मेगावाट) के चार दालों (2 एमएस प्रत्येक, नीले तीर) को एल 1 में कॉर्टिकोकोर्टिकल एक्सॉन टर्मिनलों में वितरित किया गया था। दस परीक्षणों (ग्रे निशान) का औसत (लाल ट्रेस) दिखाया गया है। (बी) बाह्य कोशिकीय 16 x 1 जांच के 16 चैनलों से कच्चा डेटा। कॉर्टिकल ऊतक में रखे गए चैनलों को काले रंग में दिखाया जाता है, और ग्रे में कॉर्टेक्स के बाहर झूठ बोलने वाले। (सी) स्थानीय क्षेत्र संभावित संकेत से निकाला गया एक वर्तमान स्रोत घनत्व आरेख, परत 1 में अन्तर्ग्रथनी वर्तमान सिंक (नीला) दिखाता है। (डी) मल्टी-यूनिट गतिविधि, स्थानीय क्षेत्र संभावित संकेत के लिए एक उच्च-पास फ़िल्टर लागू करके उत्पन्न होती है, निचली परतों में उत्पन्न स्पाइकिंग गतिविधि को अलग करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: दो अलग-अलग स्लाइस में रिकॉर्डिंग से प्रतिक्रियाओं की तुलना।
कॉर्टिकल परत 1 में अन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं को उजागर करने के लिए कई प्रकाश तीव्रता का उपयोग किया गया था। प्रत्येक परीक्षण के लिए, विकसित प्रतिक्रिया का शिखर आयाम परत 1 बाह्य कोशिकीय वर्तमान सिंक और ईपीएसपी से परत 2/3 पीवी + इंटरन्यूरॉन्स में निकाला गया था। (ए) थैलेमोकोर्टिकल और कॉर्टिकोकोर्टिकल अभिवाही के बाह्य प्रतिक्रिया प्रोफाइल की तुलना प्रकाश तीव्रता के एक समारोह के रूप में की जाती है। (बी) वर्तमान सिंक आयाम और ईपीएसपी आयाम के बीच संबंध मार्ग निर्भर है। प्रत्येक उत्तेजना मार्ग के भीतर, (ए) और (बी) से डेटा एक साथ एकत्र किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एक साथ रिकॉर्डिंग के दौरान ईएसीएसएफ में भंग आइसोफ्लूरेन का स्नान आवेदन।
(ए) नियंत्रण, आइसोफ्लूरेन और धोने की स्थिति के दौरान कॉर्टिकोकोर्टिकल अभिवाही के सक्रियण पर परत 2/3 एसओएम + इंटरन्यूरॉन से इंट्रासेल्युलर पूरे सेल वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग। ऊर्ध्वाधर नीली रेखाएं प्रकाश उत्तेजनाओं (2 एमएस; 1.65 मेगावाट) को इंगित करती हैं। (बी) वर्तमान स्रोत घनत्व ट्रेस परत 1 में इलेक्ट्रोड से निकाला। डेटा (ए) में एकत्र किए गए लोगों के साथ एक साथ एकत्र किया गया था। धोने पर प्रतिक्रियाओं की वसूली आइसोफ्लूरेन द्वारा अन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं के अवसाद को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वायरस इंजेक्शन के लिए माइक्रोपिपेट
गिलास आईडी: 0.05 मिमी, आयुध डिपो: 0.11 मिमी
लूप्स 1
गर्मी खींचना वेल समय दाब
रैंप + 10 20 40 200 300
पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोपिपेट
गिलास आईडी: 1.1 मिमी, आयुध डिपो: 1.7 मिमी
लूप्स 4
गर्मी खींचना वेल समय दाब
रैंप 0 25 250 500

तालिका 1: वायरल इंजेक्शन और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोपिपेट्स खींचने के लिए अनुशंसित ग्लास और पैरामीटर। वायरल इंजेक्शन और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास का वर्णन किया गया है, साथ ही माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके माइक्रोपिपेट्स खींचने के लिए पैरामीटर भी हैं। आगे की सिफारिशों या सेटिंग्स के ठीक ट्यूनिंग के लिए माइक्रोपिपेट पुलर के लिए निर्देश मैनुअल से परामर्श करें।

स्लाइसिंग एसीएसएफ, एसएसीएसएफ (एमएम में) प्रयोग एसीएसएफ, ईएसीएसएफ (एमएम में)
एनएसीएल 111 111
एनएएचसीओ3 35 35
हेप्स 20 20
केसीएल 1.8 1.8
सीएसीएल2 1.05 2.1
एमजीएसओ4 2.8 1.4
केएच2पीओ4 1.2 1.2
ग्लूकोज़ 10 10
आंतरिक समाधान
के-ग्लूकोनेट 140
एनएसीएल 10
हेप्स 10
ईजीटीए 0.1
एमजीएटीपी 4
एनएजीटीपी 0.3
पीएच = 7.2

तालिका 2: कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ और इंट्रासेल्युलर समाधान की संरचना। पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एसएसीएसएफ, ईएसीएसएफ और इंट्रासेल्युलर पिपेट समाधान के लिए अभिकर्मकों और सांद्रता सूचीबद्ध हैं।

पूरक चित्रा 1: मस्तिष्क स्लाइस इकट्ठा करने के लिए ऊतक के ब्लॉक तैयार करने के लिए टेम्पलेट। टेम्पलेट को उपयुक्त आकार में समायोजित किया जाता है, मुद्रित किया जाता है, और माइक्रोस्कोप स्लाइड से चिपकाया जाता है। इसके उपयोग को लम्बा खींचने के लिए टेम्पलेट पर एक कवर स्लिप चिपकाया जाता है। ऊतक ब्लॉक को धनु विमान के साथ फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर रखा जाता है, गुलाबी पृष्ठभूमि से संरेखित किया जाता है, और काली रेखा के साथ कोरोनल विमान में एक ऊर्ध्वाधर कटौती की जाती है। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: कटाई मस्तिष्क स्लाइस के लिए इनक्यूबेशन कक्ष। कक्ष एसएसीएसएफ से भरा हुआ है और ट्यूबिंग से जुड़ी एक तुला सुई के माध्यम से 95% ओ2/5% सीओ2 गैस मिश्रण के साथ बुलबुला है। इनक्यूबेशन प्लेटफ़ॉर्म प्लास्टिक परिपत्र फिटिंग पर फैले नायलॉन से बना है। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा के लिए प्लैटिनम संरचनाएं। मस्तिष्क टुकड़ा पिपेट के माध्यम से रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है और नायलॉन जाल के शीर्ष पर रखा जाता है, जो चपटा प्लैटिनम तार के घोड़े की नाल के आकार के टुकड़े पर फैला हुआ है और जगह में सुपर चिपका हुआ है। प्लेटिनम वीणा रिकॉर्डिंग के दौरान इसे जगह में लंगर डालने के लिए मस्तिष्क के टुकड़े पर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: अन्य वाष्पशील संवेदनाहारी के लिए ओस्टवाल्ड (_) और बनसेन (α) गुणांक। अन्य वाष्पशील गैस संवेदनाहारी, जैसे हेलोथेन, सेवोफ्लूरेन, या डेसफ्लुरेन के अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करें। इस तालिका में सूचीबद्ध उपयुक्त गुणांक के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित समीकरणों को प्रतिस्थापित करें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में चुनिंदा सक्रिय अभिवाही मार्गों के लिए इंट्रा- और बाह्य प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

ऑप्टोजेनेटिक टूल्स और समानांतर रिकॉर्डिंग योजनाओं का उपयोग जांचकर्ताओं को दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों से अभिवाही इनपुट के लिए स्थानीय आबादी की प्रतिक्रियाओं की जांच करने की अनुमति देता है, जबकि इंटरन्यूरॉन्स की लक्षित आबादी से एक साथ रिकॉर्डिंग करता है। ऑप्टोजेनेटिक तकनीक का उपयोग अभिवाही अनुमानों के अक्षतंतु टर्मिनलों को संरक्षित और सक्रिय करने की अनुमति देता है, भले ही उनके सेल निकाय अब संलग्न न हों। यह पूर्व विवो स्लाइस पर पहले लगाए गए ज्यामितीय प्रतिबंधों से राहत देता है, क्योंकि लंबी दूरी के विद्युत कनेक्शन का संरक्षण अब सर्वोपरि नहीं है। फिर भी, ज्यामितीय विमान में स्लाइस तैयार करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए जो ब्याज के किसी भी शेष कनेक्शन को संरक्षित करता है। उदाहरण के लिए, पिरामिड कोशिकाओं को कॉर्टिकल कॉलम के साथ लंबवत रूप से उन्मुख किया जाता है, और इन प्रयोगों में मल्टीचैनल जांच द्वारा मापा गया नेटवर्क गतिविधि को ऐसे स्थानीय कनेक्शन को यथासंभव संरक्षित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, स्थानीय कनेक्टिविटी को बरकरार रखने के लिए कोरोनल स्लाइस तैयार किए गए थे।

ऑप्टोजेनेटिक निर्माणों और प्रासंगिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का चयन करते समय, उनके उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और सूक्ष्म प्रकाशिकी के गुणों पर विचार किया जाना चाहिए। लगातार प्रकाश उत्तेजना के परिणामस्वरूप कई चैनलरोडोप्सिन वेरिएंट34 की आंशिक निष्क्रियता हो सकती है, जिसे रिपोर्टर प्रोटीन चुनकर टाला जा सकता है जिनके उत्तेजना स्पेक्ट्रा ऑप्सिन के साथ ओवरलैप नहीं होते हैं। विभिन्न कैनेटीक्स या प्रकाश संवेदनशीलता वाले वैकल्पिक वेरिएंट को प्रयोगात्मक प्रतिमान35 के आधार पर भी चुना जा सकता है, जिसमें वैकल्पिक उत्तेजक या निरोधात्मक ऑप्सिन का उपयोग करके जोड़तोड़ शामिल है। फ़िल्टर क्यूब्स को चुने हुए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ उचित रूप से संरेखित किया जाना चाहिए, जैसे कि अभिवाही अक्षतंतु टर्मिनलों या इंटरन्यूरॉन्स को स्वतंत्र रूप से और व्यक्त ऑप्सिन को सक्रिय किए बिना चित्रित किया जा सकता है। वायरस अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, जांचकर्ताओं के लिए रिपोर्टर प्रोटीन के फ्लोरोसेंट आउटपुट द्वारा मापा गया वायरल निर्माण के अभिव्यक्ति स्तर पर किसी भी ऑप्टोजेनेटिक रूप से प्रेरित गतिविधि को सामान्य करना भी प्रासंगिक हो सकता है।

ऊतक को टुकड़ा करने के लिए वाष्पशील संवेदनाहारी की पूर्व-गणना सांद्रता का वितरण भी यहां उल्लिखित विधियों का उपयोग करके संभव है। उचित शारीरिक रूप से प्रासंगिक गैस संतुलन प्रतिशत चुनते समय, जांचकर्ताओं को छिड़काव रेखा और ऊतक36 के बीच भंग आइसोफ्लूरेन गैस के 10-15% नुकसान के लिए जिम्मेदार होना चाहिए। आइसोफ्लूरेन पर लागू तरीकों को प्रस्तुत किया गया है, लेकिन हेलोथेन, सेवोफ्लूरेन, या डेसफ्लुरेन जैसी अन्य दवाओं को उपयुक्त ओस्टवाल्ड और बनसेन गुणांक (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके इसी तरह संभाला जा सकता है। वाष्पशील संवेदनाहारी के विभाजन गुण आश्वस्त करते हैं कि वे अनुमानित रूप से एसीएसएफ में भंग हो जाएंगे। हालांकि, क्योंकि आंशिक दबाव जलीय ईसी50 सांद्रता37 की तुलना में तापमान में परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील हैं, वाष्पशील संवेदनाहारी के गैस संतुलन मात्रा प्रतिशत को विवो में शारीरिक रूप से प्रासंगिक खुराक के लिए देखे गए प्रभावों की तुलना करने के लिए अनुमानित कमरे के तापमान मिलीमोलर सांद्रता में परिवर्तित किया जाना चाहिए। यदि मस्तिष्क स्लाइस में एटोमिडेट या प्रोपोफोल जैसे अंतःशिरा संवेदनाहारी का अध्ययन करने का विकल्प चुनते हैं, तो जांचकर्ताओं को अध्ययन के तहत दवाओं के प्रसार प्रोफाइल पर विचार करना चाहिए, क्योंकि संतुलन समय और शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता बहुत भिन्न हो सकती है30.

इस पांडुलिपि में, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में थैलेमोकोर्टिकल सर्किट के अलग-अलग घटकों पर वाष्पशील संवेदनाहारी के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। वर्णित विधियों में कई चर और मापदंडों को आगे की जांच के लिए हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उपन्यास प्रश्नों के उत्तर देने के लिए उल्लिखित तरीकों को अपनाकर विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों, अभिवाही मार्गों, सेल लक्ष्यों या वाष्पशील संवेदनाहारी का अध्ययन किया जा सकता है। अन्य सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक तरीकों के साथ संयुक्त, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अद्वितीय सेलुलर और नेटवर्क घटकों का अध्ययन गतिशील मस्तिष्क की हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा, और चेतना में औषधीय और पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों के दौरान होने वाले परिवर्तन।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकइस परियोजना पर तकनीकी सहायता और मार्गदर्शन के लिए ब्रायन क्रूस को धन्यवाद देते हैं।

इस काम को इंटरनेशनल एनेस्थीसिया रिसर्च सोसाइटी (आईएमआरए से एआर), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एमआईबी के लिए आर 01 जीएम 10 9 086), और एनेस्थिसियोलॉजी विभाग, स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड पब्लिक हेल्थ, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय, मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5x broadfield objective lens Olympus MPLFLN2.5X
40x water immersion objective lens Olympus LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 mixture Airgas Z02OX95R2003045
A16 probe NeuroNexus A16x1-2mm-100-177-A16 16-channel probe
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Anesthetic gas monitor (POET II) Criticare 602-3A
ATP, Magnesium Salt Sigma Aldrich A9187 intracellular solution
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory 007914 Cre-dependent tdTomato mouse
B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J The Jackson Laboratory 008069 PV-Cre mouse
Belly Dancer Shaker Thomas Scientific 1210H86-TS for equilibration of sealed gas bags
Betadine solution Generic brand
Bleach Generic brand for silver chloriding patch clamp electrode
Bupivicaine
Calcium Chloride (CaCl2) Dot Scientific DSC20010 ACSF
Capillary glass (patch clamp recordings) King Precision Glass, Inc. KG-33 Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm
Capillary glass (viral injections) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X 3.5"
Control of junior micromanipulator Luigs and Neumann SM8 for control of junior micromanipulator
Control of manipulators and shifting table Luigs and Neumann SM7 for control of multichannel electrode and shifting table
Digidata 1440A + Clampex 10 Molecular Devices 1440A Digitizer and software
E-3603 tubing Fisher Scientific 14171208 for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping
EGTA Dot Scientific DSE57060 intracellular solution
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel Neuralynx Retired
Filling needle World Precision Instruments 50821912 for filling patch clamp pipettes
Filter cube for imaging EYFP Olympus U-MRFPHQ
Filter paper Fisher Scientific 09801E lay over slice template during preparation of tissue block
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument P-1000 2.5x2.5 Box filament
Gas dispersion tube Sigma Aldrich CLS3953312C
Glass syringe (100 mL) Sigma Aldrich Z314390 for filling gas-sealed bags
Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) Dot Scientific DSG37020 intracellular solution
Glucose Dot Scientific DSG32040 ACSF
GTP, Sodium Salt Sigma Aldrich G8877 intracellular solution
Headstage-probe adaptor NeuroNexus A16-OM16 adaptor to connect 16-channel probe to headstage input
Hemostatic Forceps VWR International 76192-096
HEPES Dot Scientific DSH75030 ACSF,intracellular solution
HS-16 Headstage Neuralynx Retired
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Isopropyl alcohol (70%) VWR International 101223-746
Junior micromanipulator Luigs and Neumann 210-100 000 0090-R for manipulation of patch clamp electrode
LED Light Source Control Module Mightex BLS-PL02_US optogenetic light source control
Lidocaine
Lynx-8 Amplifier Neuralynx Retired
Lynx-8 Power Supply Neuralynx Retired
Magnesium Sulfate (MgSO4) Dot Scientific DSM24300 ACSF
mCherry, Texas Red filter cube Chroma 49008 for imaging tdTomato fluorescent reporter
Meloxicam
Micropipette holder Fisher Scientific NC9044962
Microsyringe pump World Precision Instruments UMP3-4
Mineral oil Generic brand
MultiClamp 700A Molecular Devices/Axon Instruments 700A Amplifier
Nitrogen (for air table) Airgas NI200
Nylon mesh Fisher Scientific 501460083 stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings
Nylon, cut from pantyhose Generic brand small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp
Ophthalmic ointment Fisher Scientific NC1697520
Pipette Dot Scientific 307 For transferring tissue to rig
Platinum wire VWR International BT124000 2 cm, flattened, to make platinum harp
Polygon400 Mightex DSI-E-0470-0617-000 optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software
Potassium Chloride (KCl) Dot Scientific DSP41000 ACSF
Potassium Phosphate (KH2PO4) Dot Scientific DSP41200 ACSF
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Sapphire blade (for vibratome) VWR International 100492-502
Scalpel blade Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-361445
Sealed gas bag Fisher Scientific 109236
Shifting table for microscope Luigs and Neumann 380FMU
Sodium Bicarbonate (HCO3-) Dot Scientific DSS22060 ACSF
Sodium Chloride (NaCl) Dot Scientific DSS23020 ACSF, intracellular solution
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) The Jackson Laboratory 013044 SOM-Cre mouse
Stereotaxic instrument Kopf Model 902 Dual Small Animal
Super glue Staples 886833 to fix tissue block to specimen stage during slice preparation
Surgical drill RAM Products Inc. DIGITALMICROTORQUE Microtorque II
Syringe (1 mL) with LuerLock tip Fisher Scientific 309628 for application of pressure during patch clamping
Syringe (1 mL) with slip tip WW Grainger, Inc. 19G384 for filling patch clamp pipettes
Syringe Filters VWR International 66064-414
Upright microscope Olympus BX51
Vibrating microtome Leica Biosystems VT1000S
Wypall towels Fisher Scientific 19-042-427

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References

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मस्तिष्क स्लाइस में अभिवाही मार्गों का ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण और वाष्पशील संवेदनाहारी द्वारा प्रतिक्रियाओं का मॉडुलन
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Murphy, C. A., Raz, A., Grady, S. M., Banks, M. I. Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics. J. Vis. Exp. (161), e61333, doi:10.3791/61333 (2020).

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