Summary
Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.
Abstract
Anästhetika beeinflussen das Bewusstsein zum Teil durch ihre Wirkung auf thalamokortikale Schaltkreise. Das Ausmaß, in dem flüchtige Anästhetika unterschiedliche Zell- und Netzwerkkomponenten dieser Schaltkreise beeinflussen, bleibt jedoch unklar. Ex-vivo-Gehirnschnitte bieten ein Mittel, mit dem Forscher diskrete Komponenten komplexer Netzwerke untersuchen und potenzielle Mechanismen entwirren können, die den Auswirkungen flüchtiger Anästhetika auf evozierte Reaktionen zugrunde liegen. Um potenzielle zelltyp- und wegspezifische Arzneimittelwirkungen in Gehirnschnitten zu isolieren, müssen die Forscher in der Lage sein, unabhängig voneinander afferente Faserwege zu aktivieren, nicht überlappende Zellpopulationen zu identifizieren und flüchtige Anästhetika in wässriger Lösung auf das Gewebe aufzutragen. In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, um optogenetisch evozierte Reaktionen auf zwei unabhängige afferente Signalwege zum Neocortex in ex vivo Gehirnschnitten zu messen. Extrazelluläre Reaktionen werden auf die Assay-Netzwerkaktivität aufgezeichnet und gezielte Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen werden in Somatostatin- und Parvalbumin-positiven Interneuronen durchgeführt. Die Abgabe physiologisch relevanter Isoflurankonzentrationen über künstliche Rückenmarksflüssigkeit zur Modulation von Zell- und Netzwerkantworten wird beschrieben.
Introduction
Flüchtige Anästhetika werden seit mehr als einem Jahrhundert ubiquitär in einer Vielzahl von klinischen und akademischen Umgebungen eingesetzt. Verschiedene Klassen von Anästhetika haben einzigartige, oft nicht überlappende molekulare Ziele 1,2,3, aber fast alle von ihnen erzeugen Bewusstlosigkeit. Während ihre Verhaltenseffekte ziemlich vorhersehbar sind, sind die Mechanismen, durch die Anästhetika Bewusstseinsverlust induzieren, weitgehend unbekannt. Anästhetika können letztendlich sowohl das Niveau als auch den Inhalt des Bewusstseins durch Aktionen auf kortikothalamische Schaltkreise beeinflussen und die Integration von Informationen in der gesamten kortikalen Hierarchiestören 4,5,6,7,8,9. Im weiteren Sinne kann die Modulation kortikothalamischer Schaltkreise eine Rolle bei experimentell 10 oder pharmakologisch 11 veränderten Bewusstseinszuständen spielen und kann auch mit Schlafstörungen12 und pathophysiologischen Bewusstseinsstörungen13,14 in Verbindung gebracht werden.
Die Flüchtigkeit der Mechanismen, die dem Verlust und der Rückkehr des Bewusstseins während der Anästhesie zugrunde liegen, kann teilweise auf nichtlineare, synergistische Wirkungen von Anästhetika auf zellulärer, Netzwerk- und Systemebene zurückgeführt werden15. Isofluran zum Beispiel unterdrückt die Aktivität innerhalb der ausgewählten Hirnregionen 16,17,18, beeinträchtigt die Konnektivität zwischen entfernten Hirnregionen 19,20,21,22,23 und verringert synaptische Reaktionen in einer wegspezifischen Weise24,25 . Welche Wirkungen von Anästhetika, von der molekularen bis zur Systemebene, notwendig oder ausreichend sind, um Bewusstseinsverlust zu bewirken, bleibt unklar. Zusätzlich zu substantiellen klinischen Untersuchungen des Bewusstseins mit nicht-invasiven Techniken 19,20,26 ist es wichtig, dass Experimentatoren versuchen, die unterschiedlichen zellulären und Netzwerkinteraktionen, die der bewussten Erfahrung dienen, zu entwirren.
Durch die Vereinfachung der komplexen Interaktionen im intakten Gehirn ermöglichen Ex-vivo-Gehirnschnitte die Untersuchung isolierter Komponenten der dynamischen Systeme des Gehirns9. Ein reduziertes Schnittpräparat kombiniert die Vorteile relativ intakter anatomischer Strukturen lokaler neuronaler Schaltkreise mit der Vielseitigkeit von In-vitro-Manipulationen. Bis vor kurzem haben methodische Einschränkungen jedoch die Untersuchung der synaptischen und Schaltkreiseigenschaften von Langstreckeneingaben in Gehirnschnitten ausgeschlossen27,28; Der gewundene Weg der kortikothalamischen Faserbahnen machte die Aktivierung unabhängiger afferenter Bahnen durch elektrische Stimulation nahezu unmöglich.
Die Untersuchung der Wirkung von Anästhetika auf die Gehirnschnittpräparate stellt zusätzliche Herausforderungen dar. In Ermangelung eines intakten Atmungs- und Kreislaufsystems müssen Anästhetika im Bad angewendet und die Konzentrationen sorgfältig auf die geschätzten Konzentrationen an der Wirkungsstelle abgestimmt werden. Bei vielen intravenösen Anästhetika macht die langsame Gleichgewichtsrate im Gewebe traditionelle pharmakologische Untersuchungen mühsam 29,30. Die Untersuchung der Auswirkungen von flüchtigen Gasanästhetika in Ex-vivo-Präparaten ist handhabbarer, stellt aber auch Herausforderungen dar. Dazu gehören die Umwandlung inhalativer Partialdruckdosen in wässrige Konzentrationen und die Notwendigkeit eines modifizierten Verabreichungssystems des Arzneimittels zum Gewebe über künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit31.
Hier werden Methoden beschrieben, mit denen Forscher die gut dokumentierten physikochemischen Eigenschaften des flüchtigen Anästhetikums Isofluran für die Wirkstoffabgabe an ex vivo Gehirnschnitte nutzen, weg- und schichtspezifische Eingaben in einen kortikalen Bereich von Interesse mit hoher raumzeitlicher Auflösung aktivieren und simultane laminare Aufnahmen und gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen von ausgewählten Neuronenpopulationen durchführen können. In Kombination ermöglichen diese Verfahren den Forschern, flüchtige, durch Anästhetika induzierte Veränderungen in mehreren beobachtbaren elektrophysiologischen Reaktionseigenschaften von der synaptischen bis zur lokalen Netzwerkebene zu messen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren mit Tieren, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wurden von der University of Wisconsin-Madison School of Medicine und dem Public Health Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Züchtung von Mäusen zur Expression von fluoreszierendem Reporterprotein in Interneuron-Subpopulationen
- Paaren Sie homozyogische, Cre-abhängige tdTomato-Maus mit homozygoter SOM-Cre-Weibchen oder homozygoter PV-Cre-Weibchenmaus.
HINWEIS: Andere spezifische neuronale Populationen können mit den entsprechenden Cre-Linien anvisiert werden. - Lassen Sie heterozygote Nachkommen mindestens 3 Wochen reifen, bevor Sie fortfahren. Für hier beschriebene Experimente ist eine Genotypisierung nicht notwendig, da homozygote Eltern Nachkommen produzieren, die sowohl für zelltypspezifische Cre-Rekombinase als auch für Cre-abhängige Reporterallele alle heterozygot sind.
2. Durchführung einer einseitigen stereotaktischen Injektion eines viralen Konstrukts
- Passen Sie die Einstellungen des Mikropipettenziehers für Injektionspipetten wie in der Gerätebedienungsanleitung angegeben an (empfohlene Einstellungen siehe Tabelle 1 ). Ziehen Sie an der Glasmikropipette.
- Brechen Sie die Spitze des scharfen Endes der Pipette so, dass der Spitzendurchmesser ca. 30 μm mit minimaler Verjüngung über mehrere Millimeter beträgt.
- Entscheiden Sie anhand zuvor dokumentierter Verfahren über den geeigneten Titer und das Volumen des zu injizierenden Virus. In den hier beschriebenen Experimenten führten einseitig injizierte 1,0 μL (Titer: 3,1-5,7 TU/ml) zu guten Ergebnissen.
- Füllen Sie das gesamte Volumen der Pipette mit Mineralöl auf. Laden Sie die Pipette auf die Mikrospritze und lassen Sie eine kleine Menge Mineralöl durch die Spitze fließen, um sicherzustellen, dass die Spitze nicht verstopft ist.
- Frontfill mindestens 1,0 μL virales Konstrukt. Der rekombinante adeno-assoziierte virale Vektor, der in diesen Experimenten verwendet wurde, war AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Sterile Vorhänge in einem chirurgischen Bereich anordnen. Sterilisieren Sie Werkzeuge für stereotaktische Verfahren und legen Sie sie auf den Vorhang.
- Anästhesieren Sie SOM-tdTomato oder PV-tdTomato heterozygotes Tier mit Isofluran (3% für Induktion, 1,5-2% für Erhaltung) und Sauerstoffgemisch. Bestätigen Sie regelmäßig das chirurgische Niveau der Anästhesie mit Zehenklemme während der Operation. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht über den chirurgischen Plan der Anästhesie hinausgeht, indem Sie die Atmung alle 10-15 Minuten überwachen.
- Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes des Tieres. Tragen Sie 70% Isopropylalkohol und Lösung auf Jodbasis großzügig auf den chirurgischen Bereich und die Augensalbe auf die Augenhöhlen auf, um ein Austrocknen der Membran zu verhindern. Bupivacain/Lidocain (Verhältnis 1:1, 1,0 mg/kg) subkutan an die Operationsstelle zur Lokalanästhesie verabreichen.
- Passen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen.
- Verwenden Sie das Skalpell, um einen Schnitt entlang der sagittalen Hautachse über der dorsalen Oberfläche des Schädels zu machen. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zurück. Hydratisieren Sie den Schädel nach Bedarf mit 0,9% Kochsalzlösung.
- Markieren Sie auf der Oberfläche des Schädels leicht den Schnittpunkt von vorderen und lateralen Koordinaten mit einem Kreuz in Bleistift. Bohren Sie ein Loch an den entsprechenden Koordinaten in der Querebene (in mm relativ zu Bregma, für die Injektion des cingulären Kortex (Cg): anterior 0,2, lateral 0,3; für posterior thalamus (Po) Injektion: posterior 2,25, lateral 3,4).
HINWEIS: Die Markierungen sollten über die Grenzen des Gratlochs hinausgehen, um eine genaue Platzierung der Pipette zu ermöglichen. - Schalten Sie den Lufttisch ein und balancieren Sie ihn aus.
- Positionieren Sie den Elektrodenmanipulator des stereotaktischen Rahmens bei 0° für Injektionen in Cg oder 45° in der koronalen Ebene für Injektionen in Po.
- Befestigen Sie die Spritzenpumpe am Elektrodenmanipulator. Befestigen Sie die Steuerung der Mikrospritzenpumpe an der Spritzenpumpe.
- Navigieren Sie durch die Pipettenspitze in der Nähe der Gehirnoberfläche (aber ohne sie zu berühren), an der Kreuzung der in Schritt 2.11 erstellten Markierungen. Die Pipette wird mit etwa 1 mm/s entlang ihrer Längsachse entweder 0,9 mm (Injektion in Cg) oder 3,1 mm (Injektion in Po) in das Gehirn vorgeschoben. Warten Sie 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.
- Injizieren Sie 1,0 μL virales Konstrukt über einen Zeitraum von 10 min (100 nL / min). Wenn eine Wellung des Virus von der Pipetteneinführungsstelle beobachtet wird, verlangsamen Sie die Injektionsrate auf 50 nL / min.
- Warten Sie nach der Injektion 10 Minuten, bevor Sie die Injektionspipette langsam zurückziehen.
- Naht, um den Kopfhautschnitt zu schließen und 2-5 mg/kg Meloxicam subkutan zu verabreichen.
- Setzen Sie Isofluran ab und überwachen Sie das Tier während des Auftauchens aus der Narkose. Lassen Sie die Erholung nach den vom Animal Care and Use Committee der Institution beschriebenen Verfahren durchführen, einschließlich der weiteren Verabreichung von Analgetika.
3. Vorbereitung von akuten Hirnschnitten
- Warten Sie mindestens 3 Wochen für die Expression des viralen Konstrukts, bevor Sie Gewebe entnehmen.
- Bereiten Sie 1 L künstliche Rückenmarksflüssigkeit für das Schneiden vor (Schneiden künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit, sACSF). Siehe Tabelle 2 für Inhaltsstoffe.
- Während des gesamten Schneidevorgangs wird sACSF ein gelöstes 95% O2/5% CO2-Gemisch zugeführt, das über ein Gasdispersionsrohr abgegeben wird.
- Bereiten Sie das eiskalte Bad für das vibrierende Klingenmikrotom vor. Montieren Sie den eiskalten Probentisch auf das Mikrotom und fixieren Sie die Saphirklinge zum Schneiden des Gewebes.
- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran und Sauerstoff bis zum Verlust des aufrichtenden Reflexes.
- Enthaupten Sie die Maus mit der Guillotine und tauchen Sie den Kopf sofort in 4 ° C sACSF. Um die Gesundheit des Gewebes zu erhalten, führen Sie die folgenden Schritte so schnell wie möglich aus.
- Öffnen Sie die Schädelhöhle, indem Sie einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis machen und jede Schädelplatte vorsichtig entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die darunterliegende Dura mater.
- Während sich das Gehirn noch in der Schädelhöhle befindet, verwenden Sie die Rasierklinge, um das Kleinhirn zu entfernen. Machen Sie einen zweiten vertikalen Schnitt entlang der sagittalen Ebene in der linken Hemisphäre, nur seitlich zur Mittellinie.
- Bereiten Sie den Gewebeblock für das Schneiden vor.
- Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus der Schädelhöhle. Legen Sie das Gehirn auf das Filterpapier mit der flachen, sagittalen Ebene nach unten. Führen Sie das Filterpapier über die blockierende Schablone und richten Sie das Gehirn an der zugrunde liegenden Vorlagengliederung aus (ergänzende Abbildung 1).
- Machen Sie zwei parallele Schnitte in der koronalen Ebene, wie durch die Linien auf der Schablone angezeigt. Fügen Sie bei Bedarf einen kleinen Tropfen sACSF hinzu, um Filterpapier nass zu halten.
- Legen Sie den Gewebeblock kurz in 4°C sACSF, während Schritt 3.8.4 durchgeführt wird.
- Tragen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber auf die eiskalte Probenstufe auf.
- Heben Sie den Gewebeblock von kaltem sACSF an. Verwenden Sie die Ecke eines saugfähigen Handtuchs, um überschüssiges sACSF abzuleiten. Kleben Sie die hintere koronale Ebene des Gewebeblocks auf das Probenstadium, wobei die dorsale Oberfläche des Gehirns der Saphirklinge zugewandt ist.
- Sammeln Sie 500 μm dicke koronale Hirnschnitte. Legen Sie interessante Scheiben auf Nylongitter (ergänzende Abbildung 2) in 34 °C sACSF und lassen Sie den Behälter Raumtemperatur erreichen.
HINWEIS: Für hier beschriebene Experimente wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen von einem koronalen Abschnitt gesammelt, der etwa 2,25 mm hinter Bregma zentriert war, um einen nicht-primären sensorischen Bereich, den medialen sekundären visuellen Kortex (V2MM), zu untersuchen.
4. Herstellung von experimentellen künstlichen Rückenmarksflüssigkeitsbeuteln (eACSF) mit gelöstem flüchtigem Anästhetikum Isofluran
- Bereiten Sie 300 ml einer Stammmischung von 3,0% Isofluran vor.
- In einem versiegelten Polytetrafluorethylen-Gasbeutel ~100 ml 95% O 2/5% CO 2-Gasgemisch zu 20-30 mL flüssigem Isofluran und einer kleinen Menge 0,9% Kochsalzlösung hinzufügen. Warten Sie mindestens 30 Minuten, um das Gleichgewicht von Isofluran zwischen flüssiger und gasförmiger Phase zu ermöglichen.
- Bestimmen Sie die Menge an gesättigtem Isoflurangas, Vsat, die dem Brühbeutel hinzugefügt werden soll, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
wobei P%stock die Zielzusammensetzung des Vorratsgases (in diesem Fall 3%),V-Bestand das Endvolumen des Vorratsgasbeutels, P-Isofluran der Partialdruck vonIsofluran bei Raumtemperatur (~ 240 mmHg) und Pinsgesamt der atmosphärische Druck (~ 760 mmHg) ist. - Geben Sie die berechnete Menge an gesättigtem Gas in einen leeren Gasbeutel und füllen Sie den Beutel mit einem Volumen von 95% O 2/5% CO2 Gasgemisch, um das Gesamtvolumen des Beutels auf 300 ml zu bringen.
- Bereiten Sie 2 L künstliche Rückenmarksflüssigkeit für die Durchblutung der Scheibe während des Experiments vor (experimentelle ACSF, eACSF). Siehe Tabelle 2 für Inhaltsstoffe. 95% O 2/5% CO2 Gasgemisch werden in Lösung gelöst.
- Bereiten Sie zwei separate Beutel mit Kontroll- und Isofluran-Lösungen vor.
- Zu einem leeren Polytetrafluorethylen-Gasbeutel werden 600 mL eACSF und 600 mL 95% O 2/5% CO 2-Gasgemisch hinzugefügt. Beschriften Sie diese Tasche als Control.
- Zu einem weiteren leeren Polytetrafluorethylen-Gasbeutel 300 ml eACSF hinzufügen. Beschriften Sie diesen Beutel als Isofluran.
- Wählen Sie eine physiologisch relevante äquilibrierte Gasphasenkonzentration von Isofluran. Die Experimente wurden mit Gaskonzentrationen durchgeführt, die 1,3% Isofluran entsprechen. Mäuse verlieren den aufrichtenden Reflex und vermutlich das Bewusstsein bei 0,9% inhaliertem Isofluran.
- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die äquivalente Gasphasenkonzentration bei Raumtemperatur P%(T-Raum)31 zu berechnen:
wobei P%(T-Körper) die in Schritt 4.3.3 gewählte physiologisch relevante Gasphasenkonzentration ist, derT-Raum 25 °C und derT-Körper 37 °C beträgt. - Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das Gasvolumen aus dem Lagergasbeutel,V-Vorrat, zu bestimmen, das der Isofluranlösung hinzugefügt werden soll.
wobei V-Lösung das Volumen von eACSF im ISOFLURAN-Beutel (300 ml) ist, P%(T-Raum) aus Gleichung (2) eingegeben wird, λ der Salz-/Gas-Ostwald-Verteilungskoeffizient von Isofluran (λ = 1,232) und P%stock die Gasphasenkonzentration des Standardgasbeutels ist (P%stock = 3,0%). - Fügen Sie dem Isofluran-Lösungsbeutel das in Schritt 4.3.5 berechnete Gasvolumen aus dem VorratsgasbeutelV hinzu.
- Fügen Sie dem Isofluran-Lösungsbeutel ein Volumen von 95% O 2/5% CO2-Gasgemisch hinzu, um das Gesamtvolumen des Gases im Isofluran-Lösungsbeutel auf 300 ml zu erhöhen.
- Schütteln Sie sowohl Kontroll- als auch Isofluranbeutel mindestens 1 Stunde lang auf dem Shaker, um das Isofluran-Phasengleichgewicht zu ermöglichen.
- Nachdem alle Daten gesammelt wurden, kann die korrekte Konzentration überprüft werden, indem ein Anästhesiegasmonitor verwendet wird, um die äquilibrierte Gaskonzentration von Isofluran über der verbleibenden Lösung im Beutel zu messen.
- Geben Sie experimentelle Konzentrationen flüchtiger Gase in wässrigen Einheiten an, da Millimolarkonzentrationen robuster gegenüber Temperaturänderungen sind. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Gasphasenkonzentration bei Raumtemperatur, P%(T-Raum), in äquivalente wässrige Konzentration (Cwässrig, in mM)31 umzurechnen:
wobei α der Salz-Gas-Bunsen-Verteilungskoeffizient für Isofluran bei 25 °C32 ist.
5. Vorbereitung von Hard- und Software für Mehrkanalaufnahmen
- Richten Sie ein 16-Kanal-Datenerfassungssystem gemäß Herstelleranweisungen ein.
HINWEIS: Mehrere handelsübliche Verstärker und Datenerfassungssysteme können verwendet werden, um Mehrkanalaufnahmen zu sammeln. In den hier beschriebenen Experimenten werden analoge Signale über ein Elektroden-Referenzpanel an zwei Verstärker geliefert, wo sie verstärkt (2000x) und gefiltert (0,1-10kHz) werden. Analoge Eingänge zum Datenerfassungssystem werden mit 40kHz digitalisiert. - Befestigen Sie den entsprechenden 16-Kanal-Headstage-Adapter an einem Mikromanipulator des Mikroskops. Richten Sie den Adapter so aus, dass die Buchsenanschlüsse nach unten zeigen.
- Stellen Sie den Betriebswinkel dieses Mikromanipulators so ein, dass er in einem Winkel von etwa 70° relativ zur Horizontalen nach unten zur Aufnahmekammer ausgerichtet ist.
- Verbinden Sie den Headstage-Eingang mit einer 16 x 1-Sonde für die In-vitro-Elektrophysiologie über den am Mikromanipulator verankerten Headstage-Adapter.
- Schließen Sie den Headstage-Ausgangsanschluss an das Datenerfassungssystem an.
- Installieren Sie geeignete Software zur Datenerfassung. Konfigurieren Sie 15 Eingangskanäle so, dass sie den Eingangssignalen der ersten 15 mehrkanaligen Tastkontakte entsprechen. Konfigurieren Sie den verbleibenden Kanal so, dass er Eingaben von der intrazellulären Elektrode empfängt.
HINWEIS: Achten Sie beim Sammeln und Analysieren von Daten darauf, Elektroden- und Adapterzuordnungen zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass das entsprechende Signal dem Elektrodenkontakt entspricht, von dem es erfasst wurde.
6. Konfiguration von Lichtstimulationsprotokollen
- Richten Sie das Lichtabgabesystem ein und installieren Sie die zugehörige Software.
- Öffnen Sie die Software. Wählen Sie eine Hardware-Verdrahtungskonfiguration, bei der eine Triggerquelle (Digital/TTL Out) das Trigger-In-Signal an das Lichtabgabesystem und das Lichtabgabesystem das Trigger-Out-Signal an eine 470-nm-LED liefert.
- Montieren Sie Hochleistungsobjektiv. Verwenden Sie eine Digitalkamera, kalibrieren Sie das Hochleistungsobjektiv für die Verwendung mit dem Lichtabgabesystem.
- Erstellen Sie eine neue Profilsequenz von Lichtstimulationsprofilen.
- Erstellen Sie ein Muster Ihrer Wahl. In den hier beschriebenen Experimenten wird ein Kreis mit einem Durchmesser von 150 μm verwendet, um eine schichtspezifische Aktivierung von Axonterminals zu ermöglichen.
- Um eine Profilsequenz zu erstellen, kopieren Sie dieses Profil und fügen Sie es für jede beliebige Anzahl von Tests ein.
- Erstellen Sie eine Wellenformliste, die Wellenformen beliebiger Lichtintensität, Pulsdauer oder Pulszahl enthält.
- Weisen Sie jedem Profil nach dem Zufallsprinzip Wellenformen zu. Jedes Profil mit seiner zugewiesenen Wellenform entspricht einem Triggerimpuls von einem digitalen TTL-Eingang oder einem Versuch.
- Speichern Sie die Profilsequenz.
- Erstellen Sie in der Datenerfassungssoftware ein neues Protokoll.
- Stellen Sie die Anzahl der Versuche so ein, dass sie der Anzahl der Profile in der soeben erstellten Profilsequenz entspricht.
- Wählen Sie die Signaleingänge entsprechend den in Schritt 5.6 konfigurierten aus. Konfigurieren Sie ein Protokoll, das einen einzelnen digitalen TTL-Ausgang bereitstellt und von diesen 16 Eingangskanälen für eine angemessene Zeit vor und nach dem digitalen Trigger aufzeichnet.
7. Platzieren einer Mehrkanalsonde in einer ex vivo Hirngewebescheibe
- Perfusion sprudelte eACSF (nicht in versiegelten Beuteln) bei 3-6 ml/min.
- Übertragen Sie die Gehirnscheibe mit dem interessierenden Bereich auf das Netzgitter in der Mikroskopperfusionskammer. Anker mit Platinharfe (siehe ergänzende Abbildung 3).
- Drehen Sie das Netzgitter so, dass die Linie der Elektrodenkontakte am distalen Ende der Mehrkanalsonde annähernd senkrecht zur Pialoberfläche verläuft.
- Senken Sie die Mehrkanalsonde unter Breitfeldbeleuchtung und unter feiner Kontrolle des Mikromanipulators in Richtung der Oberfläche der Scheibe ab.
- Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den geeigneten Filterwürfel für die Visualisierung des fluoreszierenden Reporterproteins zu aktivieren, das in Axonterminals kortikaler Afferenzen exprimiert wird. Drehen Sie ggf. die Scheibe, um die Sonde genauer an der Pialoberfläche auszurichten.
- Positionieren Sie die Sonde knapp über der Ebene der Scheibe, ~200 μm kurz vor der endgültigen Zielposition entlang der x-Achse, wobei mindestens ein Kanal außerhalb der Grenze des aufgezeichneten Gewebebereichs verbleibt
- Führen Sie die Sonde langsam in die Scheibe ein, indem Sie den Manipulator entlang seiner Längsachse bewegen. Um Schäden am Gewebe zu minimieren, bewegen Sie die Sonde nur so weit, dass die scharfen Spitzen gerade noch unter der Gewebeoberfläche sichtbar sind. Dies minimiert die Schädigung des Gewebes und stellt gleichzeitig sicher, dass die Elektrodenkontakte mit dem Gewebe in Kontakt stehen.
8. Patch-Klemmen gezielter Neuronen und Erzielen einer Ganzzellkonfiguration
- Schalten Sie die eACSF-Quelle auf eine verpackte Steuerungslösung um.
- Identifizieren Sie fluoreszierend markierte Zellen für eine gezielte Patch-Clamp-Aufnahme.
- Beschränken Sie die Blendenblende auf den kleinsten Durchmesser. Setzen Sie ein Low-Power-Objektiv ein und bringen Sie das Gewebe in den Fokus.
- Zentrieren Sie das Licht über einen Gewebebereich, der an die Mehrkanalsonde angrenzt (aber nicht überlappt).
- Setzen Sie das Hochleistungs-Wassertauchobjektiv (40x oder 60x) ein und vermeiden Sie vorsichtig den Kontakt zwischen der Mehrkanalsonde und der Objektivlinse.
- Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den entsprechenden Filtersatz zu aktivieren, um die Abbildung von Zellen zu ermöglichen, die Cre-abhängige Fluoreszenzmarker exprimieren.
- Identifizieren Sie eine fluoreszierend markierte Zelle als Ziel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung. Heben Sie die Objektivlinse an, um ausreichend Platz zum Absenken einer Patch-Pipette zu schaffen.
- Legen Sie eine Patchpipette (siehe Tabelle 1) mit interner Lösung (Tabelle 2) ein und montieren Sie die Pipette in den Elektrodenhalter. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um einen positiven Druck anzulegen, der ~ 0,1 ml Luft entspricht.
- Untere Patchpipette in die Lösung. Bringen Sie die Pipettenspitze unter visueller Anleitung in den Fokus.
- Erhalten Sie eine Ganzzellaufzeichnung von der Zielzelle unter Verwendung der zuvor gezeigten Schritte33.
- Wenn Sie Änderungen der intrinsischen Eigenschaften der Zelle (z. B. Eingangswiderstand, Aktionspotentialfeuerrate als Reaktion auf aktuelle Schritte) bewerten möchten, führen Sie diese Aufzeichnungen durch. Andernfalls wechseln Sie zum Axon-Stimulationsprotokoll unten.
9. Schichtspezifische optogenetische Aktivierung von Axonterminals
- Bearbeiten Sie das Sichtfeld in der x-y-Ebene, um das Lichtstimulationsprofil an der gewünschten Position auf der Scheibe auszurichten.
- Laden Sie das Lichtstimulusprotokoll und bereiten Sie das Lichtabgabesystem so vor, dass es einen digitalen TTL-Impuls empfängt.
- Optogenetisch aktivieren Axonterminals und erfassen gleichzeitig extrazelluläre Feldpotentiale und intrazelluläre Membranfluktuationen.
- Schalten Sie die eACSF-Quelle auf Isofluran-Lösung um und waschen Sie das Medikament für 15 Minuten ein. Sammeln Sie ggf. spontane Aufnahmen während des Waschvorgangs.
- Wiederholen Sie Schritt 9.2-9.3.
- Schalten Sie die eACSF-Quelle auf Kontrolllösung um und waschen Sie das Medikament für 20 Minuten aus. Sammeln Sie bei Bedarf spontane Aufnahmen während des Auswaschens.
- Wiederholen Sie Schritt 9.2-9.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine Zeitachse der im Protokoll beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kortikale Inputs, die aus kortikalen Bereichen höherer Ordnung oder aus nicht-primären Thalamuskernen kommen, haben teilweise überlappende terminale Felder in Schicht 1 des nicht-primären visuellen Kortex24. Um unabhängige thalamokortikale oder kortikokkortikale afferente Signalwege zu isolieren, wurde ein viraler Vektor, der ChR2 und einen eYFP-Fluoreszenzreporter enthält, entweder in Po oder Cg injiziert. Zellen innerhalb des Injektionsradius nehmen den viralen Vektor auf und exprimieren nach 2-4 Wochen den unspezifischen Kationenkanal ChR2 und den Reporter sowohl im Soma als auch im projizierenden Axon (Abbildung 2A). Koronale Scheiben wurden gesammelt. Mit dem entsprechenden Filterwürfel wurden Axone abgebildet, die das virale Konstrukt exprimieren (Abbildung 2B). Die Verwendung von ChR2 zur Aktivierung von Axonterminals ermöglicht die Aktivierung von Afferenzen, ohne dass ein angeschlossenes Soma erforderlich ist.
Die in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten Tiere waren SOM-tdTomato- oder PV-tdTomato-Hybridtiere, die das fluoreszierende Reporterprotein tdTomato entweder in Somatostatin- (SOM+) bzw. Parvalbumin-positiven (PV+) Interneuronen exprimieren. SOM+ oder PV+ Interneurone in Schicht 2/3 wurden für die Patch-Klemmung unter visueller Anleitung mit dem entsprechenden Filterwürfel (Layer 1C) anvisiert. Diese Interneurone haben Dendriten in Schicht 1 und sind Ziele kortikokkortikaler Inputs (Abbildung 3A).
Die Zugabe von 125 mL 3,0% Isoflurangas und 175 mL 95% O 2/5% CO2 in einen versiegelten Beutel führte zu einer Gaskonzentration von 1,3% vor dem Gleichgewicht. Gas, das entsprechend seinem Verteilungskoeffizienten in eACSF gelöst wird; die vorhergesagte Gasphasengleichgewichtskonzentration von Isofluran bei Raumtemperatur betrug 0,6% (Abbildung 2D). Dies wurde per Gasmonitor bestätigt.
Die Gewebescheibe wurde in die Aufnahmekammer überführt und die 16x1-Mehrkanal-Aufnahmesonde orthogonal zu den kortikalen Laminen platziert (Abbildung 2E). Ein 150 μm Kreis von 470 nm Licht, zentriert über die kortikale Schicht 1, wurde über den objektiven Lichtpfad abgegeben, während extrazelluläre Feldpotentiale mit der 16 x 1 Mehrkanalsonde gesammelt und gezielte Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Interneuronen durchgeführt wurden. Abbildung 2F zeigt eine schematische Darstellung des Aufzeichnungsaufbaus.
Postsynaptische Potentiale (PSPs) wurden in Interneuronen als Reaktion auf einen Zug von vier 2-ms-Lichtpulsen (10 Hz; Abbildung 3A). Lokale Feldpotentiale wurden ebenfalls erfasst (Abbildung 3B). Stromquellendichte (CSD; Abbildung 3C) und Multi-Unit-Aktivität (MUA; Abbildung 3D) wurden aus lokalen Feldpotentialen extrahiert. Zehn Versuche mit verschiedenen Lichtintensitäten wurden verwendet, um Post-hoc-Analysen durchzuführen. Die Amplitude der aus dem CSD extrahierten Stromsenken nahm in Abhängigkeit von der Lichtintensität zu (Abbildung 4A). Eine nichtlineare logistische Gleichung mit drei Parametern wurde an die Daten für Vergleiche zwischen Pfaden angepasst. Die PSP-Amplitude nahm ebenfalls mit der aktuellen Senkamplitude zu (Abbildung 4B).
Synaptische Reaktionen auf thalamokortikale und kortikokkortikale Inputs wurden während der Kontroll-, Isofluran- (0,28 mM) und Erholungsbedingungen gemessen. Postsynaptische Reaktionen von Somatostatin- (Abbildung 5A) auf kortikokortikale Reize wurden während des Isoflurans unterdrückt, ebenso wie evozierte Stromsenken (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Zeitleiste wichtiger Protokollschritte.
Nach oben: Beschreibt die Zeitleiste der Schritte, die für die Zucht transgener Tiere und die Expression des viralen Vektors erforderlich sind. Unteres: Zeigt Schritte und Zeitleiste für die Vorbereitung von Materialien und die Durchführung von Experimenten am Tag der Scheibenvorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Injektion von viralen Vektoren und Vorbereitung ex vivo koronale Hirnschnitte.
(A) Schematische Darstellung der Injektion eines viralen Vektors in SOM-tdTomato- oder PV-tdTomato-Hybridmäuse. (B) Koronale Schnitte des medialen parietalen Assoziationsbereichs (mPtA) wurden geerntet, und thalamokortikale (oben) oder kortikoktikale (unten) afferente Fasern wurden von ihrem eYFP-Reporter in Schicht 1 identifiziert. Diese Zahl wird mit Genehmigung von24 geändert. (C) Überlagerung von eYFP-markierten Axonterminals in Schicht 1 (grün) und tdTomato-markierten SOM+-Interneuronen (rot) in oberflächlicher Schicht 2/3. (D) Versiegelte Beutel wurden mit einem 50:50-Lösungs-Gas-Gemisch hergestellt. (E) Platzierung einer 16 x 1 Sonde in mPtA (schwarzer Umriss). (F) Schematische Darstellung des Aufnahmeaufbaus in der kortikalen Scheibe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Simultane intrazelluläre und mehrkanalige extrazelluläre Aufzeichnungen in kortikalen Schnitten.
(A) Ganzzell-Stromzangen-Patch-Aufzeichnung aus dem Soma eines Schicht-2/3 PV+-Interneurons. Vier Impulse (je 2 ms, blaue Pfeile) von blauem Licht (2,2 mW) bei 10 Hz wurden an kortikokkortikale Axonterminals in L1 abgegeben. Es werden Mittelwerte (rote Spur) von zehn Versuchen (graue Spuren) gezeigt. (B) Rohdaten von 16 Kanälen der extrazellulären 16 x 1 Sonde. Kanäle im kortikalen Gewebe sind schwarz und diejenigen, die außerhalb des Kortex liegen, grau dargestellt. (C) Ein Stromquellendichtediagramm, extrahiert aus dem lokalen Feldpotentialsignal, zeigt synaptische Stromsenken (blau) in Schicht 1. (D) Multi-Unit-Aktivität, die durch Anwendung eines Hochpassfilters auf das lokale Feldpotentialsignal erzeugt wird, isoliert die Spiking-Aktivität, die in niedrigeren Schichten hervorgerufen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vergleich der Antworten aus Aufzeichnungen in zwei verschiedenen Slices.
Mehrere Lichtintensitäten wurden verwendet, um synaptische Reaktionen in kortikaler Schicht 1 hervorzurufen. Für jede Studie wurde die Spitzenamplitude der evozierten Antwort aus der extrazellulären Stromsenke der Schicht 1 und EPSPs in Schicht 2/3 PV+ Interneuronen extrahiert. (A) Extrazelluläre Antwortprofile von thalamokortikalen und kortikokkortikalen Afferenzen werden als Funktion der Lichtintensität verglichen. (B) Die Beziehung zwischen der aktuellen Senkenamplitude und der EPSP-Amplitude ist pfadabhängig. Innerhalb jedes Stimuluswegs wurden Daten von (A) und (B) gleichzeitig gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Badapplikation von in eACSF gelöstem Isofluran bei gleichzeitigen Aufnahmen.
(A) Intrazelluläre Ganzzellstromklemmenaufzeichnung von Schicht 2/3 SOM+ Interneuron bei Aktivierung kortikoktikaler Afferenzen während Kontroll-, Isofluran- und Waschbedingungen. Vertikale blaue Linien zeigen Lichtreize an (2 ms; 1,65 mW). (B) Stromquellendichtespur, extrahiert aus Elektrode in Schicht 1. Die Daten wurden gleichzeitig mit den in (A) erhobenen erhobenen erhoben. Die Erholung der Reaktionen beim Waschen zeigt eine Depression der synaptischen Reaktionen durch Isofluran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Mikropipette zur Virusinjektion | ||||
| Glas | ID: 0,05 mm, AD: 0,11 mm | |||
| Schlingen | 1 | |||
| Wärme | Ziehen | Vel | Zeit | Druck |
| Rampe + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Mikropipette für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen | ||||
| Glas | ID: 1,1 mm, AD: 1,7 mm | |||
| Schlingen | 4 | |||
| Wärme | Ziehen | Vel | Zeit | Druck |
| Rampe | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tabelle 1: Empfohlenes Glas und Parameter für das Ziehen von Mikropipetten für virale Injektionen und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Glas, das für virale Injektionen und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen verwendet wird, wird beschrieben, ebenso wie die Parameter für das Ziehen von Mikropipetten mit dem Mikropipettenzieher. Weitere Empfehlungen oder die Feinabstimmung der Einstellungen finden Sie in den Bedienungsanleitungen für Mikropipettenzieher.
| Slicing ACSF, sACSF (in mM) | Experiment ACSF, eACSF (in mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| Kcl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| Traubenzucker | 10 | 10 |
| Interne Lösung | ||
| K-Gluconat | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| EGTA | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH-Wert = 7,2 |
Tabelle 2: Zusammensetzung der künstlichen zerebralen Rückenmarksflüssigkeit und der intrazellulären Lösung. Reagenzien und Konzentrationen für sACSF, eACSF und intrazelluläre Pipettenlösung für Patch-Clamp-Aufnahmen sind aufgeführt.
Ergänzende Abbildung 1: Schablone zur Vorbereitung von Gewebeblöcken zum Sammeln von Hirnschnitten. Die Schablone wird auf die entsprechende Größe eingestellt, gedruckt und auf einen Objektträger geklebt. Ein Deckblatt wird über die Schablone geklebt, um ihre Verwendung zu verlängern. Der Gewebeblock wird auf ein Stück Filterpapier mit der sagittalen Ebene nach unten gelegt, auf den rosa Hintergrund ausgerichtet, und ein vertikaler Schnitt wird in der koronalen Ebene entlang der schwarzen Linie gemacht. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Inkubationskammer für geerntete Hirnschnitte. Die Kammer ist mit sACSF gefüllt und über eine gebogene Nadel, die an Schlauch befestigt ist, mit 95% O2/5%CO2-Gasgemisch beblasen. Die Inkubationsplattform besteht aus Nylon, das über eine kreisförmige Kunststoffarmatur gespannt ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Platinstrukturen für Scheiben in der Aufzeichnungskammer. Die Gehirnscheibe wird per Pipette in die Aufnahmekammer übertragen und auf ein Nylonnetz gelegt, das über ein hufeisenförmiges Stück abgeflachten Platindraht gespannt und super geklebt wird. Platinharfe wird über Gehirnscheibe gelegt, um sie während der Aufnahme zu verankern. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Zusatztabelle 1: Ostwald (λ) und Bunsen (α) Koeffizienten für andere flüchtige Anästhetika. Passen Sie dieses Protokoll für die Untersuchung anderer flüchtiger Gasanästhetika wie Halothan, Sevofluran oder Desfluran an. Ersetzen Sie die im Protokoll beschriebenen Gleichungen durch die entsprechenden Koeffizienten, die in dieser Tabelle aufgeführt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Bewertung intra- und extrazellulärer Reaktionen auf selektiv aktivierte afferente Signalwege in ex vivo Hirnschnitten beschrieben.
Die Verwendung optogenetischer Werkzeuge und paralleler Aufzeichnungsschemata ermöglicht es Forschern, Reaktionen lokaler Populationen auf afferente Eingaben aus entfernten Hirnregionen zu untersuchen und gleichzeitig von Zielpopulationen von Interneuronen aufzuzeichnen. Durch den Einsatz optogenetischer Technologie können Axonendungen afferenter Projektionen erhalten und aktiviert werden, obwohl ihre Zellkörper nicht mehr befestigt sind. Dies entlastet geometrische Beschränkungen, die bisher für Ex-vivo-Scheiben galten, da die Erhaltung von elektrischen Verbindungen über große Entfernungen nicht mehr im Vordergrund steht. Dennoch sollte darauf geachtet werden, Scheiben in einer geometrischen Ebene vorzubereiten, die alle verbleibenden Verbindungen von Interesse bewahrt. Zum Beispiel sind Pyramidenzellen vertikal entlang der kortikalen Säule ausgerichtet, und die evozierte Netzwerkaktivität, die von den Mehrkanalsonden in diesen Experimenten gemessen wird, erfordert, dass solche lokalen Verbindungen so weit wie möglich erhalten bleiben. So wurden koronale Schnitte vorbereitet, um die lokale Konnektivität intakt zu halten.
Bei der Auswahl optogenetischer Konstrukte und relevanter fluoreszierender Reporterproteine müssen Eigenschaften ihrer Anregungs-/Emissionsspektren und mikroskopischen Optiken berücksichtigt werden. Eine anhaltende Lichtstimulation kann zu einer teilweisen Inaktivierung vieler Kanalrhodopsinvarianten34 führen, was durch die Wahl von Reporterproteinen vermieden werden kann, deren Anregungsspektren sich nicht mit denen des Opsins überlappen. Alternative Varianten mit unterschiedlicher Kinetik oder Lichtempfindlichkeit können ebenfalls in Abhängigkeit vom experimentellen Paradigma35 gewählt werden, einschließlich Manipulationen unter Verwendung alternativer exzitatorischer oder inhibitorischer Opsine. Filterwürfel müssen auch entsprechend auf die ausgewählten fluoreszierenden Reporter ausgerichtet sein, so dass afferente Axonterminals oder Interneurone unabhängig voneinander und ohne Aktivierung exprimierter Opsine abgebildet werden können. Um die Variabilität der Virusexpression zu berücksichtigen, kann es für Forscher auch relevant sein, jede optogenetisch induzierte Aktivität auf das Expressionsniveau des viralen Konstrukts zu normalisieren, gemessen durch die Fluoreszenzproduktion des Reporterproteins.
Auch die Abgabe von vorberechneten Konzentrationen flüchtiger Anästhetika in Gewebescheiben ist mit den hier beschriebenen Methoden möglich. Bei der Auswahl geeigneter physiologisch relevanter Gasgleichgewichtsprozentsätze sollten die Forscher einen Verlust von 10-15% an gelöstem Isoflurangas zwischen der Perfusionslinie und dem Gewebe36 berücksichtigen. Die auf Isofluran anwendbaren Methoden wurden vorgestellt, aber andere Arzneimittel wie Halothan, Sevofluran oder Desfluran können mit den entsprechenden Ostwald- und Bunsen-Koeffizienten ähnlich behandelt werden (Zusatztabelle 1). Die Trenneigenschaften flüchtiger Anästhetika stellen sicher, dass sie sich vorhersehbar in ACSF auflösen. Da jedoch Partialdrücke empfindlicher auf Temperaturänderungen reagieren als wässrige EC50-Konzentrationen 37, müssen Gasgleichgewichtsvolumenprozentsätze flüchtiger Anästhetika in vorhergesagte Millimolarkonzentrationen bei Raumtemperatur umgerechnet werden, um die beobachteten Effekte mit physiologisch relevanten Dosen in vivo zu vergleichen. Wenn sie sich für die Untersuchung intravenöser Anästhetika wie Etomidate oder Propofol in Hirnschnitten entscheiden, müssen die Forscher Diffusionsprofile der untersuchten Arzneimittel berücksichtigen, da Gleichgewichtszeiten und physiologisch relevante Konzentrationen stark variieren können30.
In diesem Manuskript wird ein Protokoll beschrieben, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf verschiedene Komponenten von thalamokortikalen Schaltkreisen in ex vivo Gehirnschnitten zu testen. Viele der Variablen und Parameter in den beschriebenen Methoden können für weitere Untersuchungen manipuliert werden. Zum Beispiel können verschiedene Gehirnareale, afferente Signalwege, Zellziele oder flüchtige Anästhetika untersucht werden, indem die skizzierten Methoden angepasst werden, um neue Fragen zu beantworten. In Kombination mit anderen theoretischen und experimentellen Methoden wird die Untersuchung einzigartiger Zell- und Netzwerkkomponenten mit Ex-vivo-Gehirnschnitten unser Verständnis des dynamischen Gehirns und der Veränderungen, die es während pharmakologischer und pathophysiologischer Bewusstseinsveränderungen erfährt, verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bryan Krause für die technische Unterstützung und Anleitung zu diesem Projekt.
Diese Arbeit wurde von der International Anesthesia Research Society (IMRA bis AR), den National Institutes of Health (R01 GM109086 bis MIB) und der Abteilung für Anästhesiologie, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison, WI, USA, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C.
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K.
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G.
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
