Summary
Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.
Abstract
Anesthetica beïnvloeden het bewustzijn deels via hun acties op thalamocorticale circuits. De mate waarin vluchtige anesthetica verschillende cellulaire en netwerkcomponenten van deze circuits beïnvloeden, blijft echter onduidelijk. Ex vivo hersensegmenten bieden een middel waarmee onderzoekers discrete componenten van complexe netwerken kunnen onderzoeken en potentiële mechanismen kunnen ontwarren die ten grondslag liggen aan de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties. Om potentiële celtype- en pathway-specifieke medicijneffecten in hersensegmenten te isoleren, moeten onderzoekers in staat zijn om onafhankelijk afferente vezelroutes te activeren, niet-overlappende populaties van cellen te identificeren en vluchtige anesthetica toe te passen op het weefsel in een waterige oplossing. In dit protocol worden methoden beschreven om optogenetisch opgewekte reacties op twee onafhankelijke afferente paden naar neocortex in ex vivo hersenplakken te meten. Extracellulaire responsen worden geregistreerd op assay-netwerkactiviteit en gerichte whole-cell patch clamp-opnames worden uitgevoerd in somatostatine- en parvalbumine-positieve interneuronen. Levering van fysiologisch relevante concentraties isofluraan via kunstmatige cerebrale spinale vloeistof om cellulaire en netwerkresponsen te moduleren wordt beschreven.
Introduction
Vluchtige anesthetica worden al meer dan een eeuw alomtegenwoordig gebruikt in verschillende klinische en academische omgevingen. Verschillende klassen van anesthetica hebben unieke, vaak niet-overlappende moleculaire doelwitten 1,2,3, maar bijna allemaal produceren ze bewusteloosheid. Hoewel hun gedragseffecten vrij voorspelbaar zijn, zijn de mechanismen waarmee anesthetica bewustzijnsverlies veroorzaken grotendeels onbekend. Anesthetica kunnen uiteindelijk zowel het niveau als de inhoud van het bewustzijn beïnvloeden via acties op corticothalamische circuits, waardoor de integratie van informatie in de corticale hiërarchie wordt verstoord 4,5,6,7,8,9. Meer in het algemeen kan modulatie van corticothalamische circuits een rol spelen bij experimenteel10 of farmacologisch11 veranderde bewustzijnstoestanden, en kan ook betrokken zijn bij slaap12 en bij pathofysiologische bewustzijnsstoornissen13,14.
De ongrijpbaarheid van de mechanismen die ten grondslag liggen aan verlies en terugkeer van bewustzijn tijdens anesthesie kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan niet-lineaire, synergetische acties van anesthetica op cellulair, netwerk- en systeemniveau15. Isofluraan onderdrukt bijvoorbeeld de activiteit in de geselecteerde hersengebieden 16,17,18, schaadt de connectiviteit tussen verre hersengebieden 19,20,21,22,23 en vermindert synaptische reacties op een pathway-specifieke manier 24,25 . Welke effecten van anesthetica, van moleculair tot systeemniveau, noodzakelijk of voldoende zijn om bewustzijnsverlies te bewerkstelligen, blijft onduidelijk. Naast inhoudelijke klinische onderzoeken van bewustzijn met behulp van niet-invasieve technieken 19,20,26, is het belangrijk dat experimentalisten proberen de verschillende cellulaire en netwerkinteracties te ontwarren die de bewuste ervaring dienen.
Door de complexe interacties in de intacte hersenen te vereenvoudigen, maken ex vivo hersensegmenten de studie van geïsoleerde componenten van de dynamische systemen van de hersenen mogelijk9. Een gereduceerde plakbereiding combineert de voordelen van relatief intacte anatomische structuren van lokale neurale circuits met de veelzijdigheid van in vitro manipulaties. Tot voor kort hebben methodologische beperkingen echter de studie van synaptische en circuiteigenschappen van langeafstandsinputs in hersensegmenten27,28 uitgesloten; het kronkelige pad van corticothalamische vezelkanalen maakte activering van onafhankelijke afferente paden vrijwel onmogelijk door elektrische stimulatie.
Het onderzoeken van de effecten van anesthetica op de hersenschijfpreparaten brengt extra uitdagingen met zich mee. Bij afwezigheid van een intacte ademhalings- en bloedsomloop moeten anesthetica worden aangebracht en moeten concentraties zorgvuldig worden afgestemd op de geschatte concentraties op de effectplaats. Voor veel intraveneuze anesthetica maakt de langzame snelheid van equilibratie in het weefsel traditionele farmacologische onderzoeken bewerkelijk29,30. Het onderzoeken van de effecten van vluchtige gasanesthetica in ex vivo preparaten is beter handelbaar, maar brengt ook uitdagingen met zich mee. Deze omvatten het omzetten van geïnhaleerde partiële drukdoses naar waterige concentraties en de noodzaak van een aangepast afgiftesysteem van het geneesmiddel aan het weefsel via kunstmatige cerebrale spinale vloeistof31.
Hier worden methoden beschreven waarmee onderzoekers kunnen profiteren van de goed gedocumenteerde fysisch-chemische eigenschappen van het vluchtige anestheticum isofluraan voor medicijnafgifte aan ex vivo hersenplakken, pathway- en laagspecifieke inputs activeren naar een corticale interessegebied met een hoge spatiotemporale resolutie, en gelijktijdige laminaire opnames en gerichte patchklemopnamen van geselecteerde populaties van neuronen kunnen uitvoeren. Gecombineerd stellen deze procedures onderzoekers in staat om vluchtige anestheticum-geïnduceerde veranderingen in verschillende waarneembare elektrofysiologische responseigenschappen te meten, van synaptisch tot lokaal netwerkniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met dieren die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health Animal Care and Use Committee.
1. Muizen fokken om fluorescerend reportereiwit tot expressie te brengen in interneuronsubpopulaties
- Koppel homozyogische, Cre-afhankelijke tdTomato mannelijke muis met homozygote SOM-Cre vrouwelijke of homozygote PV-Cre vrouwelijke muis.
OPMERKING: Andere specifieke neuronale populaties kunnen worden getarget met behulp van de juiste Cre-lijnen. - Laat heterozygote nakomelingen rijpen tot ten minste 3 weken oud voordat u verder gaat. Voor experimenten die hier worden beschreven, is genotypering niet nodig, omdat homozygote ouders nakomelingen produceren die allemaal heterozygoot zijn voor zowel celtypespecifieke Cre-recombinase als Cre-afhankelijke reporter-allelen.
2. Het uitvoeren van unilaterale stereotaxische injectie van virale construct
- Pas de instellingen van de micropipettetrekker voor injectiepipetten aan zoals aangegeven in de gebruikershandleiding van het instrument (zie tabel 1 voor aanbevolen instellingen). Trek aan de glazen micropipette.
- Breek de punt van het scherpe uiteinde van de pipet zodanig dat de tipdiameter ongeveer 30 μm is met minimale taps toelopen over enkele millimeters.
- Bepaal met behulp van eerder gedocumenteerde procedures de juiste titer en het juiste volume van het virus dat moet worden geïnjecteerd. In de hier beschreven experimenten leverde 1,0 μL (titer: 3,1-5,7 TU/ml) eenzijdig geïnjecteerde resultaten op.
- Vul het volledige volume van de pipet op met minerale olie. Laad de pipet op de microsyringe en laat een kleine hoeveelheid minerale olie door de punt stromen om ervoor te zorgen dat de punt niet verstopt raakt.
- Voorvulling ten minste 1,0 μL virale construct. De recombinante adeno-geassocieerde virale vector die in deze experimenten werd gebruikt, was AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Schik steriele drape in een chirurgische ruimte. Steriliseer hulpmiddelen voor stereotaxische procedure en plaats het op het gordijn.
- Verdoof SOM-tdTomato of PV-tdTomato heterozygoot dier met isofluraan (3% voor inductie, 1,5-2% voor onderhoud) en zuurstofmengsel. Bevestig periodiek het chirurgische niveau van anesthesie met teenknijpen tijdens de operatie. Zorg ervoor dat het dier niet verder gaat dan het chirurgische plan van anesthesie door de ademhaling elke 10-15 minuten te controleren.
- Scheer de bovenkant van het hoofd van het dier. Breng 70% isopropylalcohol en op jodium gebaseerde oplossing royaal aan op het chirurgische gebied en oogzalf op oogkassen om uitdroging van het membraan te voorkomen. Dien bupivacaïne/lidocaïne (verhouding 1:1, 1,0 mg/kg) subcutaan toe aan de operatieplaats voor lokale verdoving.
- Plaats het dier in stereotaxisch frame.
- Gebruik scalpel om incisie te maken langs de sagittale as van de huid boven het dorsale oppervlak van de schedel. Trek de huid in met behulp van een tang. Hydrateer de schedel met 0,9% zoutoplossing indien nodig.
- Markeer op het oppervlak van de schedel lichtjes het snijpunt van voorste en laterale coördinaten met een kruis in potlood. Boor een gat op de juiste coördinaten in het dwarsvlak (in mm ten opzichte van Bregma, voor cingulate cortex (Cg) injectie: anterieur 0,2, lateraal 0,3; voor posterieure thalamus (Po) injectie: posterieur 2,25, laterale 3,4).
OPMERKING: Markeringen moeten verder reiken dan de grenzen van het braamgat om richtlijnen te bieden voor een nauwkeurige plaatsing van de pipet. - Zet de luchttafel aan en balanceer deze in balans.
- Herpositioneer de elektrodemanipulator van het stereotaxische frame op 0° voor injecties in Cg, of 45° in het coronale vlak voor injecties in Po.
- Bevestig de spuitpomp aan de elektrodemanipulator. Bevestig de microsyringe pompregelaar aan de spuitpomp.
- Navigeer door de pipetpunt in de buurt van (maar raak niet aan) het oppervlak van de hersenen, op het snijpunt van markeringen die zijn gemaakt in stap 2.11. Plaats de pipet met ongeveer 1 mm/s langs de lengteas in de hersenen, hetzij 0,9 mm (injectie in Cg) of 3,1 mm (injectie in Po). Wacht 10 minuten voordat u verder gaat.
- Injecteer 1,0 μL virale construct gedurende een periode van 10 min (100 nL/min). Als welling van het virus van de pipetinbrengplaats wordt waargenomen, vertraagt u de injectiesnelheid tot 50 nL / min.
- Wacht na de injectie 10 minuten voordat u de injectiepipet langzaam intrekt.
- Hecht om de hoofdhuidincisie te sluiten en 2-5 mg / kg meloxicam subcutaan toe te dienen.
- Stop met isofluraan en controleer het dier tijdens het verschijnen uit de anesthesie. Laat herstellen volgens de procedures die zijn beschreven door het Animal Care and Use Committee van de instelling, inclusief verdere toediening van pijnstillers.
3. Bereiding van acute hersenplakken
- Wacht ten minste 3 weken voor de expressie van virale constructie voordat u weefsel oogst.
- Bereid 1 L kunstmatig hersenvocht voor de snijprocedure (snijden van kunstmatige cerebrale spinale vloeistof, sACSF). Zie tabel 2 voor ingrediënten.
- Voer sACSF tijdens de snijprocedure aan met een opgelost 95% O2/5% CO2-mengsel , afgegeven via een gasdispersiebuis.
- Bereid een ijskoud bad voor op trillende blade microtoom. Monteer ijskoud monsterstadium op microtoom en bevestig het saffierblad op zijn plaats voor weefselsectie.
- Verdoof de muis met 3% isofluraan en zuurstof tot verlies van de rechtzettingsreflex.
- Onthoofd de muis met guillotine en dompel de kop onmiddellijk onder in 4°C sACSF. Om de gezondheid van het weefsel te behouden, voltooit u de volgende stappen zo snel mogelijk.
- Open schedelholte door een kleine incisie aan de basis van de schedel te maken en elke schedelplaat voorzichtig te verwijderen. Verwijder voorzichtig de onderliggende dura mater.
- Terwijl de hersenen zich nog in de schedelholte bevinden, gebruikt u het scheermesje om het cerebellum te verwijderen. Maak een tweede verticale snede langs het sagittale vlak in de linkerhersenhelft, net lateraal naar de middellijn.
- Bereid weefselblok voor op secties.
- Til de hersenen voorzichtig op uit de schedelholte. Plaats de hersenen op het filterpapier met het platte, sagittale vlak naar beneden. Leid het filterpapier over de blokkerende sjabloon en lijn de hersenen uit op het onderliggende sjabloonoverzicht (aanvullende figuur 1).
- Maak twee parallelle sneden in het coronale vlak zoals aangegeven door de lijnen op de sjabloon. Voeg indien nodig een kleine druppel sACSF toe om filterpapier nat te houden.
- Plaats het weefselblok kort in 4°C sACSF terwijl stap 3.8.4 wordt uitgevoerd.
- Breng een kleine hoeveelheid superlijm aan op het ijskoude monsterstadium.
- Til het weefselblok op van koude sACSF. Gebruik de hoek van een absorberende handdoek om overtollige sACSF af te voeren. Lijm het achterste coronale vlak van het weefselblok op het specimenstadium, met het dorsale oppervlak van de hersenen naar het saffierblad gericht.
- Verzamel 500 μm dikke coronale hersenplakken. Plaats de plakjes van belang op nylon gaas (aanvullende figuur 2) in 34 °C sACSF en laat de container op kamertemperatuur komen.
OPMERKING: Voor experimenten die hier worden beschreven, werden elektrofysiologische opnames verzameld van een coronale sectie gecentreerd op ongeveer 2,25 mm posterieur tot bregma om een niet-primair sensorisch gebied, mediale secundaire visuele cortex (V2MM) te bestuderen.
4. Bereiding van experimentele zakken voor kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (eACSF) die opgelost vluchtig anestheticum isofluraan bevatten
- Bereid 300 ml van een voorraadmengsel van 3,0% isofluraan.
- Voeg in een afgesloten polytetrafluorethyleengaszak ~ 100 ml 95% O2/5% CO 2-gasmengsel toe aan 20-30 ml vloeibaar isofluraan en een kleine hoeveelheid 0,9% zoutoplossing. Wacht ten minste 30 minuten om evenwicht tussen isofluraan tussen vloeistof- en gasfasen mogelijk te maken.
- Bepaal de hoeveelheid verzadigd isofluraangas, Vsat, toe te voegen aan de voorraadzak met behulp van de volgende vergelijking:
waarbij P%-voorraad de doelsamenstelling van het voorraadgas is (3% in dit geval),V-voorraad het eindvolume van de voorraadgaszak is,P-isofluraan de partiële druk van isofluraan bij kamertemperatuur (~ 240 mmHg) enP-totaal de atmosferische druk (~ 760 mmHg). - Voeg de berekende hoeveelheid verzadigd gas toe aan een lege gaszak en vul de zak met een volume van 95% O2/5% CO2-gasmengsel om het totale volume voorraadzak op 300 ml te brengen.
- Bereid 2 L kunstmatig hersenvocht voor perfusie van het plakje tijdens het experiment (experimentele ACSF, eACSF). Zie tabel 2 voor ingrediënten. Los 95% O2/5% CO2 gasmengsel op in oplossing.
- Bereid twee afzonderlijke zakken met Control- en Isofluraan-oplossingen.
- Voeg aan een lege polytetrafluorethyleengaszak 600 ml eACSF en 600 ml 95% O2/5% CO2-gasmengsel toe. Label deze zak als Control.
- Voeg aan een andere lege polytetrafluorethyleengaszak 300 ml eACSF toe. Label deze zak als Isofluraan.
- Kies een fysiologisch relevante gebalanceerde gasfaseconcentratie van isofluraan. Experimenten werden uitgevoerd met gasconcentraties gelijk aan 1,3% isofluraan. Muizen verliezen de rechtzettingsreflex, en vermoedelijk het bewustzijn, bij 0,9% geïnhaleerd isofluraan.
- Gebruik de volgende vergelijking om de equivalente gasfaseconcentratie bij kamertemperatuur te berekenen, P%(T-ruimte)31:
waarbij P%(T-lichaam) de fysiologisch relevante gasfaseconcentratie is die in stap 4.3.3 is gekozen, deT-ruimte 25 °C en hetT-lichaam 37 °C. - Gebruik de volgende vergelijking om het volume gas uit de voorraadgaszak,V-voorraad, te bepalen om toe te voegen aan de Isofluraanoplossing.
waarbijV-oplossing het volume eACSF in ISOFLURAANZAK (300 ml) is, P% (T-ruimte) wordt ingevoerd uit vergelijking (2), λ de zout/gas Ostwald-verdelingscoëfficiënt van isofluraan (λ = 1,232) en P%-voorraad de gasfaseconcentratie van de voorraadgaszak is (P%voorraad = 3,0%). - Voeg aan de isofluraanoplossingszak het volume gas uit de voorraadgaszak,V-voorraad, berekend in stap 4.3.5 toe.
- Voeg aan de isofluraanoplossingszak een volume van 95% O2/5% CO2-gasmengsel toe om het totale volume gas in de isofluraanoplossingszak op 300 ml te brengen.
- Schud zowel control- als isofluraanzakjes gedurende ten minste 1 uur op de shaker om isofluraanfase-equilibratie mogelijk te maken.
- Nadat alle gegevens zijn verzameld, kan de juiste concentratie worden geverifieerd met behulp van een anesthetische gasmonitor om de equilibrated gasconcentratie van isofluraan boven de resterende oplossing in zak te meten.
- Rapporteer experimentele concentraties van vluchtige gassen in waterige eenheden, omdat millimolaire concentraties robuuster zijn voor temperatuurveranderingen. Gebruik de volgende vergelijking om de gasfaseconcentratie bij kamertemperatuur, P%(T-ruimte), om te zetten in een equivalente waterige concentratie (Cwaterig, in mM)31:
waarbij α de bunsenverdelingscoëfficiënt zout/gas voor isofluraan bij 25°C32 is.
5. Voorbereiding van hardware en software voor meerkanaalsopnamen
- Stel een 16-kanaals data-acquisitiesysteem in volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Verschillende in de handel verkrijgbare versterkers en data-acquisitiesystemen kunnen worden gebruikt om meerkanaalsopnamen te verzamelen. In de hier beschreven experimenten worden analoge signalen via een elektrodereferentiepaneel aan twee versterkers geleverd, waar ze worden versterkt (2000x) en gefilterd (0,1-10kHz). Analoge ingangen naar het data-acquisitiesysteem worden gedigitaliseerd op 40kHz. - Bevestig de juiste 16-kanaals hoofdstage-adapter aan een microscoopmicromanipulator. Richt de adapter zo dat de vrouwelijke connectorpoorten naar beneden zijn gericht.
- Pas de werkingshoek van deze micromanipulator zodanig aan dat deze naar beneden is gericht op de opnamekamer, onder een hoek van ongeveer 70° ten opzichte van horizontaal.
- Sluit de headstage-ingang aan op een 16 x 1 sonde voor in vitro elektrofysiologie via de headstage-adapter die aan de micromanipulator is verankerd.
- Sluit de headstage-uitgang aan op het data-acquisitiesysteem.
- Installeer de juiste software voor gegevensverzameling. Configureer 15 ingangskanalen om overeen te komen met ingangssignalen van de eerste 15 meerkanaals sondecontacten. Configureer het resterende kanaal om input van de intracellulaire elektrode te ontvangen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u elektrode- en adapterkaarten in overweging neemt bij het verzamelen en analyseren van gegevens, om ervoor te zorgen dat het juiste signaal overeenkomt met het elektrodecontact waaruit het is verzameld.
6. Configuratie van lichtstimulatieprotocollen
- Stel een lichtafgiftesysteem in en installeer de bijbehorende software.
- Open de software. Kies hardwarebedradingsconfiguratie waarbij een Trigger Source (Digital/TTL Out) trigger in-signaal levert aan het lichtafgiftesysteem en het lichtleveringssysteem trigger-out-signaal levert aan een 470 nm LED.
- Mount high-power objectief lens. Kalibreer met behulp van een digitale camera het krachtige objectief voor gebruik met een lichtafgiftesysteem.
- Maak een nieuwe profielvolgorde van lichtstimulatieprofielen.
- Maak een patroon naar keuze. In de hier beschreven experimenten wordt een cirkel met een diameter van 150 μm gebruikt om laagspecifieke activering van axonterminals mogelijk te maken.
- Als u een profielreeks wilt samenstellen, kopieert en plakt u dit profiel voor elk van een willekeurig aantal onderzoeken.
- Maak een golfvormlijst met golfvormen van elke lichtintensiteit, pulsduur of pulsgetal.
- Wijs willekeurig golfvormen toe aan elk profiel. Elk profiel met de toegewezen golfvorm komt overeen met één triggerpuls van een digitale TTL-ingang of één proef.
- Sla de profielreeks op.
- Maak in de software voor gegevensverzameling een nieuw protocol.
- Stel het aantal proefversies in op het aantal profielen in de zojuist gemaakte profielreeks.
- Kies signaalingangen die overeenkomen met de ingangen die zijn geconfigureerd in stap 5.6. Configureer een protocol dat een enkele digitale TTL-uitgang biedt, waarbij gedurende een geschikte tijd voor en na de digitale trigger wordt opgenomen vanuit deze 16 ingangskanalen.
7. Het plaatsen van een meerkanaalssonde in ex vivo hersenweefselschijf
- Perfuseer bubbeld eACSF (niet in verzegelde zakken) op 3-6 ml / min.
- Breng het hersenschijfje met het interessegebied over op het mesh-raster in de microscoopperfusiekamer. Anker met platina harp (zie aanvullende figuur 3).
- Draai het mesh-raster zodanig dat de lijn van elektrodecontacten aan het distale uiteinde van de meerkanaalsonde ongeveer loodrecht op het piale oppervlak staat.
- Laat onder broadfield-verlichting en onder fijne controle van de micromanipulator de meerkanaalsonde naar het oppervlak van de plak zakken.
- Draai de filterkubuskoepel om de juiste filterkubus in te schakelen voor visualisatie van het fluorescerende reportereiwit uitgedrukt in axonterminals van corticale afferente stoffen. Draai indien nodig de plak om de sonde nauwkeuriger uit te lijnen met het pialoppervlak.
- Plaats de sonde net boven het vlak van de plak, ~ 200 μm kort van de uiteindelijke doelpositie langs de x-as, waardoor ten minste één kanaal buiten de grens van het weefselgebied dat wordt geregistreerd
- Steek de sonde langzaam in het segment door de manipulator langs de lengteas te bewegen. Om schade aan het weefsel te minimaliseren, moet u de sonde alleen zo ver naar voren brengen dat de scherpe uiteinden net zichtbaar zijn onder het weefseloppervlak. Dit minimaliseert schade aan het weefsel en zorgt er tegelijkertijd voor dat de elektrodecontacten in contact komen met het weefsel.
8. Patch clamping gerichte neuronen en het verkrijgen van hele-cel configuratie
- Schakel de eACSF-bron over naar de besturingsoplossing in zakken.
- Identificeer fluorescerend gelabelde cel voor gerichte patchklemopname.
- Beperk het diafragma irismembraan tot de kleinste diameter. Schakel een objectieflens met een laag vermogen in en breng het weefsel in beeld.
- Centreer het licht over een gebied van weefsel dat grenst aan (maar niet overlapt) de meerkanaals sonde.
- Schakel het krachtige (40x of 60x) waterdompelingsobjectief in en wees voorzichtig om contact tussen de meerkanaals sonde en de objectieflens te vermijden.
- Draai de filterkubuskoepel om de juiste filterset in te schakelen om beeldvorming mogelijk te maken van cellen die Cre-afhankelijke fluorescerende marker tot expressie brengen.
- Identificeer een fluorescerend gelabelde cel als een doelwit voor patchklemregistratie. Verhoog de objectieflens om voldoende ruimte te creëren om een patchpipet te laten zakken.
- Laad een patchpipet (zie tabel 1) met interne oplossing (tabel 2) en monteer de pipet in de elektrodehouder. Gebruik een spuit van 1 ml om overdruk uit te oefenen die overeenkomt met ~ 0,1 ml lucht.
- Pipet van de onderste patch in de oplossing. Breng de pipetpunt onder visuele begeleiding in beeld.
- Verkrijg volledige celopname van de beoogde cel met behulp van de eerder gedemonstreerde stappen33.
- Als u van plan bent om veranderingen in de intrinsieke eigenschappen van de cel te beoordelen (bijv. Ingangsweerstand, actiepotentiaal vuursnelheid in reactie op de huidige stappen), voer deze opnames uit. Ga anders naar het axonstimulatieprotocol hieronder.
9. Laagspecifieke optogenetische activering van axonklemmen
- Manipuleer het gezichtsveld in het x-y-vlak om het lichtstimulatieprofiel uit te lijnen met de gewenste locatie op het segment.
- Laad lichtstimuleringsprotocol en bereid het lichtafgiftesysteem voor op het ontvangen van een digitale TTL-puls.
- Activeer axonterminals op optogenetisch en registreer tegelijkertijd extracellulaire veldpotentialen en intracellulaire membraanfluctuaties.
- Schakel de eACSF-bron over naar isofluraanoplossing en was het medicijn gedurende 15 minuten in. Verzamel indien nodig spontane opnames tijdens de wash-in.
- Herhaal stap 9.2-9.3.
- Schakel de eACSF-bron over naar de besturingsoplossing en was het medicijn gedurende 20 minuten uit. Verzamel indien nodig spontane opnames tijdens het uitwassen.
- Herhaal stap 9.2-9.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een tijdlijn van stappen die in het protocol worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1. Corticale inputs afkomstig van corticale gebieden van hogere orde of van niet-primaire thalamische kernen hebben gedeeltelijk overlappende terminale velden in laag 1 van niet-primaire visuele cortex24. Om onafhankelijke thalamocorticale of corticocorticale afferente routes te isoleren, werd een virale vector met ChR2 en een eYFP fluorescerende reporter geïnjecteerd in Po of Cg. Cellen binnen de injectieradius nemen de virale vector op en drukken na 2-4 weken het niet-specifieke kationkanaal ChR2 en de reporter uit in zowel de soma- als de projecterende axonen (figuur 2A). Coronale plakjes werden verzameld. Met de juiste filterkubus ingeschakeld, werden axonen die het virale construct uitdrukken in beeld gebracht (figuur 2B). Het gebruik van ChR2 om axonklemmen te activeren maakt activering van afferente stoffen mogelijk zonder de vereiste voor een bijgevoegde soma.
De dieren die in de hier beschreven experimenten werden gebruikt, waren SOM-tdTomato- of PV-tdTomato-hybride dieren, die het fluorescerende reportereiwit tdTomato tot expressie brengen in respectievelijk somatostatine- (SOM +) of parvalbumine-positieve (PV +) interneuronen. SOM+ of PV+ interneuronen in laag 2/3 werden gericht voor patchklemmen onder visuele begeleiding met de juiste filterkubus ingeschakeld (Layer 1C). Deze interneuronen hebben dendrieten in laag 1 en zijn doelwitten van corticocorticale inputs (figuur 3A).
Toevoeging van 125 ml 3,0% isofluraangas en 175 ml 95% O2/5% CO2 aan een afgesloten zak resulteerde in een pre-evenwichtsconcentratie van gas van 1,3%. Gas opgelost in eACSF volgens de verdelingscoëfficiënt; de voorspelde gasfase-evenwichtsconcentratie van isofluraan bij kamertemperatuur was 0,6% (figuur 2D). Dit werd bevestigd via een gasmonitor.
Het weefselsegment werd overgebracht naar de opnamekamer en de 16x1 meerkanaals opnamesonde werd orthogonaal op de corticale laminae geplaatst (figuur 2E). Een cirkel van 150 μm van 470 nm licht gecentreerd over corticale laag 1 werd geleverd via het objectieve lichtpad, terwijl extracellulaire veldpotentialen werden verzameld met behulp van de 16 x 1 meerkanaals sonde en gerichte hele cel patchklemopnamen werden uitgevoerd in interneuronen. Een schema van de opnameopstelling is weergegeven in figuur 2F.
Post-synaptische potentialen (PSP's) werden waargenomen in interneuronen als reactie op een trein van vier 2 ms lichtpulsen (10 Hz; Figuur 3A). Lokale veldpotentialen werden ook geregistreerd (figuur 3B). Huidige brondichtheid (CSD; Figuur 3C) en activiteit met meerdere eenheden (MUA; Figuur 3D) werden gewonnen uit lokale veldpotentialen. Tien studies met verschillende lichtintensiteiten werden gebruikt om post hoc analyses uit te voeren. De amplitude van stroomputten die uit de CSD worden geëxtraheerd, nam toe als functie van de lichtintensiteit (figuur 4A). Een niet-lineaire logistieke vergelijking met drie parameters was geschikt voor de gegevens voor vergelijkingen tussen paden. Psp-amplitude nam ook toe met de huidige sink amplitude (figuur 4B).
Synaptische responsen op thalamocorticale en corticocorticale inputs werden gemeten tijdens de controle, isofluraan (0,28 mM) en herstelomstandigheden. Post-synaptische responsen van somatostatine- (figuur 5A) op corticocorticale stimuli werden onderdrukt tijdens isofluraan, evenals opgeroepen stroomputten (figuur 5B).
Figuur 1: Een schematische schets van de tijdlijn van belangrijke stappen in het protocol.
Boven: Beschrijft de tijdlijn van stappen die nodig zijn voor het fokken van transgene dieren en de expressie van virale vector. Bodem: Toont stappen en tijdlijn voor het voorbereiden van materialen en het uitvoeren van experimenten op de dag van plakvoorbereiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Injectie van virale vector en voorbereiding ex vivo coronale hersenplakken.
(A) Schematische weergave van injectie van virale vector in SOM-tdTomato of PV-tdTomato hybride muizen. (B) Coronale plakjes van het mediale pariëtale associatiegebied (mPtA) werden geoogst en thalamocorticale (boven) of corticocorticale (onderste) afferente vezels werden geïdentificeerd door hun eYFP-verslaggever in laag 1. Dit cijfer is met toestemming gewijzigd van24. (C) Overlay van eYFP-gelabelde axonterminals in laag 1 (groen) en tdTomato-gelabelde SOM+ interneuronen (rood) in oppervlakkige laag 2/3. (D) Verzegelde zakken werden bereid met een 50:50 oplossing-op-gasmengsel. (E) Plaatsing van een 16 x 1 sonde in mPtA (zwarte omtrek). (F) Schematische weergave van de opnameopstelling in het corticale segment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gelijktijdige intracellulaire en meerkanaals extracellulaire opnames in corticale plak.
(A) Whole-cell current clamp patch opname van de soma van een laag 2/3 PV+ interneuron. Vier pulsen (elk 2 ms, blauwe pijlen) van blauw licht (2,2 mW) bij 10 Hz werden afgeleverd aan corticocorticale axonterminals in L1. Gemiddeld (rood spoor) van tien proeven (grijze sporen) worden getoond. (B) Ruwe gegevens van 16 kanalen van extracellulaire 16 x 1 sonde. Kanalen die in corticale weefsel zijn geplaatst, worden in het zwart weergegeven en die buiten de cortex in grijs. (C) Een stroombrondichtheidsdiagram, geëxtraheerd uit het lokale veldpotentiaalsignaal, toont synaptische stroomputten (blauw) in laag 1. (D) Activiteit van meerdere eenheden, gegenereerd door het toepassen van een hoogdoorlaatfilter op het lokale veldpotentiaalsignaal, isoleert spikingactiviteit die in lagere lagen wordt opgeroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van reacties van opnames in twee verschillende segmenten.
Meerdere lichtintensiteiten werden gebruikt om synaptische reacties op te roepen in corticale laag 1. Voor elke studie werd de piekamplitude van de opgeroepen respons geëxtraheerd uit de laag 1 extracellulaire stroomput en EPSP's in laag 2/3 PV+ interneuronen. (A) Extracellulaire responsprofielen van thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen worden vergeleken als functie van de lichtintensiteit. (B) De relatie tussen de huidige sinkamplitude en epsp-amplitude is routeafhankelijk. Binnen elk stimulustraject werden gelijktijdig gegevens van (A) en (B) verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Badtoepassing van isofluraan opgelost in eACSF tijdens gelijktijdige opnames.
(A) Intracellulaire stroomklemregistratie van de hele cel vanaf laag 2/3 SOM+ interneuron bij activering van corticocorticale afferente stoffen tijdens controle, isofluraan en wasomstandigheden. Verticale blauwe lijnen geven lichtprikkels aan (2 ms; 1,65 mW). (B) Stroombrondichtheidsspoor geëxtraheerd uit elektrode in laag 1. De gegevens werden gelijktijdig verzameld met de gegevens die in (A) werden verzameld. Herstel van reacties na was toont depressie van synaptische responsen door isofluraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Micropipette voor virusinjectie | ||||
| Glas | ID: 0,05 mm, OD: 0,11 mm | |||
| Loops | 1 | |||
| Hitte | Trekken | Vel | Tijd | Druk |
| Oprit + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Micropipette voor hele cel patchklemopnamen | ||||
| Glas | ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm | |||
| Loops | 4 | |||
| Hitte | Trekken | Vel | Tijd | Druk |
| Helling | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tabel 1: Aanbevolen glas en parameters voor het trekken van micropipettes voor virale injecties en opnames van de hele celpleisterklem. Glas dat wordt gebruikt voor virale injecties en opnames van de hele celpleisterklem wordt beschreven, evenals de parameters voor het trekken van micropipettes met behulp van de micropipettetrekker. Raadpleeg de handleidingen voor de micropipettetrekker voor verdere aanbevelingen of het afstemmen van de instellingen.
| Snijden van ACSF, sACSF (in mM) | Experiment ACSF, eACSF (in mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| Hepes | 20 | 20 |
| Kcl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 Zoekertjes | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glucose | 10 | 10 |
| Interne oplossing | ||
| K-gluconaat | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| Hepes | 10 | |
| EGTA | 0.1 | |
| Mgatp | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tabel 2: Samenstelling van kunstmatige cerebrale spinale vloeistof en intracellulaire oplossing. Reagentia en concentraties voor sACSF, eACSF en intracellulaire pipetoplossing voor patchklemopnamen worden vermeld.
Aanvullende figuur 1: Sjabloon voor het voorbereiden van een blok weefsel om hersenplakken te verzamelen. De sjabloon wordt aangepast aan het juiste formaat, afgedrukt en gelijmd op een microscoopglaasje. Een afdekslip wordt over de sjabloon gelijmd om het gebruik ervan te verlengen. Het weefselblok wordt op een stuk filterpapier geplaatst met het sagittale vlak naar beneden, uitgelijnd op de roze achtergrond, en een verticale snede wordt gemaakt in het coronale vlak langs de zwarte lijn. Klik hier om dit figuur te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Incubatiekamer voor geoogste hersenplakken. De kamer is gevuld met sACSF en gebbeld met 95% O2/5% CO2 gasmengsel via een gebogen naald bevestigd aan buizen. Incubatieplatform is gemaakt van nylon gespannen over een plastic cirkelvormige fitting. Klik hier om dit figuur te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Platinastructuren voor slice in opnamekamer. Hersenschijf wordt via pipet overgebracht naar de opnamekamer en bovenop nylon gaas geplaatst, dat over een hoefijzervormig stuk afgeplat platinadraad wordt gespannen en super op zijn plaats wordt gelijmd. Platina harp wordt over hersenschijf geplaatst om het tijdens het opnemen op zijn plaats te verankeren. Klik hier om dit figuur te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Ostwald (λ) en Bunsen (α) coëfficiënten voor andere vluchtige anesthetica. Pas dit protocol aan voor de studie van andere vluchtige gasanesthetica, zoals halothaan, sevofluraan of desfluraan. Vervang de in het protocol beschreven vergelijkingen door de juiste coëfficiënten zoals vermeld in deze tabel. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het evalueren van intra- en extracellulaire responsen op selectief geactiveerde afferente routes in ex vivo hersenplakken.
Het gebruik van optogenetische hulpmiddelen en parallelle opnameschema's stelt onderzoekers in staat om reacties van lokale populaties op afferente inputs uit verre hersengebieden te onderzoeken, terwijl ze tegelijkertijd registreren van gerichte populaties van interneuronen. Het gebruik van optogenetische technologie maakt het mogelijk om axonterminals van afferente projecties te behouden en te activeren, ook al zijn hun cellichamen niet langer bevestigd. Dit verlicht geometrische beperkingen die eerder werden opgelegd aan ex vivo plakjes, omdat het behoud van elektrische verbindingen met een groot bereik niet langer van het grootste belang is. Toch moet ervoor worden gezorgd dat plakjes worden voorbereid in een geometrisch vlak dat eventuele resterende verbindingen van belang behoudt. Piramidale cellen zijn bijvoorbeeld verticaal langs de corticale kolom georiënteerd en opgeroepen netwerkactiviteit gemeten door de meerkanaals sondes in deze experimenten vereist dat dergelijke lokale verbindingen zoveel mogelijk worden bewaard. Zo werden coronale plakjes voorbereid om de lokale connectiviteit intact te houden.
Bij het kiezen van optogenetische constructen en relevante fluorescerende reportereiwitten moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van hun excitatie/emissiespectra en microscopische optica. Aanhoudende lichtstimulatie kan resulteren in gedeeltelijke inactivatie van veel channelrhodopsinevarianten34, wat kan worden vermeden door te kiezen voor reportereiwitten waarvan de excitatiespectra niet overlappen met die van de opsine. Alternatieve varianten met verschillende kinetiek of lichtgevoeligheden kunnen ook worden gekozen, afhankelijk van het experimentele paradigma35, inclusief manipulaties met behulp van alternatieve exciterende of remmende opsins. Filterkubussen moeten ook op passende wijze worden uitgelijnd met de gekozen fluorescerende melders, zodat afferente axonaansluitingen of interneuronen onafhankelijk en zonder geactiveerde opsins kunnen worden afgebeeld. Om rekening te houden met de variabiliteit in virusexpressie, kan het ook relevant zijn voor onderzoekers om elke optogenetisch geïnduceerde activiteit te normaliseren tot het expressieniveau van het virale construct, gemeten door de fluorescerende output van het reportereiwit.
Levering van vooraf berekende concentraties vluchtige anesthetica om weefsel te snijden is ook mogelijk met behulp van de hier beschreven methoden. Bij het kiezen van geschikte fysiologisch relevante gasevenwichtspercentages moeten onderzoekers rekening houden met 10-15% verlies van opgelost isofluraangas tussen de perfusielijn en weefsel36. De methoden die van toepassing zijn op isofluraan zijn gepresenteerd, maar andere geneesmiddelen zoals halothaan, sevofluraan of desfluraan kunnen op dezelfde manier worden behandeld met behulp van de juiste Ostwald- en Bunsen-coëfficiënten (aanvullende tabel 1). De partitionerende eigenschappen van vluchtige anesthetica zorgen ervoor dat ze voorspelbaar zullen oplossen in ACSF. Omdat partiële drukken echter gevoeliger zijn voor temperatuurveranderingen dan waterige EC50-concentraties 37, moeten gasevenwichtsvolumepercentages van vluchtige anesthetica worden omgezet in voorspelde millimolaire concentraties bij kamertemperatuur om de waargenomen effecten te vergelijken met fysiologisch relevante doses in vivo. Als u ervoor kiest om intraveneuze anesthetica zoals etomidate of propofol in hersenplakken te bestuderen, moeten onderzoekers diffusieprofielen van de onderzochte geneesmiddelen overwegen, omdat de evenwichtstijden en fysiologisch relevante concentraties sterk kunnen variëren30.
In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het testen van de effecten van vluchtige anesthetica op verschillende componenten van thalamocorticale circuits in ex vivo hersenplakken. Veel van de variabelen en parameters in de beschreven methoden kunnen worden gemanipuleerd voor verder onderzoek. Verschillende hersengebieden, afferente paden, celdoelen of vluchtige anesthetica kunnen bijvoorbeeld worden bestudeerd door de geschetste methoden aan te passen om nieuwe vragen te beantwoorden. In combinatie met andere theoretische en experimentele methoden zal studie van unieke cellulaire en netwerkcomponenten met behulp van ex vivo hersensegmenten ons begrip van het dynamische brein en de veranderingen die het ondergaat tijdens farmacologische en pathofysiologische veranderingen in bewustzijn bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Bryan Krause voor technische ondersteuning en begeleiding bij dit project.
Dit werk werd ondersteund door de International Anesthesia Research Society (IMRA tot AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 tot MIB) en het Department of Anesthesiology, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison, WI, VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C.
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K.
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G.
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
