Summary
离体脑切片可用于研究挥发性麻醉剂对传入输入的诱发反应的影响。光遗传学用于独立激活丘脑皮质和皮质皮层传入非原发性新皮层，并且用异氟醚调节突触和网络反应。
Abstract
麻醉剂部分通过它们对丘脑皮质回路的作用来影响意识。然而，挥发性麻醉剂对这些回路的不同细胞和网络组件的影响程度尚不清楚。离体脑切片提供了一种方法，研究人员可以通过这种方法探测复杂网络的离散成分，并解开挥发性麻醉剂对诱发反应影响的潜在机制。为了分离脑切片中潜在的细胞类型和途径特异性药物效应，研究人员必须能够独立激活传入纤维途径，识别非重叠的细胞群，并将挥发性麻醉剂应用于水溶液中的组织。在该协议中，描述了测量光遗传学诱发对离体脑切片中新皮层的两个独立传入途径的反应的方法。记录细胞外反应以测定网络活性，并在生长抑素和细小白蛋白阳性中间神经元中进行靶向全细胞膜片钳记录。描述了通过人工脑脊液输送生理相关浓度的异氟醚以调节细胞和网络反应。
Introduction
一个多世纪以来，挥发性麻醉剂在各种临床和学术环境中无处不在。不同类别的麻醉剂具有独特的，通常不重叠的分子靶点1，2，3，但几乎所有麻醉剂都产生无意识。虽然它们的行为影响是完全可预测的，但麻醉剂诱导意识丧失的机制在很大程度上是未知的。麻醉剂可能最终通过对皮质丘脑回路的作用影响意识的水平和内容，破坏整个皮质层次结构的信息整合4，5，6，7，8，9。更广泛地说，皮质丘脑回路的调节可能在实验10或药理学11的意识状态改变中发挥作用，也可能与睡眠12和意识的病理生理障碍13，14有关。
麻醉期间意识丧失和恢复机制的难以捉摸可能部分归因于麻醉剂在细胞、网络和系统水平上的非线性协同作用15。例如，异氟醚抑制所选大脑区域16，17，18内的活动，损害远处大脑区域19，20，21，22，23之间的连接，并以通路特异性方式减少突触反应24，25.麻醉剂的哪些效果，从分子到系统水平，是必要或足以影响意识丧失的尚不清楚。除了使用非侵入性技术对意识进行实质性临床研究19，20，26之外，重要的是实验学家试图解开服务于意识体验的独特细胞和网络相互作用。
通过简化完整大脑中发现的复杂相互作用，离体脑切片允许研究大脑动态系统的孤立组件9。减少切片制备结合了局部神经回路相对完整的解剖结构的优点和体外操作的多功能性。然而，直到最近，方法学上的限制已经排除了对脑切片中长程输入的突触和回路特性的研究27，28;皮质丘脑纤维束的曲折路径使得电刺激几乎不可能激活独立的传入途径。
研究麻醉剂对脑切片制剂的影响提出了额外的挑战。如果没有完整的呼吸和循环系统，必须使用麻醉剂洗澡，并且浓度与估计的效果部位浓度仔细匹配。对于许多静脉麻醉剂，组织中平衡速度的缓慢使得传统的药理学研究费力29，30。研究挥发性气体麻醉剂在离体制剂中的影响更容易处理，但也带来了挑战。这些包括将吸入分压剂量转换为水性浓度，以及需要通过人工脑脊液将药物的改良输送系统输送到组织31。
在这里，描述了研究人员可以利用挥发性麻醉异氟醚的有据可查的物理化学特性将药物输送到离体脑切片的方法，以高时空分辨率激活对感兴趣的皮质区域的通路和层特异性输入，并同时进行层流记录和来自选定神经元群的靶向膜片钳记录。综合起来，这些程序使研究人员能够测量挥发性麻醉剂诱导的几种可观察到的电生理反应特性的变化，从突触到局部网络水平。
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Protocol
本协议中描述的涉及动物的所有程序均已获得威斯康星大学麦迪逊分校医学院和公共卫生动物护理和使用委员会的批准。
1.育种小鼠在中间神经元亚群中表达荧光报告蛋白
- 将纯合子，Cre依赖性tdTomato雄性小鼠与纯合SOM-Cre雌性或纯合PV-Cre雌性小鼠配对。
注意：其他特定的神经元群体可以通过使用适当的Cre线来靶向。 - 让杂合子成熟到至少 3 周大后再进行。对于这里描述的实验，基因分型不是必需的，因为纯合亲本产生的后代对于细胞类型特异性Cre重组酶和Cre依赖性报告等位基因都是杂合的。
2.进行病毒构建体的单侧立体定向注射
- 按照仪器用户手册中的指示调整进样移液器微量移液器拉拔器的设置（推荐设置见 表1 ）。拉动玻璃微量移液器。
- 折断移液器尖端的尖端，使吸头直径约为 30 μm，在几毫米内最小锥度。
- 使用先前记录的程序，确定要注射的病毒的适当滴度和体积。在这里描述的实验中，单侧进样 1.0 μL（滴度：3.1-5.7 TU/mL）产生了良好的结果。
- 用矿物油回注移液器的全部体积。将移液器装入微量注射器上，并将少量矿物油流过吸头，以确保吸头不堵塞。
- 预先填充至少 1.0 μL 的病毒构建体。这些实验中使用的重组腺相关病毒载体是AAV2-hSyn-hChR2（H134R）-EYFP。
- 在手术区域安排无菌布。对立体定位手术的工具进行消毒，并将其放在窗帘上。
- 使用异氟醚（3%用于诱导，1.5-2%用于维持）和氧气混合物麻醉SOM-tdTomato或PV-tdTomato杂合动物。在整个手术过程中定期确认手术麻醉水平，捏住脚趾。通过每10-15分钟监测一次呼吸，确保动物不会超出麻醉的手术计划。
- 剃掉动物的头顶。将70%异丙醇和碘基溶液大量涂抹在手术区域，将眼膏涂抹在眼窝上，以防止膜干燥。将布比卡因/利多卡因（1：1 比例，1.0 mg/kg）皮下注射至手术部位进行局部麻醉。
- 将动物放入立体定位框架中。
- 使用手术刀沿着覆盖颅骨背表面的皮肤矢状轴切开。使用镊子回缩皮肤。必要时用0.9%盐水补水颅骨。
- 在头骨表面，用铅笔轻轻标记前坐标和侧面坐标的交点。在横向平面的适当坐标处钻一个孔（相对于布雷格玛的毫米为单位，扣带皮层（Cg）注射：前0.2，外侧0.3;丘脑后（Po）注射：后2.25，外侧3.4）。
注意：标记应超出毛刺孔的边界，以便为准确放置移液器提供指导。 - 打开并平衡空气台。
- 立体定位框架的电极操纵器在0°处重新定位以注射到Cg中，或在冠状平面中45°处重新定位以注射到Po中。
- 将注射泵连接到电极机械手。将微型注射泵控制器连接到注射泵。
- 在步骤2.11中创建的标记的交叉处，在大脑表面附近（但不接触）导航移液器吸头。将移液器沿其纵轴以大约 1 mm/s 的速度推进到大脑中 0.9 mm（以 Cg 注射）或 3.1 mm（以 Po 注射）。等待 10 分钟，然后再继续。
- 在 10 分钟（100 nL/min）的时间内注射 1.0 μL 病毒构建体。如果观察到病毒从移液器插入部位涌出，请将注射速率减慢至 50 nL/min。
- 注射后，等待10分钟，然后缓慢缩回注射移液器。
- 缝合以闭合头皮切口并皮下给予2-5mg / kg美洛昔康。
- 停用异氟醚并在麻醉期间监测动物。允许根据机构动物护理和使用委员会描述的程序恢复，包括进一步服用镇痛药。
3.急性脑切片的制备
- 在收获组织之前，允许至少3周的病毒构建体表达。
- 准备1L人工脑脊液用于切片程序（切片人工脑脊液，sACSF）。成分见 表2 。
- 在整个切片过程中，通过气体分散管向sACSF提供溶解的95%O2/5%CO2 混合物。
- 为振动刀片切片机准备冰冷浴。将冰冷的标本载物台安装到切片机上，并将蓝宝石刀片固定到位以进行组织切片。
- 用3%异氟醚和氧气麻醉小鼠，直到右反射丧失。
- 使用断头台将小鼠斩首，并立即将头部浸入 4°C sACSF 中。为了保持组织的健康，请尽快完成以下步骤。
- 通过在颅底做一个小切口并轻轻移除每个颅骨板来打开颅腔。轻轻去除下面的硬脑膜。
- 当大脑仍在颅腔中时，使用剃须刀片去除小脑。沿着左半球的矢状面进行第二次垂直切口，就在中线的侧面。
- 准备组织块进行切片。
- 轻轻地将大脑从颅腔中取出。将大脑放在滤纸上，矢状平面向下。将滤纸引导到阻塞模板上，并将大脑与底层模板轮廓对齐（补充图1）。
- 在冕平面上进行两个平行切口，如模板上的线条所示。如有必要，加入一小滴sACSF以保持滤纸湿润。
- 在进行步骤3.8.4时，将组织块短暂地置于4°C sACSF中。
- 在冰冷的试样阶段涂上少量强力胶。
- 从冷 sACSF 中提起组织块。使用吸水毛巾的一角吸走多余的 sACSF。将组织块的后冠平面粘在标本阶段，大脑的背表面面向蓝宝石刀片。
- 收集500μm厚的冠状脑切片。将感兴趣的切片放在34°C sACSF中的尼龙网（补充图2）上，并使容器达到室温。
注意：对于此处描述的实验，从距前膛后约2.25毫米为中心的冠状部分收集电生理记录，以研究非主要感觉区域，即内侧次级视觉皮层（V2MM）。
4.含有溶解性挥发性麻醉剂异氟醚的实验性人工脑脊液（eACSF）袋的制备
- 准备 300 mL 3.0% 异氟醚的储备混合物。
- 在密封的聚四氟乙烯气袋中，将~100mL的95%O 2/5%CO2气体混合物加入20-30mL的液体异氟醚和少量的0.9%盐水中。等待至少30分钟，以使异氟醚在液相和气相之间平衡。
- 使用以下公式确定要添加到库存袋中的饱和异氟醚气体 Vsat 的量：
其中P%库存是库存气体的目标组成（在这种情况下为3%），V库存是库存气袋的最终体积，P异氟醚是异氟醚在室温下的分压（~240mmHg），P总值是大气压（~760mmHg）。 - 将计算出的饱和气体量加入空气袋中，并在袋中填充 95% O2/5% CO2 气体混合物，使储液袋的总体积达到 300 mL。
- 准备2L人工脑脊液用于在实验期间灌注切片（实验ACSF，eACSF）。成分见表2。将 95% O 2/5% CO2 气体混合物溶解到溶液中。
- 准备两袋单独的对照和异氟醚溶液。
- 在空的聚四氟乙烯气袋中，加入 600 mL eACSF 和 600 mL 95% O 2/5% CO2 气体混合物。将此袋子标记为对照组。
- 在另一个空的聚四氟乙烯气袋中，加入 300 mL 的 eACSF。将此袋子标记为异氟醚。
- 选择异氟醚的生理相关平衡气相浓度。使用相当于1.3%异氟醚的气体浓度进行实验。小鼠在吸入异氟醚时失去矫正反射和意识。
- 使用以下公式计算室温下的等效气相浓度，P%（T室）31：
其中P%（T体）为步骤4.3.3中选择的生理相关气相浓度，T室为25°C，T本体为37°C。 - 使用以下公式确定从库存气袋V库存中加入异氟醚溶液的气体体积。
其中V溶液是异氟醚袋（300mL）中eACSF的体积，P%（T室）由公式（2）输入，λ是异氟烷的盐水/气体奥斯特瓦尔德分配系数（λ = 1.232），P%库存是库存气袋的气相浓度（P%库存= 3.0%）。 - 向异氟醚溶液袋中，加入来自气体袋的气体体积，V库存，按步骤4.3.5计算。
- 在异氟醚溶液袋中，加入 95% O2/5% CO2 气体混合物，使异氟烷溶液袋中的气体总体积达到 300 mL。
- 在摇床上摇动对照袋和异氟醚袋至少1小时，以使异氟醚相平衡。
- 收集完所有数据后，可以使用麻醉气体监测仪测量异氟醚在袋中剩余溶液上方的平衡气体浓度，以验证正确的浓度。
- 报告水性单位中挥发性气体的实验浓度，因为毫摩尔浓度对温度变化更可靠。使用以下公式将室温气相浓度P%（T室）转换为等效水浓度（C水溶液，单位为mM）31：
其中α是25°C下异氟醚的盐水/气体本生分配系数32。
5. 多声道录音的硬件和软件准备
- 根据制造商说明设置16通道数据采集系统。
注意：可以使用几种市售放大器和数据采集系统来收集多通道记录。在这里描述的实验中，模拟信号通过电极参考面板传递到两个放大器，在那里它们被放大（2000x）和滤波（0.1-10kHz）。数据采集系统的模拟输入以40kHz的频率数字化。 - 将适当的 16 通道头台适配器固定到显微镜显微操纵器上。调整适配器的方向，使母连接器端口朝下。
- 调整该显微操纵器的操作角度，使其向下朝向记录室，相对于水平角度约为70°。
- 通过固定在显微操纵器的上台适配器将上台输入连接到 16 x 1 探头进行体外电生理学。
- 将头级输出连接器连接到数据采集系统。
- 安装适当的数据采集软件。配置 15 个输入通道以对应于来自前 15 个多通道探头触点的输入信号。配置其余通道以接收来自细胞内电极的输入。
注意： 在收集和分析数据时，请注意电极和适配器图，以确保适当的信号与收集它的电极触点相对应。
6. 光刺激方案的配置
- 设置光传输系统并安装随附的软件。
- 打开软件。选择硬件接线配置，其中触发源（数字/TTL 输出）向光传输系统提供触发输入信号，光传输系统向 470 nm LED 提供触发输出信号。
- 安装高倍物镜。使用数码相机校准大倍光物镜，以便与光传输系统配合使用。
- 创建光刺激配置文件的新配置文件序列。
- 创建选择模式。在这里描述的实验中，使用直径为150μm的圆来允许轴突末端的层特异性激活。
- 要构建配置文件序列，请为任意数量的试验中的每一个复制并粘贴此配置文件。
- 创建包含任何光强度、脉冲持续时间或脉冲数的波形的波形列表。
- 将波形随机分配给每个配置文件。每个配置文件及其分配的波形对应于来自数字TTL输入或一个试验的一个触发脉冲。
- 保存配置文件序列。
- 在数据采集软件中，创建一个新协议。
- 将试验数设置为等于刚刚创建的配置文件序列中的配置文件数。
- 选择信号输入以匹配步骤 5.6 中配置的输入。配置提供单个数字TTL输出的协议，在数字触发之前和之后从这16个输入通道记录适当的时间。
7.将多通道探针置于离体脑组织切片中
- 以 3-6 mL/min 的速度灌注气泡 eACSF（不在密封袋中）。
- 将包含感兴趣区域的脑切片转移到显微镜灌注室的网状网格上。用铂金竖琴锚（见 补充图3）。
- 旋转网格，使多通道探头远端的电极触点线近似垂直于皮亚表面。
- 在宽场照明和显微操纵器的精细控制下，将多通道探头朝向切片表面。
- 旋转滤光片立方转盘以接合适当的滤光片立方体，以可视化在皮质传入轴突末端表达的荧光报告蛋白。如有必要，旋转切片以更精确地将探头与皮亚表面对齐。
- 将探针放置在切片平面的正上方，沿x轴与最终目标位置相差~200μm，在被记录的组织区域的边界之外留下至少一个通道
- 通过沿其纵轴移动机械手，将探头缓慢插入切片中。为了尽量减少对组织的损害，仅将探头推进到尖锐尖端刚好在组织表面下方可见的程度。这将最大限度地减少对组织的损害，同时仍然确保电极触点与组织接触。
8. 膜片钳靶神经元并获得全细胞构型
- 将 eACSF 源切换到袋装控制溶液。
- 鉴定荧光标记的细胞，以进行靶向膜片钳记录。
- 将光圈光圈限制为最小直径。使用低倍物镜，使组织聚焦。
- 将光线集中在与多通道探头相邻（但不重叠）的组织区域上。
- 接合高倍（40x或60x）水浸物镜，小心避免多通道探头和物镜接触。
- 旋转滤光片立方体转盘以接合适当的滤光片组，以允许对表达Cre依赖性荧光标记物的细胞进行成像。
- 鉴定荧光标记的细胞作为膜片钳记录的靶标。抬起物镜以腾出足够的空间来降低贴片移液器。
- 用内部溶液（表2）加载贴片移液器（见表1），并将移液器安装到电极支架中。使用 1 mL 注射器，施加相当于 ~0.1mL 空气的正压。
- 将贴片移液器降低到溶液中。在目视引导下聚焦移液器吸头。
- 使用先前演示的步骤从目标细胞获得全细胞记录33。
- 如果计划评估电池内在特性的变化（例如，输入电阻，响应当前步骤的动作电位放电率），请进行这些记录。否则，请转到下面的轴突刺激协议。
9. 轴突末端的层特异性光遗传学激活
- 操纵 x-y 平面中的视场，使光刺激配置文件与切片上的所需位置对齐。
- 加载光激励协议并准备光传输系统以接收数字TTL脉冲。
- 光遗传学激活轴突末端，同时记录细胞外场电位和细胞内膜波动。
- 将eACSF源切换到异氟醚溶液并洗涤药物15分钟。如有必要，在冲洗期间收集自发录音。
- 重复步骤 9.2-9.3。
- 将eACSF源切换到对照溶液并洗出药物20分钟。如有必要，在冲洗期间收集自发记录。
- 重复步骤 9.2-9.3。
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Representative Results
协议中描述的步骤时间表如图 1 所示。来自高阶皮质区域或非初级丘脑核的皮质输入在非初级视觉皮层1 层 24 中具有部分重叠的末端场。为了分离独立的丘脑皮质或皮质传入途径，将含有ChR2和eYFP荧光报告基因的病毒载体注射到Po或Cg中。注射半径内的细胞吸收病毒载体，并在2-4周后在体细胞和突出轴突中表达非特异性阳离子通道ChR2和报告基因（图2A）。收集了冠状切片。使用适当的过滤器立方体，对表达病毒构建体的轴突进行成像（图2B）。使用ChR2激活轴突末端允许激活传入，而无需连接体细胞的先决条件。
这里描述的实验中使用的动物是SOM-tdTomato或PV-tdTomato杂交动物，它们分别在生长抑素（SOM+）或小白蛋白阳性（PV +）中间神经元中表达荧光报告蛋白tdTomato。第2/3层中的SOM+或PV +中间神经元在视觉引导下靶向膜片钳位，并接合适当的过滤器立方体（第1C层）。这些中间神经元在第1层具有树突，并且是皮质皮质输入的目标（图3A）。
向密封袋中加入 125 mL 3.0% 异氟烷气体和 175 mL 95% O 2/5% CO2 导致气体的预平衡浓度为 1.3%。气体根据其分配系数溶解成eACSF;室温下异氟醚的预测气相平衡浓度为0.6%（图2D）。这已通过气体监测器得到证实。
将组织切片转移到记录室，并将16x1多通道记录探针正交放置在皮质层上（图2E）。通过物镜光路传递以皮质层 1 为中心的 150 μm 圆 470 nm 光，同时使用 16 x 1 多通道探针收集细胞外场电位，并在中间神经元中进行靶向全细胞膜片钳记录。记录设置示意图如图 2F所示。
在中间神经元中观察到突触后电位（PSP），以响应四个2 ms光脉冲（10 Hz; 图3A）。还记录了局部场电位（图3B）。电流源密度（CSD; 图3C）和多单位活动（MUA; 图3D）是从局部野外电位中提取的。使用几种不同光照强度的10项试验进行事后分析。从CSD中提取的吸电流的幅度随着光强度的函数而增加（图4A）。将三参数非线性逻辑方程拟合到数据中，以便跨路径进行比较。PSP 幅度也随吸电流幅度的增加而增加（图 4B）。
在对照组、异氟醚（0.28 mM）和恢复条件下测量对丘脑皮质和皮质皮质输入的突触反应。生长抑素-（图5A）对皮质皮质刺激的突触后反应在异氟醚期间受到抑制，诱发的电流汇也是如此（图5B）。
图 1：概述协议中重要步骤时间表的示意图。
返回页首： 描述了转基因动物育种和病毒载体表达所需步骤的时间表。 底： 描述了在切片制备当天准备材料和进行实验的步骤和时间表。 请点击此处查看此图的大图。
图2：注射病毒载体和制备离体冠状脑切片。
（A）将病毒载体注射到SOM-tdTomato或PV-tdTomato杂交小鼠中的示意图。（B）收获内侧顶叶关联区（mPtA）的冠状切片，并由其eYFP报告基因在第1层鉴定丘脑皮质（顶部）或皮质皮质（底部）传入纤维。此图经24 许可修改。（C）在第1层（绿色）中覆盖eYFP标记的轴突末端，在表层2/3中覆盖tdTomato标记的SOM+中间神经元（红色）。（D）用50：50的溶液-气体混合物制备密封袋。（E） 将 16 x 1 探头放入 mPtA（黑色轮廓）中。（F）皮质切片中记录设置的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图3：皮质切片中同时进行细胞内和多通道细胞外记录。
（A） 来自第 2/3 层 PV+ 间神经元体细胞的全细胞电流钳贴片记录。在 10 Hz 下将四个脉冲（每个 2 ms，蓝色箭头）的蓝光 （2.2 mW） 传递到 L1 中的皮质皮质轴突末梢。显示了十项试验的平均值（红色轨迹）（灰色轨迹）。（B） 来自细胞外 16 x 1 探针的 16 个通道的原始数据。放置在皮质组织中的通道显示为黑色，位于皮质外的通道显示为灰色。（C）从局部场电位信号中提取的电流源密度图显示了第1层中的突触电流吸收（蓝色）。（D）通过对局部场电位信号施加高通滤波器产生的多单元活动，隔离了在较低层中引起的尖峰活动。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：两个不同切片中记录的响应比较。
多种光强度用于唤起皮质层1的突触反应。对于每个试验，从第 1 层细胞外电流汇和第 2/3 层 PV+ 中间神经元中的 EPSP 中提取诱发反应的峰值幅度。（A）丘脑皮质和皮质皮质传入的细胞外反应谱与光强度的函数进行比较。（B）吸电流幅度和EPSP幅度之间的关系取决于路径。在每个刺激途径中，同时收集来自（A）和（B）的数据。 请点击此处查看此图的大图。
图5：同时记录期间溶解在eACSF中的异氟醚的浴液应用。
（A） 在对照、异氟醚和洗涤条件下皮质皮质传入激活时，来自第 2/3 层 SOM+ 中间神经元的细胞内全细胞电流钳记录。垂直蓝线表示光刺激（2 ms;1.65 mW）。（B） 从第 1 层电极中提取的电流源密度迹线。数据与（A）中收集的数据同时收集。洗涤后反应的恢复表明异氟醚抑制突触反应。 请点击此处查看此图的大图。
| 用于病毒注射的微量移液器 | ||||
| 玻璃 | 内径： 0.05 毫米， 外径： 0.11 毫米 | |||
| 循环 | 1 | |||
| 热 | 拉 | 维尔 | 时间 | 压力 |
| 斜坡 + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| 用于全细胞膜片钳记录的微量移液器 | ||||
| 玻璃 | 内径： 1.1 毫米， 外径： 1.7 毫米 | |||
| 循环 | 4 | |||
| 热 | 拉 | 维尔 | 时间 | 压力 |
| 坡道 | 0 | 25 | 250 | 500 |
表1：用于拉动微量移液器进行病毒注射和全细胞膜片钳记录的推荐玻璃和参数。 描述了用于病毒注射和全细胞膜片钳记录的玻璃，以及使用微量移液器拉拔微量移液器的参数。请参阅微量移液器拉拔器的说明手册，以获取进一步的建议或设置的微调。
| 切片 ACSF， sACSF （单位：mM） | 实验ACSF，eACSF（单位：mM） | |
| 氯化钠 | 111 | 111 |
| 氢氧化钠3 | 35 | 35 |
| 赫佩斯 | 20 | 20 |
| 氯化钾 | 1.8 | 1.8 |
| 氯化钙2 | 1.05 | 2.1 |
| 镁硫4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| 葡萄糖 | 10 | 10 |
| 内部解决方案 | ||
| K-葡萄糖酸酯 | 140 | |
| 氯化钠 | 10 | |
| 赫佩斯 | 10 | |
| 埃格塔 | 0.1 | |
| 甲基黄胺 | 4 | |
| 纳格特普 | 0.3 | |
| 酸碱度 = 7.2 |
表2：人工脑脊髓液和细胞内溶液的组成。 列出了用于膜片钳记录的sACSF、eACSF和细胞内移液器溶液的试剂和浓度。
补充图1：用于制备组织块以收集脑切片的模板。 将模板调整到适当的尺寸，打印并粘在显微镜载玻片上。盖玻片粘在模板上以延长其使用时间。将组织块放置在一张滤纸上，矢状面向下，与粉红色背景对齐，并在冠状平面沿黑线进行垂直切割。 请点击这里下载此图。
补充图2：收获的脑切片的孵育室。腔室充满sACSF，并通过连接到管道的弯曲针头用95%O 2/5%CO2气体混合物鼓泡。孵化平台由尼龙制成，拉伸在塑料圆形配件上。请点击这里下载此图。
补充图3：记录室切片的铂结构。 脑切片通过移液管转移到记录室并放置在尼龙网的顶部，尼龙网被拉伸在马蹄形的扁平铂丝上并超级粘合到位。铂金竖琴被放置在脑切片上，以便在录音过程中将其固定到位。 请点击这里下载此图。
补充表1：其他挥发性麻醉剂的奥斯特瓦尔德（λ）和本生（α）系数。 调整此协议以研究其他挥发性气体麻醉剂，例如氟烷，七氟烷或地氟烷。将协议中描述的方程替换为下表中列出的适当系数。 请点击此处下载此表格。
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Discussion
在这篇手稿中，描述了一种用于评估离体脑切片中选择性激活的传入途径的细胞内和细胞外反应的方案。
光遗传学工具和并行记录方案的使用使研究人员能够探测局部人群对来自远处大脑区域的传入输入的反应，同时同时记录来自中间神经元的目标人群。光遗传学技术的使用允许保留和激活传入投影的轴突末端，即使它们的细胞体不再附着。这减轻了以前对 离体 切片施加的几何限制，因为保持远程电气连接不再是最重要的。尽管如此，仍应注意在几何平面上准备切片，以保留任何剩余的感兴趣连接。例如，锥体细胞沿皮质柱垂直定向，在这些实验中由多通道探针测量的诱发网络活动需要尽可能保留这种局部连接。因此，准备了冠状切片以保持局部连接完好无损。
在选择光遗传学构建体和相关荧光报告蛋白时，必须考虑其激发/发射光谱和微观光学器件的特性。持续的光刺激可能导致许多通道视紫红质变异体34的部分失活，这可以通过选择其激发光谱与视蛋白不重叠的报告蛋白来避免。根据实验范式35，也可以选择具有不同动力学或光灵敏度的替代变体，包括使用替代兴奋性或抑制性视蛋白的操作。滤光片立方体还必须与所选的荧光报告基因适当对齐，以便传入轴突末端或中间神经元可以独立成像，而不会激活表达的视蛋白。为了解释病毒表达的可变性，研究人员也可能有必要将任何光遗传学诱导的活性标准化为病毒构建体的表达水平，由报告蛋白的荧光输出来测量。
使用此处概述的方法也可以将预先计算浓度的挥发性麻醉剂输送到切片组织。在选择合适的生理相关气体平衡百分比时，研究人员应考虑灌注管线和组织之间溶解的异氟醚气体损失10-15%36。已经提出了适用于异氟烷的方法，但其他药物如氟烷、七氟烷或地氟烷也可以使用适当的奥斯特瓦尔德系数和本生系数进行类似的处理（补充表1）。挥发性麻醉剂的分配特性确保它们可预测地溶解成ACSF。然而，由于分压比水性EC50 浓度37对温度变化更敏感，因此必须将挥发性麻醉剂的气体平衡体积百分比转换为预测的室温毫摩尔浓度，以比较观察到的效果与 体内生理相关剂量。如果选择在脑切片中研究依托咪酯或丙泊酚等静脉麻醉剂，研究人员必须考虑所研究药物的扩散曲线，因为平衡时间和生理相关浓度可能相差很大30。
在本手稿中，描述了一种方案，用于测试挥发性麻醉剂对离体脑切片中丘脑皮质回路不同成分的影响。所描述方法中的许多变量和参数都可以纵以进行进一步的研究。例如，可以通过调整概述的方法来研究不同的大脑区域、传入途径、细胞靶标或挥发性麻醉剂来回答新问题。结合其他理论和实验方法，使用离体脑切片研究独特的细胞和网络组件将促进我们对动态大脑的理解，以及它在意识的药理学和病理生理学变化期间所经历的变化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Bryan Krause为这个项目提供的技术支持和指导。
这项工作得到了国际麻醉研究学会（IMRA至AR），美国国立卫生研究院（R01 GM109086至MIB）和美国威斯康星大学麦迪逊分校医学与公共卫生学院麻醉学系的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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