Summary
Ex vivo hjerneskiver kan bruges til at studere virkningerne af flygtige anæstetika på fremkaldte reaktioner på afferente input. Optogenetik anvendes til uafhængigt at aktivere thalamokortikale og kortikokortikale afferenter til ikke-primær neocortex, og synaptiske og netværksresponser moduleres med isofluran.
Abstract
Anæstetika påvirker bevidstheden delvist via deres handlinger på thalamokortiske kredsløb. I hvilket omfang flygtige anæstetika påvirker forskellige cellulære og netværkskomponenter i disse kredsløb, er imidlertid stadig uklart. Ex vivo hjerneskiver giver et middel, hvormed efterforskere kan undersøge diskrete komponenter i komplekse netværk og adskille potentielle mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af flygtige anæstetika på fremkaldte reaktioner. For at isolere potentielle celletype- og vejspecifikke lægemiddeleffekter i hjerneskiver skal efterforskere være i stand til uafhængigt at aktivere afferente fiberveje, identificere ikke-overlappende populationer af celler og anvende flygtige anæstetika på vævet i vandig opløsning. I denne protokol beskrives metoder til måling af optogenetisk fremkaldte reaktioner på to uafhængige afferente veje til neocortex i ex vivo hjerneskiver. Ekstracellulære reaktioner registreres for at analysere netværksaktivitet, og målrettede helcelleplasterklemmeoptagelser udføres i somatostatin- og parvalbumin-positive interneuroner. Levering af fysiologisk relevante koncentrationer af isofluran via kunstig cerebral spinalvæske til modulering af cellulære og netværksresponser er beskrevet.
Introduction
Flygtige anæstetika er blevet brugt allestedsnærværende i en række kliniske og akademiske omgivelser i mere end et århundrede. Forskellige klasser af anæstetika har unikke, ofte ikke-overlappende molekylære mål 1,2,3, men næsten alle producerer bevidstløshed. Mens deres adfærdsmæssige virkninger er ret forudsigelige, er de mekanismer, hvormed anæstetika fremkalder bevidsthedstab, stort set ukendte. Anæstetika kan i sidste ende påvirke både bevidsthedsniveauet og indholdet via handlinger på kortikothalamiske kredsløb, hvilket forstyrrer integrationen af information i hele det kortikale hierarki 4,5,6,7,8,9. Mere bredt kan modulering af kortikothalamiske kredsløb spille en rolle i eksperimentelt10 eller farmakologisk11 ændrede bevidsthedstilstande og kan også være impliceret i søvn 12 og i patofysiologiske bevidsthedsforstyrrelser13,14.
Undvigelsen af de mekanismer, der ligger til grund for tab og tilbagevenden af bevidsthed under anæstesi, kan delvist tilskrives ikke-lineære, synergistiske handlinger af anæstetika på celle-, netværks- og systemniveau15. Isofluran undertrykker for eksempel aktivitet inden for de udvalgte hjerneområder 16,17,18, forringer forbindelsen mellem fjerne hjerneområder 19,20,21,22,23 og mindsker synaptiske reaktioner på en vejspecifik måde 24,25 . Hvilke virkninger af anæstetika, fra molekylært til systemniveau, der er nødvendige eller tilstrækkelige til at påvirke bevidsthedstab, forbliver uklart. Ud over væsentlige kliniske undersøgelser af bevidsthed ved hjælp af ikke-invasive teknikker 19,20,26 er det vigtigt, at eksperimentelle søger at adskille de forskellige cellulære og netværksinteraktioner, der understøtter den bevidste oplevelse.
Ved at forenkle de komplekse interaktioner, der findes i den intakte hjerne, tillader ex vivo hjerneskiver studiet af isolerede komponenter i hjernens dynamiske systemer9. Et reduceret skivepræparat kombinerer fordelene ved relativt intakte anatomiske strukturer i lokale neurale kredsløb med alsidigheden af in vitro-manipulationer. Indtil for nylig har metodologiske begrænsninger imidlertid udelukket undersøgelsen af synaptiske og kredsløbsegenskaber af langtrækkende input i hjerneskiver27,28; Den snoede vej af kortikothalamiske fiberkanaler gjorde aktivering af uafhængige afferente veje næsten umulig ved elektrisk stimulering.
Undersøgelse af virkningerne af bedøvelsesmidler på hjerneskivepræparaterne giver yderligere udfordringer. Uden et intakt åndedræts- og kredsløbssystem skal bedøvelsesmidler påføres bad, og koncentrationerne skal nøje afstemmes med de estimerede koncentrationer på effektstedet. For mange intravenøse bedøvelsesmidler gør den langsomme ækvilibreringshastighed i vævet traditionelle farmakologiske undersøgelser besværlige29,30. Det er mere håndterbart at undersøge virkningerne af flygtige gasbedøvelsesmidler i ex vivo-præparater, men det giver også udfordringer. Disse omfatter konvertering af inhalerede partialtrykdoser til vandige koncentrationer og behovet for et modificeret leveringssystem af lægemidlet til vævet via kunstig cerebral spinalvæske31.
Her beskrives metoder, hvormed forskere kan udnytte de veldokumenterede fysisk-kemiske egenskaber af det flygtige bedøvelsesmiddel isofluran til lægemiddellevering til ex vivo hjerneskiver, aktivere vej- og lagspecifikke input til et kortikalt interesseområde med høj spatiotemporal opløsning og udføre samtidige laminære optagelser og målrettede patch clamp-optagelser fra udvalgte populationer af neuroner. Kombineret giver disse procedurer efterforskere mulighed for at måle flygtige anæstetiske inducerede ændringer i flere observerbare elektrofysiologiske responsegenskaber, fra det synaptiske til det lokale netværksniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr beskrevet i denne protokol, blev godkendt af University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health Animal Care and Use Committee.
1. Avlsmus til at udtrykke fluorescerende reporterprotein i interneuron subpopulationer
- Par homozyogøs, Cre-afhængig tdTomato hanmus med enten homozygot SOM-Cre hun eller homozygot PV-Cre hunmus.
BEMÆRK: Andre specifikke neuronale populationer kan målrettes ved hjælp af de relevante Cre-linjer. - Lad heterozygote afkom modnes til mindst 3 uger, før de fortsætter. For eksperimenter beskrevet her er genotypning ikke nødvendig, da homozygote forældre producerer afkom, der alle er heterozygote for både celletypespecifik Cre-rekombinase og Cre-afhængige reporter-alleler.
2. Udførelse af ensidig stereotaxisk injektion af viral konstruktion
- Juster indstillingerne for mikropipettetrækkeren til injektionspipetter som angivet i instrumentets brugervejledning (se tabel 1 for anbefalede indstillinger). Træk glasmikropipetten.
- Bryd spidsen af pipettens skarpe ende, således at spidsdiameteren er ca. 30 μm med minimal tilspidsning over flere millimeter.
- Ved hjælp af tidligere dokumenterede procedurer besluttes den passende titer og volumen af virus, der skal injiceres. I de her beskrevne forsøg gav 1,0 μL (titer: 3,1-5,7 TU/ml) injiceret ensidigt gode resultater.
- Genopfyld pipettens fulde volumen med mineralolie. Læg pipetten på mikrosprøjten, og flyd en lille mængde mineralolie gennem spidsen for at sikre, at spidsen ikke er tilstoppet.
- Forhåndsfyld mindst 1,0 μL viral konstruktion. Den rekombinante adeno-associerede virale vektor, der blev anvendt i disse eksperimenter, var AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Arranger steril drapering i et kirurgisk område. Steriliser værktøjer til stereotaxisk procedure og læg den på draperingen.
- Anæstetik SOM-tdTomat eller PV-tdTomat heterozygot dyr ved hjælp af isofluran (3% til induktion, 1,5-2% til vedligeholdelse) og iltblanding. Bekræft regelmæssigt kirurgisk niveau af anæstesi med tåspids under hele operationen. Sørg for, at dyret ikke bevæger sig ud over den kirurgiske plan for anæstesi ved at overvåge åndedræt hvert 10-15 minut.
- Barber toppen af dyrets hoved. Påfør 70% isopropylalkohol og jodbaseret opløsning liberalt på kirurgisk område og oftalmisk salve på øjenhuler for at forhindre tørring af membranen. Bupivacain/lidokain (1:1-forhold, 1,0 mg/kg) administreres subkutant til operationsstedet for lokalbedøvelse.
- Tilpas dyret i stereotaxisk ramme.
- Brug skalpel til at lave snit langs sagittal akse af hud, der ligger over kraniets dorsale overflade. Træk huden tilbage ved hjælp af tang. Hydrer kraniet med 0,9% saltvand efter behov.
- På overfladen af kraniet skal du let markere skæringspunktet mellem forreste og laterale koordinater med et kryds i blyant. Der bores et hul ved de relevante koordinater i tværplanet (i mm i forhold til Bregma, til injektion af cingulate cortex (Cg): anterior 0,2, lateral 0,3; til posterior thalamus (Po) injektion: posterior 2,25, lateral 3,4).
BEMÆRK: Markeringer skal strække sig ud over grænserne for burrhullet for at give vejledning til nøjagtig placering af pipetten. - Tænd og afbalancer luftbordet.
- Reposition elektrodemanipulator af den stereotaxiske ramme ved 0 ° til injektion i CG eller 45 ° i koronaplanet til injektion i Po.
- Fastgør sprøjtepumpen til elektrodemanipulatoren. Fastgør mikrosprøjtens pumperegulator til sprøjtepumpen.
- Naviger i pipettespidsen nær (men ikke berører) hjernens overflade ved skæringspunktet mellem markeringer oprettet i trin 2.11. Pipetten føres ca. 1 mm/s langs dens længdeakse ind i hjernen enten 0,9 mm (injektion i Cg) eller 3,1 mm (injektion i Po). Vent i 10 minutter, før du fortsætter.
- Injicer 1,0 μL viral konstruktion over en periode på 10 min (100 nL/min). Hvis der observeres udsivning af virus fra pipetteindsætningsstedet, sænkes injektionshastigheden til 50 nL/min.
- Efter injektion skal du vente i 10 minutter, før injektionspipetten langsomt trækkes tilbage.
- Sutur for at lukke hovedbundssnittet og administrere 2-5 mg/kg meloxicam subkutant.
- Afbryd isofluran og overvåg dyret under fremkomsten fra anæstesi. Tillad at komme sig i henhold til procedurer beskrevet af institutionens dyrepleje- og brugsudvalg, herunder yderligere administration af analgetika.
3. Forberedelse af akutte hjerneskiver
- Tillad mindst 3 uger til ekspression af viral konstruktion inden høst af væv.
- Forbered 1 liter kunstig cerebral spinalvæske til udskæringsprocedure (udskæring af kunstig cerebral spinalvæske, sACSF). Se tabel 2 for ingredienser.
- Under hele udskæringsproceduren leveres sACSF med opløst 95% O 2/5% CO2 -blanding, leveret via gasdispersionsrør.
- Forbered iskoldt bad til vibrerende bladmikrotom. Monter iskold prøvetrin på mikrotom, og fastgør safirbladet på plads til vævssektionering.
- Anæstetiser musen med 3% isofluran og ilt indtil tab af opretningsrefleks.
- Afhug musen ved hjælp af guillotin og nedsænk straks hovedet i 4 °C sACSF. For at bevare vævets sundhed skal du udføre følgende trin så hurtigt som muligt.
- Åbn kraniets hulrum ved at lave et lille snit i bunden af kraniet og forsigtigt fjerne hver kranieplade. Fjern forsigtigt underliggende dura mater.
- Mens hjernen stadig er i kraniehulen, skal du bruge barberbladet til at fjerne lillehjernen. Lav et andet lodret snit langs sagittalplanet i venstre halvkugle, lige lateralt til midterlinjen.
- Forbered vævsblok til sektionering.
- Løft forsigtigt hjernen fra kraniets hulrum. Placer hjernen på filterpapiret med det flade, sagittale plan nedad. Før filterpapiret over blokeringsskabelonen, og juster hjernen til den underliggende skabelonoversigt (supplerende figur 1).
- Lav to parallelle snit i koronalplanet som angivet med linjerne på skabelonen. Tilsæt en lille dråbe sACSF for at holde filterpapiret vådt, hvis det er nødvendigt.
- Vævsblokken placeres kortvarigt i 4 °C sACSF, mens trin 3.8.4 udføres.
- Påfør en lille mængde superlim på det iskolde prøvetrin.
- Løft vævsblokken fra kold sACSF. Brug hjørnet af et absorberende håndklæde til at transportere overskydende sACSF væk. Lim vævsblokkens bageste koronale plan til prøvestadiet, med hjernens dorsale overflade vendt mod safirbladet.
- Saml 500 μm tykke koronale hjerneskiver. Anbring skiver af interesse på nylonnet (supplerende figur 2) i 34 °C sACSF, og lad beholderen nå stuetemperatur.
BEMÆRK: For eksperimenter beskrevet her blev elektrofysiologiske optagelser indsamlet fra et koronalt afsnit centreret ca. 2,25 mm bagud til bregma for at studere et ikke-primært sensorisk område, medial sekundær visuel cortex (V2MM).
4. Fremstilling af eksperimentelle kunstige cerebrale spinalvæskeposer (eACSF) indeholdende opløst flygtig anæstetisk isofluran
- Forbered 300 ml af en lagerblanding af 3,0% isofluran.
- I en forseglet polytetrafluorethylengaspose tilsættes ~ 100 ml 95% O 2/5% CO2 gasblanding til 20-30 ml flydende isofluran og en lille mængde 0,9% saltvand. Vent mindst i 30 minutter for at tillade ækvilibrering af isofluran mellem væske- og gasfaser.
- Bestem mængden af mættet isoflurangas, Vsat, for at tilføje til lagerposen ved hjælp af følgende ligning:
hvor P%lager er stamgassens målsammensætning (3% i dette tilfælde),V-lager er det endelige volumen af stamgasposen, P-isofluran er partialtrykket afisofluran ved stuetemperatur (~240 mmHg), ogP-total er det atmosfæriske tryk (~760 mmHg). - Tilsæt den beregnede mængde mættet gas til en tom gaspose, og fyld posen med et volumen på 95% O 2/5% CO2 gasblanding for at bringe det samlede volumen lagerpose til 300 ml.
- Forbered 2 L kunstig cerebral spinalvæske til perfusion af skiven under eksperimentet (eksperimentel ACSF, eACSF). Se tabel 2 for ingredienser. Opløs 95% O 2/5% CO2 gasblanding i opløsning.
- Forbered to separate poser med kontrol- og isofluranopløsninger.
- Til en tom polytetrafluorethylengaspose tilsættes 600 ml eACSF og 600 ml 95% O 2/5% CO2 gasblanding. Mærk denne taske som Kontrol.
- Til en anden tom polytetrafluorethylengaspose tilsættes 300 ml eACSF. Mærk denne taske som Isoflurane.
- Vælg en fysiologisk relevant ækvilibreret gasfasekoncentration af isofluran. Eksperimenter blev udført ved anvendelse af gaskoncentrationer svarende til 1, 3% isofluran. Mus mister opretningsrefleks og formodentlig bevidsthed ved 0,9% inhaleret isofluran.
- Brug følgende ligning til at beregne den ækvivalente gasfasekoncentration ved stuetemperatur, P%(T-rum)31:
hvor P%(T-legemet) er den fysiologisk relevante gasfasekoncentration valgt i trin 4.3.3, T-rum er 25 °C, ogT-legeme er 37 °C. - Brug følgende ligning til at bestemme mængden af gas fra lagergaspose,V-lager, for at tilføje til Isoflurane-opløsningen.
hvorV-opløsning er volumenet af eACSF i ISOFLURANEPOSE (300 ml), P% (T-rum) indtastes fra ligning (2), λ er saltvand / gas Ostwald-fordelingskoefficienten for isofluran (λ = 1,232), og P%-lager er gasfasekoncentrationen af stamgasposen (P%stock = 3,0%). - Til isofluranopløsningsposen tilsættes mængden af gas fra lagergasposen,V-lager, beregnet i trin 4.3.5.
- Til isofluranopløsningsposen tilsættes et volumen på 95% O 2/5% CO2 -gasblanding for at bringe det samlede volumen gas i isofluranopløsningsposen til 300 ml.
- Ryst både kontrol- og isofluranposer på shakeren i mindst 1 time for at muliggøre isofluranfasebalancering.
- Når alle data er indsamlet, kan den korrekte koncentration verificeres ved hjælp af en bedøvelsesgasmonitor til måling af ækvilibreret gaskoncentration af isofluran over den resterende opløsning i posen.
- Rapporter eksperimentelle koncentrationer af flygtige gasser i vandige enheder, da millimolære koncentrationer er mere robuste over for temperaturændringer. Brug følgende ligning til at konvertere rumtemperaturgasfasekoncentration, P% (T-rum), til ækvivalent vandig koncentration (Cvandig, i mM)31:
hvor α er saltvands-/gas-Bunsen-fordelingskoefficienten for isofluran ved 25 °C32.
5. Forberedelse af hardware og software til multikanalsoptagelser
- Konfigurer 16-kanals dataindsamlingssystem i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Flere kommercielt tilgængelige forstærkere og dataindsamlingssystemer kan bruges til at indsamle flerkanalsoptagelser. I de her beskrevne eksperimenter leveres analoge signaler via et elektrodereferencepanel til to forstærkere, hvor de forstærkes (2000x) og filtreres (0,1-10 kHz). Analoge indgange til dataindsamlingssystemet digitaliseres ved 40 kHz. - Fastgør den passende 16-kanals headstage-adapter til en mikroskopmikromanipulator. Orienter adapteren, så hunstikportene vender nedad.
- Funktionsvinklen for denne mikromanipulator justeres, således at den er orienteret nedad mod optagekammeret i en vinkel på ca. 70° i forhold til vandret.
- Tilslut headstage-indgangen til en 16 x 1 sonde til in vitro-elektrofysiologi via headstage-adapteren forankret til mikromanipulatoren.
- Tilslut headstage-outputstikket til dataindsamlingssystemet.
- Installer passende software til dataindsamling. Konfigurer 15 indgangskanaler, så de svarer til indgangssignaler fra de første 15 flerkanalssondekontakter. Konfigurer den resterende kanal til at modtage input fra den intracellulære elektrode.
BEMÆRK: Sørg for at overveje elektrode- og adapterkort, når du indsamler og analyserer data, for at sikre, at det passende signal svarer til den elektrodekontakt, hvorfra det blev indsamlet.
6. Konfiguration af lysstimuleringsprotokoller
- Opsæt lysleveringssystem og installer den medfølgende software.
- Åbn softwaren. Vælg hardwareledningskonfiguration, hvor en triggerkilde (Digital / TTL Out) giver Trigger In-signal til lysleveringssystemet, og lysleveringssystemet giver Trigger Out-signal til en 470 nm LED.
- Monter objektivobjektiv med høj effekt. Brug digitalkamera til at kalibrere mål med høj effekt til brug med lysleveringssystem.
- Opret ny profilsekvens af lysstimuleringsprofiler.
- Opret et mønster af valg. I de eksperimenter, der er beskrevet her, bruges en cirkel med diameter 150 μm til at tillade lagspecifik aktivering af axonterminaler.
- Hvis du vil oprette en profilsekvens, skal du kopiere og indsætte denne profil for hver af et vilkårligt antal prøveversioner.
- Opret en bølgeformsliste, der indeholder bølgeformer af enhver lysintensitet, pulsvarighed eller pulsnummer.
- Tildel tilfældigt bølgeformer til hver profil. Hver profil med sin tildelte bølgeform svarer til en triggerpuls fra en digital TTL-indgang eller et forsøg.
- Gem profilsekvensen.
- Opret en ny protokol i dataindsamlingssoftwaren.
- Indstil antallet af prøveversioner til at svare til antallet af profiler i den profilsekvens, der netop er oprettet.
- Vælg signalindgange, der passer til dem, der er konfigureret i trin 5.6. Konfigurer en protokol, der giver en enkelt digital TTL-udgang, optagelse fra disse 16 inputkanaler i et passende tidsrum før og efter den digitale udløser.
7. Placering af flerkanalssonde i ex vivo hjernevævsskive
- Perfuse boblede eACSF (ikke i forseglede poser) ved 3-6 ml/min.
- Overfør hjerneskiven indeholdende interesseområde til maskegitteret i mikroskopperfusionskammer. Anker med platinharpe (se supplerende figur 3).
- Drej netgitteret, således at linjen af elektrodekontakter på den distale ende af flerkanalssonden er omtrent vinkelret på den piale overflade.
- Under bredfeltbelysning og under fin kontrol af mikromanipulatoren sænkes multikanalssonden mod skivens overflade.
- Drej filterkubetårnet for at aktivere den passende filterterning til visualisering af det fluorescerende reporterprotein udtrykt i axonterminaler af kortikale afferenter. Drej om nødvendigt skiven for mere præcist at justere sonden med den piale overflade.
- Placer sonden lige over skivens plan, ~ 200 μm under den endelige målposition langs x-aksen, og efterlad mindst en kanal uden for grænsen for det vævsområde, der registreres
- Indsæt langsomt sonden i skiven ved at flytte manipulatoren langs dens længdeakse. For at minimere skader på vævet skal du kun fremme sonden i det omfang, at de skarpe spidser kun er synlige under vævsoverfladen. Dette vil minimere skader på vævet, samtidig med at elektrodekontakterne er i kontakt med vævet.
8. Patch fastspænding målrettede neuroner og opnåelse af helcellekonfiguration
- Skift eACSF-kilde til kontrolløsning i pose.
- Identificer fluorescerende mærket celle til målrettet patch clamp optagelse.
- Begræns blænden iris membran til den mindste diameter. Aktivér en objektivlinse med lav effekt, og bring vævet i fokus.
- Centrer lyset over et vævsområde, der støder op til (men ikke overlapper) flerkanalssonden.
- Aktivér målet om nedsænkning af vand med høj effekt (40x eller 60x), og vær forsigtig for at undgå kontakt mellem flerkanalssonden og objektivlinsen.
- Drej filterkubetårnet for at aktivere det relevante filtersæt for at muliggøre billeddannelse af celler, der udtrykker Cre-afhængig fluorescerende markør.
- Identificer en fluorescerende mærket celle som et mål for patch clamp optagelse. Hæv objektivlinsen for at skabe rigelig plads til at sænke en lappepipette.
- Ilæg en patchpipette (se tabel 1) med intern opløsning (tabel 2), og monter pipette i elektrodeholder. Brug 1 ml sprøjte til at anvende et positivt tryk svarende til ~ 0,1 ml luft.
- Lavere patchpipette ind i opløsningen. Bring pipettespidsen i fokus under visuel vejledning.
- Få helcelleoptagelse fra den målrettede celle ved hjælp af de trin, der tidligere er vist33.
- Hvis du planlægger at vurdere ændringer i cellens iboende egenskaber (f.eks. inputmodstand, handlingspotentiel affyringshastighed som reaktion på aktuelle trin), skal du foretage disse optagelser. Ellers skal du flytte til axonstimuleringsprotokol nedenfor.
9. Lagspecifik optogenetisk aktivering af axonterminaler
- Manipuler synsfeltet i x-y-planet for at justere lysstimuleringsprofilen med den ønskede placering på skiven.
- Indlæs lysstimuleringsprotokol, og forbered lysleveringssystemet til at modtage en digital TTL-puls.
- Optogenetisk aktiverer axonterminaler, samtidig med at ekstracellulære feltpotentialer og intracellulære membranudsving registreres.
- Skift eACSF-kilde til Isofluran-opløsning og vask lægemiddel i 15 minutter. Saml om nødvendigt spontane optagelser under indvaskningen.
- Gentag trin 9.2-9.3.
- Skift eACSF-kilde til kontrolopløsning, og vask medicin ud i 20 minutter. Saml om nødvendigt spontane optagelser under udvaskning.
- Gentag trin 9.2-9.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje over trin beskrevet i protokollen er vist i figur 1. Kortikale input, der ankommer fra højere ordens kortikale områder eller fra ikke-primære thalamiske kerner, har delvist overlappende terminalfelter i lag 1 af ikke-primær visuel cortex24. For at isolere uafhængige thalamokortikale eller kortikokortikale afferente veje blev en viral vektor indeholdende ChR2 og en eYFP fluorescerende reporter injiceret i enten Po eller Cg. Celler inden for injektionsradius optager den virale vektor og udtrykker efter 2-4 uger den ikke-specifikke kationkanal ChR2 og reporteren i både soma og projicerende axoner (figur 2A). Koronale skiver blev indsamlet. Med den passende filterterning aktiveret blev axoner, der udtrykte den virale konstruktion, afbildet (figur 2B). Brugen af ChR2 til at aktivere axonterminaler muliggør aktivering af afferenter uden forudsætning for en vedhæftet soma.
De dyr, der blev brugt i de her beskrevne forsøg, var SOM-tdTomato eller PV-tdTomato hybriddyr, som udtrykker det fluorescerende reporterprotein tdTomato i henholdsvis somatostatin- (SOM+) eller parvalbumin-positive (PV+) interneuroner. SOM+ eller PV+ interneuroner i lag 2/3 blev målrettet til patch fastspænding under visuel vejledning med den passende filterterning aktiveret (Layer 1C). Disse interneuroner har dendritter i lag 1 og er mål for kortikokortiske input (figur 3A).
Tilsætning af 125 ml 3,0% isoflurangas og 175 ml 95% O 2/5% CO2 til en forseglet pose resulterede i en forligevægtskoncentration af gas på 1,3%. Gas opløst i eACSF i henhold til dens partitionskoefficient; den forudsagte gasfaseligevægtskoncentration af isofluran ved stuetemperatur var 0,6% (figur 2D). Dette blev bekræftet via gasmonitor.
Vævsskiven blev overført til optagekammeret, og 16x1 multikanals optagesonden blev placeret ortogonalt til den kortikale laminae (figur 2E). En 150 μm cirkel af 470 nm lys centreret over kortikale lag 1 blev leveret via den objektive lysvej, mens ekstracellulære feltpotentialer blev indsamlet ved hjælp af 16 x 1 multikanalssonde og målrettede helcelleplasterklemmeoptagelser blev udført i interneuroner. Et skema over optagelsesopsætningen er vist i figur 2F.
Postsynaptiske potentialer (PSP'er) blev observeret i interneuroner som reaktion på et tog på fire 2 ms lysimpulser (10 Hz; Figur 3A). Der blev også registreret lokale feltpotentialer (figur 3B). Aktuel kildetæthed (CSD; Figur 3C) og aktivitet med flere enheder (MUA; Figur 3D) blev hentet fra lokale feltpotentialer. Ti forsøg med flere forskellige lysintensiteter blev brugt til at udføre post hoc-analyser. Amplituden af strømdræn ekstraheret fra CSD steg som en funktion af lysintensiteten (figur 4A). En ikke-lineær logistisk ligning med tre parametre var egnet til dataene til sammenligninger på tværs af veje. PSP-amplitude steg også med den aktuelle synkeamplitude (figur 4B).
Synaptiske reaktioner på thalamokortiske og kortikokortiske input blev målt under kontrol, isofluran (0,28 mM) og genopretningsbetingelser. Postsynaptiske reaktioner af somatostatin- (figur 5A) på kortikokortikale stimuli blev undertrykt under isofluran, ligesom fremkaldte strømdræn (figur 5B).
Figur 1: En skematisk skitsering tidslinje over vigtige trin i protokollen.
Top: Beskriver tidslinje for trin, der er nødvendige for avl af transgene dyr og ekspression af viral vektor. Bund: Viser trin og tidslinje for forberedelse af materialer og udførelse af eksperiment på dagen for skiveforberedelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Injektion af viral vektor og præparat ex vivo koronale hjerneskiver.
(A) Skematisk repræsentation af injektion af viral vektor i SOM-tdTomato eller PV-tdTomato hybridmus. (B) Koronale skiver af det mediale parietale associeringsområde (mPtA) blev høstet, og thalamokortiske (øverste) eller kortikokortikale (nederste) afferente fibre blev identificeret af deres eYFP-reporter i lag 1. Dette tal er ændret med tilladelse fra24. (C) Overlejring af eYFP-mærkede axonterminaler i lag 1 (grøn) og tdTomato-mærkede SOM+ interneuroner (rød) i overfladisk lag 2/3. (D) Forseglede poser blev fremstillet med en 50:50 opløsning-til-gas-blanding. (E) Placering af en 16 x 1 sonde i mPtA (sort kontur). (F) Skematisk over optagelsesopsætningen i kortikale skiver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Samtidige intracellulære og flerkanals ekstracellulære optagelser i kortikal skive.
(A) Optagelse af helcellestrømsklemmeplaster fra soma af et lag 2/3 PV + interneuron. Fire impulser (2 ms hver, blå pile) blåt lys (2,2 mW) ved 10 Hz blev leveret til kortikokortiske axonterminaler i L1. Gennemsnit (rødt spor) af ti forsøg (grå spor) vises. (B) Rådata fra 16 kanaler med ekstracellulær 16 x 1 sonde. Kanaler placeret i kortikalt væv er vist i sort, og dem, der ligger uden for cortex i gråt. (C) Et aktuelt kildetæthedsdiagram, ekstraheret fra det lokale feltpotentialesignal, viser synaptiske strømdræn (blå) i lag 1. (D) Aktivitet med flere enheder, der genereres ved at anvende et højpasfilter på det lokale feltpotentialesignal, isolerer spikingaktivitet, der fremkaldes i lavere lag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af svar fra optagelser i to forskellige skiver.
Flere lysintensiteter blev brugt til at fremkalde synaptiske reaktioner i kortikale lag 1. For hvert forsøg blev den maksimale amplitude af det fremkaldte respons ekstraheret fra lag 1 ekstracellulær strømvask og EPSP'er i lag 2/3 PV + interneuroner. (A) Ekstracellulære responsprofiler for thalamokortiske og kortikokortikale afferenter sammenlignes som en funktion af lysintensiteten. (B) Forholdet mellem den nuværende synkeamplitude og EPSP-amplitude er baneafhængigt. Inden for hver stimulusvej blev data fra (A) og (B) indsamlet samtidigt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Påføring af isofluran opløst i eACSF under samtidige optagelser.
(A) Intracellulær helcellestrømsklemmeoptagelse fra lag 2/3 SOM+ interneuron ved aktivering af kortikokortikale afferenter under kontrol-, isofluran- og vaskeforhold. Lodrette blå linjer angiver lysstimuli (2 ms; 1,65 mW). (B) Spor af strømkildetæthed ekstraheret fra elektrode i lag 1. Data blev indsamlet samtidig med dem, der blev indsamlet i (A). Gendannelse af respons ved vask viser depression af synaptiske reaktioner ved isofluran. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mikropipette til virusinjektion | ||||
| Glas | ID: 0,05 mm, OD: 0,11 mm | |||
| Sløjfer | 1 | |||
| Varme | Trække | Vel | Tidspunkt | Tryk |
| Rampe + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Mikropipette til optagelser af hele celleplasterklemmer | ||||
| Glas | ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm | |||
| Sløjfer | 4 | |||
| Varme | Trække | Vel | Tidspunkt | Tryk |
| Rampe | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tabel 1: Anbefalet glas og parametre til træk af mikropipetter til virale injektioner og optagelser af helcelleplaster. Glas, der anvendes til virale injektioner og helcelleplasterklemmeoptagelser, er beskrevet såvel som parametrene til at trække mikropipetter ved hjælp af mikropipettettrækkeren. Se brugsanvisninger til micropipette puller for yderligere anbefalinger eller finjustering af indstillinger.
| Udskæring af ACSF, sACSF (i mM) | Eksperiment ACSF, eACSF (i mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| KCl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glukose | 10 | 10 |
| Intern løsning | ||
| K-gluconat | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| EGTA | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tabel 2: Sammensætning af kunstig cerebral spinalvæske og intracellulær opløsning. Reagenser og koncentrationer for sACSF, eACSF og intracellulær pipetteopløsning til patch clamp-optagelser er angivet.
Supplerende figur 1: Skabelon til forberedelse af vævsblok til opsamling af hjerneskiver. Skabelonen justeres til den passende størrelse, udskrives og limes på et mikroskopglas. En dækseddel limes over skabelonen for at forlænge brugen. Vævsblokken placeres på et stykke filterpapir med sagittalplanet nedad, justeret til den lyserøde baggrund, og der foretages et lodret snit i koronalplanet langs den sorte linje. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 2: Inkubationskammer til høstede hjerneskiver. Kammeret fyldes med sACSF og bobles med 95% O 2/5% CO2 gasblanding via en bøjet nål fastgjort til slangen. Inkubationsplatform er lavet af nylon strakt over en plastisk cirkulær montering. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 3: Platinstrukturer til udsnit i optagekammer. Hjerneskiven overføres til optagekammeret via pipette og placeres oven på nylonnet, som strækkes over et hesteskoformet stykke fladtrykt platintråd og superlimes på plads. Platinharpe placeres over hjerneskiven for at forankre den på plads under optagelsen. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende tabel 1: Ostwald (λ) og Bunsen (α) koefficienter for andre flygtige anæstetika. Tilpas denne protokol til undersøgelse af andre flygtige gasanæstetika, såsom halothan, sevofluran eller desfluran. De ligninger, der er beskrevet i protokollen, erstattes med de relevante koefficienter som anført i denne tabel. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskrives en protokol til evaluering af intra- og ekstracellulære reaktioner på selektivt aktiverede afferente veje i ex vivo hjerneskiver.
Brugen af optogenetiske værktøjer og parallelle registreringsordninger gør det muligt for efterforskere at undersøge lokalbefolkningens reaktioner på afferente input fra fjerne hjerneområder, mens de samtidig optager fra målrettede populationer af interneuroner. Brugen af optogenetisk teknologi gør det muligt at bevare og aktivere axonterminaler af afferente fremskrivninger, selvom deres cellelegemer ikke længere er bundet. Dette aflaster geometriske begrænsninger, der tidligere blev pålagt ex vivo-skiver , da bevarelse af elektriske forbindelser med lang rækkevidde ikke længere er altafgørende. Alligevel skal man sørge for at forberede skiver i et geometrisk plan, der bevarer eventuelle resterende forbindelser af interesse. For eksempel er pyramideceller orienteret lodret langs den kortikale søjle, og fremkaldt netværksaktivitet målt af multikanalssonderne i disse eksperimenter kræver, at sådanne lokale forbindelser bevares så meget som muligt. Således var koronale skiver forberedt på at holde lokal forbindelse intakt.
Ved valg af optogenetiske konstruktioner og relevante fluorescerende reporterproteiner skal egenskaberne af deres excitations-/emissionsspektre og mikroskopiske optik tages i betragtning. Vedvarende lysstimulering kan resultere i delvis inaktivering af mange channelrhodopsin varianter34, hvilket kan undgås ved at vælge reporterproteiner, hvis excitationsspektre ikke overlapper med opsin. Alternative varianter med forskellig kinetik eller lysfølsomhed kan også vælges afhængigt af det eksperimentelle paradigme35, herunder manipulationer ved hjælp af alternative excitatoriske eller hæmmende opsiner. Filterkuber skal også være passende justeret med de valgte fluorescerende journalister, således at afferente axonterminaler eller interneuroner kan afbildes uafhængigt og uden at aktivere udtrykte opsiner. For at tage højde for variationen i virusekspression kan det også være relevant for forskere at normalisere enhver optogenetisk induceret aktivitet til ekspressionsniveauet for den virale konstruktion målt ved det fluorescerende output af reporterproteinet.
Levering af forudberegnede koncentrationer af flygtige anæstetika til udskæring af væv er også mulig ved hjælp af de metoder, der er beskrevet her. Ved valg af passende fysiologisk relevante gasligevægtsprocenter bør investigatorer tage højde for 10-15% tab af opløst isoflurangas mellem perfusionslinjen og væv36. De metoder, der gælder for isofluran, er blevet præsenteret, men andre lægemidler såsom halothan, sevofluran eller desfluran kan håndteres på samme måde ved hjælp af de relevante Ostwald- og Bunsen-koefficienter (supplerende tabel 1). Opdelingsegenskaberne for flygtige anæstetika sikrer, at de forudsigeligt opløses i ACSF. Da partialtryk imidlertid er mere følsomme over for temperaturændringer end vandige EC50-koncentrationer 37, skal volumenprocenter af flygtige anæstetika omregnes til forudsagte millimolære koncentrationer ved stuetemperatur for at sammenligne observerede virkninger med fysiologisk relevante doser in vivo. Hvis man vælger at studere intravenøse anæstetika såsom etomidat eller propofol i hjerneskiver, skal efterforskerne overveje diffusionsprofiler af de undersøgte lægemidler, da ækvilibreringstider og fysiologisk relevante koncentrationer kan variere meget30.
I dette manuskript er der beskrevet en protokol til test af virkningerne af flygtige anæstetika på forskellige komponenter i thalamokortiske kredsløb i ex vivo hjerneskiver. Mange af variablerne og parametrene i de beskrevne metoder kan manipuleres til yderligere undersøgelser. For eksempel kan forskellige hjerneområder, afferente veje, cellemål eller flygtige anæstetika studeres ved at tilpasse de skitserede metoder til at besvare nye spørgsmål. Kombineret med andre teoretiske og eksperimentelle metoder vil undersøgelse af unikke cellulære og netværkskomponenter ved hjælp af ex vivo hjerneskiver fremme vores forståelse af den dynamiske hjerne og de ændringer, den gennemgår under farmakologiske og patofysiologiske ændringer i bevidstheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Bryan Krause for teknisk support og vejledning om dette projekt.
Dette arbejde blev støttet af International Anesthesia Research Society (IMRA til AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 til MIB) og Institut for Anæstesiologi, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison, WI, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C.
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K.
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G.
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
