Summary
Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.
Abstract
Anestezikler kısmen talamokortikal devreler üzerindeki eylemleri yoluyla bilinci etkiler. Bununla birlikte, uçucu anesteziklerin bu devrelerin farklı hücresel ve ağ bileşenlerini ne ölçüde etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Ex vivo beyin dilimleri, araştırmacıların karmaşık ağların ayrı bileşenlerini araştırabilecekleri ve uçucu anesteziklerin uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerinin altında yatan potansiyel mekanizmaları çözebilecekleri bir araç sağlar. Beyin dilimlerinde potansiyel hücre tipine ve yola özgü ilaç etkilerini izole etmek için, araştırmacılar afferent lif yollarını bağımsız olarak aktive edebilmeli, örtüşmeyen hücre popülasyonlarını tanımlayabilmeli ve sulu çözeltideki dokuya uçucu anestezikler uygulayabilmelidir. Bu protokolde, ex vivo beyin dilimlerinde neokortekse giden iki bağımsız afferent yola optogenetik olarak uyarılmış yanıtları ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücre dışı yanıtlar ağ aktivitesini analiz etmek için kaydedilir ve somatostatin ve parvalbümin pozitif internöronlarda hedeflenen tüm hücre yama kelepçesi kayıtları yapılır. Hücresel ve ağ yanıtlarını modüle etmek için fizyolojik olarak ilgili izofluran konsantrasyonlarının yapay beyin omurilik sıvısı yoluyla verilmesi tarif edilmiştir.
Introduction
Uçucu anestezikler, bir yüzyıldan fazla bir süredir çeşitli klinik ve akademik ortamlarda her yerde kullanılmaktadır. Farklı anestezik sınıfları benzersiz, genellikle örtüşmeyen moleküler hedeflere sahiptir 1,2,3, ancak neredeyse hepsi bilinçsizlik üretir. Davranışsal etkileri oldukça öngörülebilir olsa da, anesteziklerin bilinç kaybına neden olduğu mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Anestezikler nihayetinde kortikotalamik devreler üzerindeki eylemler yoluyla bilincin hem seviyesini hem de içeriğini etkileyebilir ve kortikal hiyerarşi 4,5,6,7,8,9 boyunca bilginin entegrasyonunu bozabilir. Daha geniş anlamda, kortikotalamik devrelerin modülasyonu, deneysel olarak 10 veya farmakolojik olarak 11 değişmiş bilinç durumunda rol oynayabilir ve ayrıca uyku12 ve bilincin patofizyolojik bozukluklarında13,14 ile ilişkili olabilir.
Anestezi sırasında bilinç kaybı ve geri dönüşünün altında yatan mekanizmaların belirsizliği, kısmen anesteziklerin hücresel, ağ ve sistem düzeylerindeki lineer olmayan, sinerjik etkilerine bağlanabilir15. Örneğin, izofluran, seçilen beyin bölgelerindeki aktiviteyi baskılar 16,17,18, uzak beyin bölgeleri arasındaki bağlantıyı bozar 19,20,21,22,23 ve sinaptik yanıtları yola özgü bir şekilde azaltır 24,25 . Anesteziklerin moleküler düzeyden sistem düzeyine kadar hangi etkilerinin bilinç kaybını etkilemek için gerekli veya yeterli olduğu belirsizliğini korumaktadır. Non-invaziv teknikler 19,20,26 kullanılarak bilincin önemli klinik araştırmalarına ek olarak, deneycilerin bilinçli deneyime hizmet eden farklı hücresel ve ağ etkileşimlerini çözmeye çalışmaları önemlidir.
Bozulmamış beyinde bulunan karmaşık etkileşimleri basitleştirerek, ex vivo beyin dilimleri, beynin dinamik sistemlerinin izole bileşenlerinin incelenmesine izin verir9. Azaltılmış bir dilim preparatı, yerel sinir devrelerinin nispeten sağlam anatomik yapılarının faydalarını, in vitro manipülasyonların çok yönlülüğü ile birleştirir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, metodolojik kısıtlamalar, beyin dilimlerinde uzun menzilli girdilerin sinaptik ve devre özelliklerinin incelenmesini engellemiştir27,28; kortikotalamik lif yollarının kıvrımlı yolu, bağımsız afferent yolların aktivasyonunu elektriksel stimülasyonla imkansız hale getirdi.
Anestezik ajanların beyin dilimi preparatları üzerindeki etkilerinin araştırılması ek zorluklar ortaya koymaktadır. Sağlam bir solunum ve dolaşım sistemi yoksa, anestezik ajanlar banyo ile uygulanmalı ve konsantrasyonlar tahmini etki alanı konsantrasyonlarına dikkatlice eşleştirilmelidir. Birçok intravenöz anestezik ajan için, dokudaki denge hızının yavaş olması, geleneksel farmakolojik araştırmaları zahmetli hale getirmektedir29,30. Uçucu gaz anesteziklerinin ex vivo preparatlardaki etkilerinin araştırılması daha zordur, ancak aynı zamanda zorluklar da ortaya koymaktadır. Bunlar arasında solunan kısmi basınç dozlarının sulu konsantrasyonlara dönüştürülmesi ve ilacın yapay beyin omurilik sıvısı yoluyla dokuya modifiye edilmiş bir dağıtım sistemine duyulan ihtiyaç31 yer almaktadır.
Burada, araştırmacıların ex vivo beyin dilimlerine ilaç verilmesi için uçucu anestezik izofluran'ın iyi belgelenmiş fizikokimyasal özelliklerinden yararlanabilecekleri, yüksek uzaysal zamansal çözünürlüğe sahip kortikal bir ilgi alanına yol ve tabakaya özgü girdileri aktive edebilecekleri ve belirli nöron popülasyonlarından eşzamanlı laminer kayıtlar ve hedeflenmiş yama kelepçesi kayıtları yapabilecekleri yöntemler açıklanmaktadır. Kombine olarak, bu prosedürler araştırmacıların sinaptikten lokal ağ seviyesine kadar gözlemlenebilir elektrofizyolojik yanıt özelliklerinde uçucu anestezik kaynaklı değişiklikleri ölçmelerini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan hayvanları içeren tüm prosedürler, Wisconsin-Madison Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Halk Sağlığı Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. İnternöron alt popülasyonlarında floresan muhabir proteinini eksprese etmek için farelerin yetiştirilmesi
- Homoziyog, Cre'e bağımlı tdDomates erkek fareyi homozigot SOM-Cre dişi veya homozigot PV-Cre dişi fare ile eşleştirin.
NOT: Diğer spesifik nöronal popülasyonlar uygun Cre hatları kullanılarak hedeflenebilir. - Heterozigot yavruların devam etmeden önce en az 3 haftaya kadar olgunlaşmasına izin verin. Burada açıklanan deneyler için, homozigot ebeveynler hem hücre tipine özgü Cre rekombinaz hem de Cre'ye bağımlı muhabir alelleri için hepsi heterozigot olan yavrular ürettiğinden, genotipleme gerekli değildir.
2. Viral yapının tek taraflı stereotaksik enjeksiyonunun yapılması
- Enjeksiyon pipetleri için mikropipet çektirme makinesinin ayarlarını, cihaz kullanım kılavuzunda belirtildiği şekilde yapın (önerilen ayarlar için Tablo 1'e bakın). Cam mikropipeti çekin.
- Pipetin keskin ucunun ucunu, uç çapı birkaç milimetrenin üzerinde minimum konik ile yaklaşık 30 μm olacak şekilde kırın.
- Daha önce belgelenmiş prosedürleri kullanarak, enjekte edilecek uygun titreye ve virüs hacmine karar verin. Burada açıklanan deneylerde, enjekte edilen 1.0 μL (titre: 3.1-5.7 TU / mL) tek taraflı olarak iyi sonuçlar vermiştir.
- Pipetin tüm hacmini mineral yağ ile doldurun. Pipetleri mikroşırıngaya yükleyin ve ucun tıkanmadığından emin olmak için uçtan az miktarda mineral yağ akıtın.
- En az 1.0 μL viral yapıyı önden doldurun. Bu deneylerde kullanılan rekombinant adeno ilişkili viral vektör AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP idi.
- Steril örtüyü cerrahi bir alanda düzenleyin. Stereotaksik prosedür için aletleri sterilize edin ve üzümün üzerine yerleştirin.
- İzofluran (indüksiyon için% 3, bakım için% 1.5-2) ve oksijen karışımı kullanarak SOM-tdDomates veya PV-tdDomates heterozigot hayvanını anestezize edin. Ameliyat boyunca ayak parmağı sıkışması ile cerrahi anestezi seviyesini periyodik olarak onaylayın. Her 10-15 dakikada bir solunumu izleyerek hayvanın anestezi cerrahi planının ötesine geçmediğinden emin olun.
- Hayvanın başının üstünü tıraş edin. Membranın kurumasını önlemek için cerrahi bölgeye serbestçe% 70 izopropil alkol ve iyot bazlı çözelti ve göz yuvalarına oftalmik merhem uygulayın. Bupivakain/lidokain (1:1 oranında, 1.0 mg/kg) lokal anestezik için cerrahi bölgeye deri altından uygulanır.
- Hayvanı stereotaksik çerçeveye sığdırın.
- Kafatasının dorsal yüzeyini kaplayan cildin sagital ekseni boyunca kesi yapmak için neşter kullanın. Forseps kullanarak cildi geri çekin. Kafatasını gerektiğinde% 0.9 salin ile nemlendirin.
- Kafatasının yüzeyinde, ön ve yan koordinatların kesişimini kalemde bir haçla hafifçe işaretleyin. Enine düzlemde uygun koordinatlarda bir delik açın (Bregma'ya göre mm cinsinden, singulat korteks (Cg) enjeksiyonu için: anterior 0.2, lateral 0.3; posterior talamus (Po) enjeksiyonu için: posterior 2.25, lateral 3.4).
NOT: İşaretler, pipetin doğru yerleştirilmesi için rehberlik sağlamak amacıyla çapak deliğinin sınırlarının ötesine uzanmalıdır. - Hava tablasını açın ve dengeleyin.
- Stereotaksik çerçevenin elektrot manipülatörünü Cg'ye enjeksiyonlar için 0 ° 'de veya Po'ya enjeksiyonlar için koronal düzlemde 45 ° 'de yeniden konumlandırın.
- Şırınga pompasını elektrot manipülatörüne takın. Mikroşırınga pompası kontrol cihazını şırınga pompasına takın.
- Pipet ucunda, Adım 2.11'de oluşturulan işaretlerin kesiştiği yerde, beynin yüzeyine yakın (ancak dokunmadan) gezinin. Pipetin uzunlamasına ekseni boyunca yaklaşık 1 mm/sn hızla beyne 0,9 mm (Cg'de enjeksiyon) veya 3,1 mm (Po cinsinden enjeksiyon) ilerletin. Devam etmeden önce 10 dakika bekleyin.
- 10 dakikalık (100 nL / dak) bir süre boyunca 1.0 μL viral yapı enjekte edin. Pipet yerleştirme bölgesinden virüs kuyusu yükselirse, enjeksiyon hızını 50 nL / dk'ya kadar yavaşlatın.
- Enjeksiyondan sonra, enjeksiyon pipetini yavaşça geri çekmeden önce 10 dakika bekleyin.
- Kafa derisi insizyonunu kapatmak ve deri altından 2-5 mg / kg meloksikam uygulamak için dikiş.
- İzoflurayı durdurun ve anesteziden çıkma sırasında hayvanı izleyin. Analjeziklerin daha fazla uygulanması da dahil olmak üzere, Kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından açıklanan prosedürlere göre iyileşmeye izin verin.
3. Akut beyin dilimlerinin hazırlanması
- Doku hasadından önce viral yapının ifadesi için en az 3 hafta bekleyin.
- Dilimleme prosedürü için 1 L yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayın (yapay beyin omurilik sıvısının dilimlenmesi, sACSF). Malzemeler için Tablo 2'ye bakınız.
- Dilimleme prosedürü boyunca, sACSF'ye gaz dağılım tüpü aracılığıyla verilen çözünmüş %95 O 2/5% CO2 karışımı sağlayın.
- Titreşimli bıçak mikrotomu için buz gibi soğuk banyo hazırlayın. Buz gibi soğuk numune sahnesini mikrotom üzerine monte edin ve doku kesiti için safir bıçağı yerine sabitleyin.
- Fareyi %3 izofluran ve oksijen ile sağ refleks kaybına kadar uyuşturun.
- Giyotin kullanarak farenin kafasını kesin ve hemen kafayı 4°C sACSF'ye batırın. Dokunun sağlığını korumak için, aşağıdaki adımları mümkün olduğunca çabuk tamamlayın.
- Kafatasının tabanında küçük bir kesi yaparak ve her kafatası plakasını nazikçe çıkararak kafatası boşluğunu açın. Altta yatan dura mater yavaşça çıkarın.
- Beyin hala kafatası boşluğundayken, beyinciği çıkarmak için tıraş bıçağını kullanın. Sol yarımküredeki sagital düzlem boyunca, orta çizgiye yanal olarak ikinci bir dikey kesim yapın.
- Kesitleme için doku bloğu hazırlayın.
- Beyni kafatası boşluğundan yavaşça kaldırın. Beyni düz, sagital düzlem aşağı inecek şekilde filtre kağıdına yerleştirin. Filtre kağıdını engelleme şablonunun üzerine getirin ve beyni altta yatan şablon taslağına hizalayın (Ek Şekil 1).
- Koronal düzlemde, şablondaki çizgilerle gösterildiği gibi iki paralel kesim yapın. Gerekirse filtre kağıdını ıslak tutmak için küçük bir damla sACSF ekleyin.
- Adım 3.8.4 uygulanırken doku bloğunu 4 ° C sACSF'ye kısa bir süre yerleştirin.
- Buz gibi soğuk numune aşamasına az miktarda süper yapıştırıcı uygulayın.
- Doku bloğunu soğuk sACSF'den kaldırın. Fazla sACSF'yi uzaklaştırmak için emici bir havlunun köşesini kullanın. Doku bloğunun arka koronal düzlemini, beynin dorsal yüzeyi safir bıçağa bakacak şekilde numune aşamasına yapıştırın.
- 500 μm kalınlığında koronal beyin dilimleri toplayın. İlgilenilen dilimleri naylon ağ üzerine (Ek Şekil 2) 34 °C sACSF'ye yerleştirin ve kabın oda sıcaklığına ulaşmasını sağlayın.
NOT: Burada açıklanan deneyler için, elektrofizyolojik kayıtlar, birincil olmayan bir duyusal alan olan medial sekonder görsel korteksi (V2MM) incelemek için bregmaya yaklaşık 2.25 mm posterior merkezli bir koronal bölümden toplanmıştır.
4. Çözünmüş uçucu anestezik izofluran içeren deneysel yapay beyin omurilik sıvısı (eACSF) torbalarının hazırlanması
- 300 mL% 3.0 izofluran stok karışımı hazırlayın.
- Kapalı bir politetrafloroetilen gaz torbasında, 20-30 mL sıvı izofluran ve az miktarda% 0.9 salin içine ~ 100 mL% 95 O 2/5% CO2 gaz karışımı ekleyin. İzofluranın sıvı ve gaz fazları arasında dengelenmesine izin vermek için en az 30 dakika bekleyin.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak stok torbasına eklemek için doymuş izofluran gazının, Vsat'ın miktarını belirleyin:
burada P%stock , stok gazının hedef bileşimidir (bu durumda% 3), Vstoğu , stok gaz torbasının son hacmidir, P izofluran, oda sıcaklığındaizofluran'ın kısmi basıncıdır (~ 240 mmHg) ve Ptoplamı atmosferik basınçtır (~ 760 mmHg). - Hesaplanan doymuş gaz miktarını boş bir gaz torbasına ekleyin ve toplam stok torbası hacmini 300 mL'ye getirmek için torbayı% 95 O2/5% CO2 gaz karışımı hacmiyle doldurun.
- Deney sırasında dilimin perfüzyonu için 2 L yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayın (deneysel ACSF, eACSF). Malzemeler için Tablo 2'ye bakınız. %95 O 2/5% CO2 gaz karışımını çözelti içinde çözün.
- İki ayrı Kontrol ve İzofluran çözeltisi torbası hazırlayın.
- Boş bir politetrafloroetilen gaz torbasına 600 mL eACSF ve 600 mL% 95 O2/5% CO2 gaz karışımı ekleyin. Bu torbayı Control olarak etiketleyin.
- Başka bir boş politetrafloroetilen gaz torbasına, 300 mL eACSF ekleyin. Bu torbayı İzofluran olarak etiketleyin.
- İzofluranın fizyolojik olarak ilgili dengelenmiş gaz fazı konsantrasyonunu seçin. Deneyler,% 1.3 izoflurana eşdeğer gaz konsantrasyonları kullanılarak gerçekleştirildi. Fareler,% 0.9 solunan izofluranda sağ refleksi ve muhtemelen bilinci kaybeder.
- Oda sıcaklığında eşdeğer gaz fazı konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın, P%(Todası)31:
burada P%(Tcismi) Adım 4.3.3'te seçilen fizyolojik olarak ilgili gaz fazı konsantrasyonudur, Todası 25 °C ve Tcismi 37 °C'dir. - İzofluran çözeltisine eklemek için stok gaz torbasından, Vstokundan gaz hacmini belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın.
burada Vçözeltisi ISOFLURAN torbasındaki eACSF'nin hacmidir (300 mL), denklem (2)'den P% (Todası) girilir, λ, izofluran'ın salin / gaz Ostwald bölme katsayısıdır (λ = 1.232) ve P% stock, stok gaz torbasının gaz fazı konsantrasyonudur (P% stock =% 3.0). - İzofluran çözelti torbasına, Adım 4.3.5'te hesaplanan stok gaz torbasından, Vstokundan gelen gaz hacmini ekleyin.
- İzofluran çözelti torbasına, İzofluran çözelti torbasındaki toplam gaz hacmini 300 mL'ye getirmek için% 95O 2/5% CO2 gaz karışımı hacmini ekleyin.
- İzofluran faz dengesine izin vermek için hem Kontrol hem de İzofluran torbalarını çalkalayıcı üzerinde en az 1 saat çalkalayın.
- Tüm veriler toplandıktan sonra, torbada kalan çözeltinin üzerindeki izofluran'ın dengelenmiş gaz konsantrasyonunu ölçmek için anestezik bir gaz monitörü kullanılarak doğru konsantrasyon doğrulanabilir.
- Uçucu gazların deneysel konsantrasyonlarını sulu birimlerde raporlayın, çünkü milimolar konsantrasyonlar sıcaklıktaki değişikliklere karşı daha dayanıklıdır. Oda sıcaklığındaki gaz faz konsantrasyonunu P%(Todası) eşdeğer sulu konsantrasyona (Csulu, mM cinsinden)31'e dönüştürmek için aşağıdaki denklemi kullanın:
burada α, 25 ° C 32'de izofluran için tuzlu / gaz Bunsen bölmekatsayısıdır.
5. Çok kanallı kayıtlar için donanım ve yazılım hazırlanması
- Üretici talimatlarına göre 16 kanallı veri toplama sistemi kurun.
NOT: Çok kanallı kayıtları toplamak için piyasada bulunan çeşitli amplifikatörler ve veri toplama sistemleri kullanılabilir. Burada açıklanan deneylerde, analog sinyaller bir elektrot referans paneli aracılığıyla iki amplifikatöre iletilir, burada yükseltilir (2000x) ve filtrelenir (0.1-10kHz). Veri toplama sistemine analog girişler 40kHz'de sayısallaştırılmıştır. - Uygun 16 kanallı baş ucu adaptörünü bir mikroskop mikromanipülatörüne sabitleyin. Adaptörü, dişi konektör bağlantı noktaları aşağı bakacak şekilde yönlendirin.
- Bu mikromanipülatörün çalışma açısını, yataya göre yaklaşık 70 ° 'lik bir açıyla kayıt odasına doğru aşağı doğru yönlendirilecek şekilde ayarlayın.
- Mikromanipülatöre tutturulmuş baş adaptörü aracılığıyla in vitro elektrofizyoloji için headstage girişini 16 x 1 proba bağlayın.
- Headstage çıkış konnektörünü veri toplama sistemine bağlayın.
- Veri toplama için uygun yazılımı yükleyin. İlk 15 çok kanallı prob kontağından gelen giriş sinyallerine karşılık gelecek şekilde 15 giriş kanalı yapılandırın. Kalan kanalı, hücre içi elektrottan giriş alacak şekilde yapılandırın.
NOT: Uygun sinyalin toplandığı elektrot temasına karşılık geldiğinden emin olmak için veri toplarken ve analiz ederken elektrot ve adaptör haritalarını dikkate almaya özen gösterin.
6. Işık stimülasyon protokollerinin yapılandırılması
- Işık dağıtım sistemini kurun ve beraberindeki yazılımı yükleyin.
- Yazılımı açın. Bir Tetik Kaynağının (Dijital/TTL Çıkışı) ışık dağıtım sistemine Tetikleyici Giriş sinyali sağladığı ve ışık dağıtım sisteminin 470 nm LED'e Tetik Çıkış sinyali sağladığı donanım kablolama yapılandırmasını seçin.
- Yüksek güçlü objektif lensi takın. Dijital kamerayı kullanarak, ışık dağıtım sistemiyle kullanım için yüksek güçlü hedefi kalibre edin.
- Işık stimülasyon profillerinin yeni profil dizisini oluşturun.
- Tercih ettiğiniz bir desen oluşturun. Burada açıklanan deneylerde, akson terminallerinin katmana özgü aktivasyonuna izin vermek için 150 μm çapında bir daire kullanılmıştır.
- Bir profil dizisi oluşturmak için, herhangi bir sayıda denemenin her biri için bu profili kopyalayıp yapıştırın.
- Herhangi bir ışık yoğunluğunun, darbe süresinin veya darbe sayısının dalga formlarını içeren bir dalga formu listesi oluşturun.
- Her profile rastgele dalga formları atayın. Atanmış dalga formuna sahip her profil, bir Dijital TTL girişinden veya bir denemeden bir tetikleyici darbeye karşılık gelir.
- Profil sırasını kaydedin.
- Veri toplama yazılımında yeni bir protokol oluşturun.
- Deneme sayısını, yeni oluşturulan profil dizisindeki profil sayısına eşit olacak şekilde ayarlayın.
- Adım 5.6'da yapılandırılanlarla eşleşmesi için sinyal girişlerini seçin. Tek bir dijital TTL çıkışı sağlayan, dijital tetikleyiciden önce ve sonra uygun bir süre boyunca bu 16 giriş kanalından kayıt yapan bir protokol yapılandırın.
7. Çok kanallı probun ex vivo beyin dokusu dilimine yerleştirilmesi
- Perfuse kabarcıklı eACSF (kapalı torbalarda değil) 3-6 mL/dak'da.
- İlgi alanını içeren beyin dilimini mikroskop perfüzyon odasındaki ağ ızgarasına aktarın. Platin arp ile çapa yapın (bakınız Ek Şekil 3).
- Ağ ızgarasını, çok kanallı probun distal ucundaki elektrot temas çizgisi pial yüzeye yaklaşık olarak dik olacak şekilde döndürün.
- Geniş alan aydınlatması altında ve mikromanipülatörün ince kontrolü altında, çok kanallı probu dilimin yüzeyine doğru indirin.
- Kortikal afferentlerin akson terminallerinde ifade edilen floresan raporlayıcı proteininin görselleştirilmesi için uygun filtre küpünü devreye sokmak üzere filtre küpü taretini döndürün. Gerekirse, probu pial yüzeyle daha hassas bir şekilde hizalamak için dilimi döndürün.
- Probu, dilimin düzleminin hemen üstüne, x ekseni boyunca nihai hedef konumdan ~ 200 μm kısa bir mesafede, kaydedilen doku alanının sınırının dışında en az bir kanal bırakarak konumlandırın
- Manipülatörü uzunlamasına ekseni boyunca hareket ettirerek probu yavaşça dilime yerleştirin. Dokuya verilen hasarı en aza indirmek için, probu yalnızca keskin uçların doku yüzeyinin hemen altında görülebildiği ölçüde ilerletin. Bu, elektrot kontaklarının doku ile temas halinde olmasını sağlarken dokuya verilen hasarı en aza indirecektir.
8. Hedeflenen nöronları sıkıştıran ve tüm hücre konfigürasyonunu elde eden yama
- eACSF kaynağını torbalı Kontrol çözümüne geçirin.
- Hedeflenen yama kelepçesi kaydı için floresan etiketli hücreyi tanımlayın.
- Diyafram iris diyaframını en küçük çapla sınırlayın. Düşük güçlü objektif bir lens takın ve dokuyu odaklayın.
- Işığı, çok kanallı proba bitişik (ancak üst üste binmeyen) bir doku alanı üzerinde ortalayın.
- Çok kanallı prob ile objektif lens arasındaki teması önlemek için dikkatli davranarak yüksek güçlü (40x veya 60x) suya daldırma hedefini kullanın.
- Cre'ye bağımlı floresan işaretleyiciyi ifade eden hücrelerin görüntülenmesine izin verecek şekilde uygun filtre setini devreye sokmak için filtre küpü taretini döndürün.
- Floresan olarak etiketlenmiş bir hücreyi yama kelepçesi kaydı için hedef olarak tanımlayın. Bir yama pipetini indirmek üzere geniş alan oluşturmak için objektif lensi kaldırın.
- Dahili çözeltili (Tablo 2) bir yama pipeti (bkz. Tablo 1) takın ve pipeti elektrot tutucuya monte edin. 1 mL şırınga kullanarak, ~ 0.1mL havaya karşılık gelen pozitif basınç uygulayın.
- Yama pipetini çözeltiye indirin. Pipet ucunu görsel rehberlik altında odaklayın.
- Daha önce gösterilen adımları kullanarak hedeflenen hücreden tüm hücre kaydını elde edin33.
- Hücrenin içsel özelliklerindeki değişiklikleri (örneğin, giriş direnci, mevcut adımlara yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşleme hızı) değerlendirmeyi planlıyorsanız, bu kayıtları yapın. Aksi takdirde, aşağıdaki akson stimülasyon protokolüne geçin.
9. Akson terminallerinin katmana özgü optogenetik aktivasyonu
- Işık stimülasyon profilini dilim üzerinde istenen konumla hizalamak için x-y düzlemindeki görüş alanını değiştirin.
- Işık uyaran protokolünü yükleyin ve ışık dağıtım sistemini dijital bir TTL darbesi almaya hazırlayın.
- Akson terminallerini optogenetik olarak aktive ederken aynı anda hücre dışı alan potansiyellerini ve hücre içi membran dalgalanmalarını kaydeder.
- eACSF kaynağını İzofluran çözeltisine geçirin ve ilacı 15 dakika boyunca yıkayın. Gerekirse, yıkama sırasında kendiliğinden kayıtlar toplayın.
- Adım 9.2-9.3'ü yineleyin.
- eACSF kaynağını Kontrol çözeltisine geçirin ve ilacı 20 dakika boyunca yıkayın. Gerekirse, yıkama sırasında kendiliğinden kayıtlar toplayın.
- Adım 9.2-9.3'ü yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolde açıklanan adımların zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Daha yüksek dereceli kortikal alanlardan veya primer olmayan talamik çekirdeklerden gelen kortikal girdiler, primer olmayan görsel korteks24'ün 1. katmanında kısmen örtüşen terminal alanlarına sahiptir. Bağımsız talamokortikal veya kortikokortikal afferent yolları izole etmek için, ChR2 içeren bir viral vektör ve Po veya Cg'ye bir eYFP floresan muhabiri enjekte edildi. Enjeksiyon yarıçapı içindeki hücreler viral vektörü alır ve 2-4 hafta sonra, spesifik olmayan katyon kanalı ChR2'yi ve muhabiri hem soma hem de çıkıntılı aksonlar içinde eksprese eder (Şekil 2A). Koronal dilimler toplandı. Uygun filtre küpü devreye alındığında, viral yapıyı ifade eden aksonlar görüntülendi (Şekil 2B). Akson terminallerini etkinleştirmek için ChR2'nin kullanılması, bağlı bir soma için ön koşul olmadan afferentlerin aktivasyonuna izin verir.
Burada açıklanan deneylerde kullanılan hayvanlar, sırasıyla somatostatin- (SOM +) veya parvalbümin-pozitif (PV +) internöronlarında floresan muhabir protein tdDomates ekspresyonunu ifade eden SOM-tdDomates veya PV-tdDomates melez hayvanlarıydı. Katman 2/3'teki SOM+ veya PV+ internöronları, uygun filtre küpü devreye sokularak (Katman 1C) görsel rehberlik altında yama kelepçelemesi için hedeflenmiştir. Bu internöronlar katman 1'de dendritlere sahiptir ve kortikokortikal girdilerin hedefleridir (Şekil 3A).
Kapalı bir torbaya 125 mL% 3.0 izofluran gazı ve 175 mL% 95 O 2/5% CO2'nin eklenmesi,% 1.3'lük bir ön denge gaz konsantrasyonu ile sonuçlandı. Bölme katsayısına göre eACSF'ye çözünen gaz; oda sıcaklığında izofluran'ın tahmin edilen gaz fazı denge konsantrasyonu% 0.6 idi (Şekil 2D). Bu, gaz monitörü aracılığıyla doğrulandı.
Doku dilimi kayıt odasına transfer edildi ve 16x1 çok kanallı kayıt probu kortikal laminalara ortogonal olarak yerleştirildi (Şekil 2E). Kortikal tabaka 1 üzerinde ortalanmış 470 nm ışıktan oluşan 150 μm'lik bir daire, objektif ışık yolu aracılığıyla iletilirken, hücre dışı alan potansiyelleri 16 x 1 çok kanallı prob kullanılarak toplandı ve hedeflenen tüm hücre yama kelepçesi kayıtları internöronlarda gerçekleştirildi. Kayıt kurulumunun şeması Şekil 2F'de gösterilmiştir.
Post-sinaptik potansiyeller (PSP'ler), dört adet 2 ms ışık darbesinden oluşan bir trene yanıt olarak internöronlarda gözlenmiştir (10 Hz; Şekil 3A). Yerel alan potansiyelleri de kaydedildi (Şekil 3B). Akım kaynağı yoğunluğu (CSD; Şekil 3C) ve çok birimli aktivite (MUA; Şekil 3D) yerel alan potansiyellerinden çıkarıldı. Post hoc analizler yapmak için birkaç farklı ışık yoğunluğunda on deneme kullanıldı. CSD'den çıkarılan akım lavabolarının genliği, ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak artmıştır (Şekil 4A). Üç parametreli doğrusal olmayan bir lojistik denklem, yollar arasında karşılaştırmalar için verilere uygundu. PSP genliği de mevcut lavabo genliği ile artmıştır (Şekil 4B).
Talamokortikal ve kortikokortikal girdilere verilen sinaptik yanıtlar kontrol, izofluran (0.28 mM) ve iyileşme koşulları sırasında ölçüldü. Somatostatin- (Şekil 5A) 'nın kortikokortikal uyaranlara post-sinaptik yanıtları, uyandırılan akım lavaboları gibi izofluran sırasında baskılanmıştır (Şekil 5B).
Şekil 1: Protokoldeki önemli adımların zaman çizelgesini özetleyen şematik bir şema.
Sayfanın Üstü: Transgenik hayvanların üremesi ve viral vektörün ekspresyonu için gerekli adımların zaman çizelgesini açıklar. Dip: Malzeme hazırlama ve dilim hazırlama gününde deney yapma adımlarını ve zaman çizelgesini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Viral vektör enjeksiyonu ve ex vivo koronal beyin dilimlerinin hazırlanması.
(A) Viral vektörün SOM-tdDomates veya PV-tdDomates hibrit farelere enjeksiyonunun şematik gösterimi. (B) Medial parietal ilişki alanının (mPtA) koronal dilimleri hasat edildi ve talamokortikal (üst) veya kortikokortikal (alt) afferent lifler, eYFP muhabirleri tarafından katman 1'de tanımlandı. Bu rakam24'ün izniyle değiştirilmiştir. (C) eYFP etiketli akson terminallerinin katman 1'de (yeşil) ve tdDomates etiketli SOM+ internöronlarının (kırmızı) yüzeysel katman 2/3'te yer alması. (D) Sızdırmaz torbalar 50:50 çözelti-gaz karışımı ile hazırlanmıştır. (E) 16 x 1 probun mPtA'ya yerleştirilmesi (siyah anahat). (F) Kortikal dilimdeki kayıt kurulumunun şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kortikal dilimde eşzamanlı hücre içi ve çok kanallı hücre dışı kayıtlar.
(A) Bir tabaka 2/3 PV+ internöronun soma'sından tüm hücre akım kelepçesi yaması kaydı. 10 Hz'de dört darbe (her biri 2 ms, mavi oklar) 10 Hz'de mavi ışık (2.2 mW) L1'deki kortikokortikal akson terminallerine iletildi. On denemenin (gri izler) ortalama (kırmızı iz) gösterilmiştir. (B) 16 kanallı hücre dışı 16 x 1 probundan elde edilen ham veriler. Kortikal dokuya yerleştirilen kanallar siyah, korteksin dışında kalanlar gri renkte gösterilir. (C) Yerel alan potansiyel sinyalinden çıkarılan bir akım kaynağı yoğunluk diyagramı, katman 1'deki sinaptik akım havuzlarını (mavi) gösterir. (D) Yerel alan potansiyel sinyaline yüksek geçişli bir filtre uygulanarak oluşturulan çok birimli aktivite, alt katmanlarda uyandırılan ani yükselme aktivitesini izole eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İki farklı dilimdeki kayıtlardan gelen yanıtların karşılaştırılması.
Kortikal tabaka 1'de sinaptik yanıtları uyandırmak için çoklu ışık yoğunlukları kullanıldı. Her deneme için, uyarılan yanıtın tepe genliği, katman 1 hücre dışı akım lavabosundan ve katman 2/3 PV + internöronlarındaki EPSP'lerden çıkarıldı. (A) Talamokortikal ve kortikokortikal afferentlerin hücre dışı yanıt profilleri, ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak karşılaştırılır. (B) Mevcut lavabo genliği ile EPSP genliği arasındaki ilişki yola bağlıdır. Her uyaran yolu içinde, (A) ve (B)'den gelen veriler aynı anda toplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Eşzamanlı kayıtlar sırasında eACSF'de çözünen izofluran'ın banyo uygulaması.
(A) Kontrol, izofluran ve yıkama koşulları sırasında kortikokortikal afferentlerin aktivasyonu üzerine katman 2/3 SOM + internörondan hücre içi tüm hücre akımı kelepçesi kaydı. Dikey mavi çizgiler ışık uyaranlarını gösterir (2 ms; 1,65 mW). (B) Katman 1'deki elektrottan ekstrakte edilen akım kaynağı yoğunluğu izi. Veriler (A)'da toplananlarla eş zamanlı olarak toplanmıştır. Yıkama üzerine yanıtların geri kazanılması, izofluran tarafından sinaptik yanıtların depresyonunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Virüs enjeksiyonu için mikropipet | ||||
| Cam | İç çap: 0.05 mm, Dış Çap: 0.11 mm | |||
| Döngü | 1 | |||
| Isı | Çekmek | Vel | Saat | Basınç |
| Rampa + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Tüm hücre yama kelepçesi kayıtları için mikropipet | ||||
| Cam | İç çap: 1.1 mm, Dış Çap: 1.7 mm | |||
| Döngü | 4 | |||
| Isı | Çekmek | Vel | Saat | Basınç |
| Rampa | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tablo 1: Viral enjeksiyonlar ve tüm hücre yama kelepçesi kayıtları için mikropipetlerin çekilmesi için önerilen cam ve parametreler. Viral enjeksiyonlar ve tüm hücre yama kelepçesi kayıtları için kullanılan camın yanı sıra mikropipet çektirme makinesi kullanılarak mikropipetlerin çekilmesi için parametreler açıklanmaktadır. Daha fazla öneri veya ayarların ince ayarı için mikropipet çektirici kullanım kılavuzlarına bakın.
| Dilimleme ACSF, sACSF (mM cinsinden) | Deney ACSF, eACSF (mM cinsinden) | |
| Arjantin | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| Kartal | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSOSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glikoz | 10 | 10 |
| Dahili Çözüm | ||
| K-glukonat | 140 | |
| Arjantin | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| cesaret | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tablo 2: Yapay beyin omurilik sıvısı ve hücre içi çözeltinin bileşimi. Yama kelepçesi kayıtları için sACSF, eACSF ve hücre içi pipet çözeltisi için reaktifler ve konsantrasyonlar listelenmiştir.
Ek Şekil 1: Beyin dilimlerini toplamak için doku bloğu hazırlamak için şablon. Şablon uygun boyuta ayarlanır, yazdırılır ve mikroskop slaydına yapıştırılır. Kullanımını uzatmak için şablonun üzerine bir kapak fişi yapıştırılır. Doku bloğu, sagital düzlem aşağıda, pembe arka plana hizalanmış bir filtre kağıdı parçası üzerine yerleştirilir ve siyah çizgi boyunca koronal düzlemde dikey bir kesim yapılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Hasat edilen beyin dilimleri için kuluçka odası. Hazne sACSF ile doldurulur ve boruya tutturulmuş bükülmüş bir iğne aracılığıyla% 95 O2/5% CO2 gaz karışımı ile kabarcıklanır. Kuluçka platformu, plastik dairesel bir bağlantı parçası üzerine gerilmiş naylondan yapılmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Kayıt odasındaki dilim için platin yapılar. Beyin dilimi, pipet aracılığıyla kayıt odasına aktarılır ve at nalı şeklinde düzleştirilmiş platin tel parçası üzerine gerilen ve yerine süper yapıştırılmış naylon ağın üzerine yerleştirilir. Platin arp, kayıt sırasında yerine sabitlemek için beyin diliminin üzerine yerleştirilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Diğer uçucu anestezikler için Ostwald (λ) ve Bunsen (α) katsayıları. Bu protokolü, halotan, sevofluran veya desfluran gibi diğer uçucu gaz anesteziklerinin incelenmesi için uyarlayın. Protokolde açıklanan denklemleri, bu tabloda listelenen uygun katsayılarla değiştirin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, ex vivo beyin dilimlerinde seçici olarak aktive olmuş afferent yollara intra ve hücre dışı yanıtları değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.
Optogenetik araçların ve paralel kayıt şemalarının kullanılması, araştırmacıların yerel popülasyonların uzak beyin bölgelerinden gelen afferent girdilere verdikleri yanıtları araştırmalarına izin verirken, aynı anda hedeflenen internöron popülasyonlarından kayıt yapmalarını sağlar. Optogenetik teknolojinin kullanımı, afferent projeksiyonların akson terminallerinin, hücre gövdeleri artık bağlı olmasa bile korunmasını ve aktive edilmesini sağlar. Bu, daha önce ex vivo dilimlere uygulanan geometrik kısıtlamaları hafifletir, çünkü uzun menzilli elektrik bağlantılarının korunması artık çok önemli değildir. Yine de, dilimleri kalan ilgi alanlarını koruyan geometrik bir düzlemde hazırlamaya özen gösterilmelidir. Örneğin, piramidal hücreler kortikal sütun boyunca dikey olarak yönlendirilir ve bu deneylerde çok kanallı problar tarafından ölçülen uyarılmış ağ aktivitesi, bu tür yerel bağlantıların mümkün olduğunca korunmasını gerektirir. Böylece, yerel bağlantıyı sağlam tutmak için koronal dilimler hazırlandı.
Optogenetik yapıları ve ilgili floresan muhabir proteinleri seçerken, uyarma / emisyon spektrumlarının ve mikroskobik optiklerinin özellikleri göz önünde bulundurulmalıdır. Kalıcı ışık stimülasyonu, birçok channelrhodopsin varyantının34 kısmi inaktivasyonuna neden olabilir; bu, uyarma spektrumları opsininkiyle örtüşmeyen muhabir proteinleri seçilerek önlenebilir. Alternatif uyarıcı veya inhibitör opsinler kullanan manipülasyonlar da dahil olmak üzere deneysel paradigma35'e bağlı olarak farklı kinetik veya ışık hassasiyetlerine sahip alternatif varyantlar da seçilebilir. Filtre küpleri ayrıca seçilen floresan muhabirlerle uygun şekilde hizalanmalıdır, böylece afferent akson terminalleri veya internöronlar bağımsız olarak ve eksprese opsinleri aktive etmeden görüntülenebilir. Virüs ekspresyonundaki değişkenliği hesaba katmak için, araştırmacıların optogenetik olarak indüklenen herhangi bir aktiviteyi, muhabir proteinin floresan çıktısı ile ölçülen viral yapının ekspresyon seviyesine normalleştirmeleri de uygun olabilir.
Önceden hesaplanmış uçucu anestezik konsantrasyonlarının dokuyu dilimlemek için verilmesi de burada özetlenen yöntemler kullanılarak mümkündür. Fizyolojik olarak ilgili uygun gaz dengesi yüzdelerini seçerken, araştırmacılar perfüzyon hattı ile doku arasındaki çözünmüş izofluran gazının% 10-15 kaybını hesaba katmalıdır36. İzofluran için geçerli yöntemler sunulmuştur, ancak halotan, sevofluran veya desfluran gibi diğer ilaçlar uygun Ostwald ve Bunsen katsayıları kullanılarak benzer şekilde ele alınabilir (Ek Tablo 1). Uçucu anesteziklerin bölümleme özellikleri, öngörülebilir bir şekilde ACSF'ye çözüneceklerini garanti eder. Bununla birlikte, kısmi basınçlar sıcaklıktaki değişikliklere karşı sulu EC50 konsantrasyonlarından37'den daha hassas olduğundan, uçucu anesteziklerin gaz dengesi hacim yüzdeleri, gözlemlenen etkileri fizyolojik olarak ilgili dozlarla in vivo olarak karşılaştırmak için tahmin edilen oda sıcaklığı milimolar konsantrasyonlarına dönüştürülmelidir. Beyin dilimlerinde etomidat veya propofol gibi intravenöz anestezikleri incelemeyi tercih ediyorlarsa, araştırmacılar incelenen ilaçların difüzyon profillerini göz önünde bulundurmalıdır, çünkü denge süreleri ve fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlar büyük ölçüde değişebilir30.
Bu yazıda, uçucu anesteziklerin ex vivo beyin dilimlerinde talamokortikal devrelerin farklı bileşenleri üzerindeki etkilerini test etmek için bir protokol tanımlanmıştır. Açıklanan yöntemlerdeki değişkenlerin ve parametrelerin çoğu, daha ileri araştırmalar için manipüle edilebilir. Örneğin, farklı beyin alanları, afferent yollar, hücre hedefleri veya uçucu anestezikler, yeni soruları cevaplamak için ana hatlarıyla belirtilen yöntemleri uyarlayarak incelenebilir. Diğer teorik ve deneysel yöntemlerle birleştirildiğinde, ex vivo beyin dilimleri kullanılarak benzersiz hücresel ve ağ bileşenlerinin incelenmesi, dinamik beyin hakkındaki anlayışımızı ve bilinçteki farmakolojik ve patofizyolojik değişiklikler sırasında geçirdiği değişiklikleri geliştirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Bryan Krause'a bu projedeki teknik destek ve rehberlik için teşekkür eder.
Bu çalışma Uluslararası Anestezi Araştırma Derneği (IMRA'dan AR'ye), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM109086'dan MIB'ye) ve Wisconsin Üniversitesi, Madison, WI, ABD Tıp Fakültesi ve Halk Sağlığı Anesteziyoloji Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
