Summary
Ex vivo hjerneskiver kan brukes til å studere effekten av flyktige anestetika på fremkalte responser på afferente innganger. Optogenetikk brukes til uavhengig aktivering av thalamokortikale og kortikokortikale afferenter til ikke-primær neocortex, og synaptiske og nettverksresponser moduleres med isofluran.
Abstract
Anestesi påvirker bevisstheten delvis via deres handlinger på thalamokortiske kretser. Imidlertid er det uklart i hvilken grad flyktige anestetika påvirker forskjellige cellulære og nettverkskomponenter i disse kretsene. Ex vivo hjerneskiver gir et middel som etterforskere kan undersøke diskrete komponenter i komplekse nettverk og disentangle potensielle mekanismer som ligger til grunn for effekten av flyktige anestetika på fremkalte responser. For å isolere potensielle celletype- og veispesifikke legemiddeleffekter i hjerneskiver, må etterforskere uavhengig kunne aktivere afferente fiberveier, identifisere ikke-overlappende populasjoner av celler og anvende flyktige anestetika til vevet i vandig løsning. I denne protokollen beskrives metoder for å måle optogenetisk fremkalte responser på to uavhengige afferente veier til neocortex i ex vivo hjerneskiver. Ekstracellulær respons registreres for å analysere nettverksaktivitet, og målrettede opptak av helcelleplaster utføres i somatostatin- og parvalbuminpositive internevroner. Levering av fysiologisk relevante konsentrasjoner av isofluran via kunstig cerebral spinalvæske for å modulere celle- og nettverksresponser er beskrevet.
Introduction
Flyktige anestetika har blitt brukt allestedsnærværende i en rekke kliniske og akademiske innstillinger i mer enn et århundre. Distinkte klasser av anestetika har unike, ofte ikke-overlappende molekylære mål 1,2,3, men nesten alle produserer bevisstløshet. Mens deres atferdsmessige effekter er ganske forutsigbare, er mekanismene som anestetika induserer bevissthetstap stort sett ukjente. Anestesi kan i siste instans påvirke både bevissthetens nivå og innhold via handlinger på kortikothalamiske kretser, forstyrre integrering av informasjon i hele det kortikale hierarkiet 4,5,6,7,8,9. Mer generelt kan modulering av kortikothalamiske kretser spille en rolle i eksperimentelt 10 eller farmakologisk11 endrede bevissthetstilstander, og kan også være involvert i søvn 12 og i patofysiologiske bevissthetsforstyrrelser13,14.
Unnvikelsen av mekanismene som ligger til grunn for tap og retur av bevissthet under anestesi kan delvis tilskrives ikke-lineære, synergistiske virkninger av anestetika på mobil-, nettverks- og systemnivå15. Isofluran undertrykker for eksempel aktivitet innenfor de utvalgte hjernegruppene 16,17,18, svekker forbindelsen mellom fjerne hjernegrupper 19,20,21,22,23, og reduserer synaptiske responser på en banespesifikk måte 24,25 . Hvilke effekter av anestetika, fra molekylært til systemnivå, som er nødvendige eller tilstrekkelige for å påvirke bevissthetstap, er fortsatt uklart. I tillegg til materielle kliniske undersøkelser av bevissthet ved hjelp av ikke-invasive teknikker 19,20,26, er det viktig at eksperimentalister søker å disentangle de distinkte mobil- og nettverksinteraksjonene som underordner den bevisste opplevelsen.
Ved å forenkle de komplekse interaksjonene som finnes i den intakte hjernen, tillater ex vivo hjerneskiver studiet av isolerte komponenter i hjernens dynamiske systemer9. Et redusert skivepreparat kombinerer fordelene med relativt intakte anatomiske strukturer av lokale nevrale kretser med allsidigheten til in vitro-manipulasjoner. Imidlertid har metodologiske begrensninger inntil nylig utelukket studiet av synaptiske og kretsegenskaper av langdistanseinnganger i hjerneskiver27,28; Den tortuøse banen til kortikothalamiske fiberkanaler gjorde aktivering av uavhengige afferente veier nesten umulig ved elektrisk stimulering.
Å undersøke effekten av bedøvelsesmidler på hjerneskivepreparatene gir ytterligere utfordringer. I fravær av intakt respirasjons- og sirkulasjonssystem, må bedøvelsesmidler påføres bad, og konsentrasjonene må nøye tilpasses estimerte konsentrasjoner på effektstedet. For mange intravenøse bedøvelsesmidler gjør den langsomme likevektshastigheten i vevet tradisjonelle farmakologiske undersøkelser arbeidskrevende29,30. Å undersøke effektene av flyktige gassbedøvelsesmidler i ex vivo-preparater er mer trekkbar, men gir også utfordringer. Disse inkluderer konvertering av inhalerte partialtrykksdoser til vandige konsentrasjoner, og behovet for et modifisert leveringssystem av legemidlet til vevet via kunstig cerebral spinalvæske31.
Her beskrives metoder der forskere kan utnytte de veldokumenterte fysisk-kjemiske egenskapene til det flyktige bedøvelsesmiddelet isofluran for legemiddellevering til ex vivo hjerneskiver, aktivere vei- og lagspesifikke innganger til et kortikalt interesseområde med høy spatiotemporal oppløsning, og gjennomføre samtidige laminære opptak og målrettede patchklemmeopptak fra utvalgte populasjoner av nevroner. Kombinert tillater disse prosedyrene etterforskere å måle flyktige bedøvelsesinduserte endringer i flere observerbare elektrofysiologiske responsegenskaper, fra synaptisk til lokalt nettverksnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr beskrevet i denne protokollen ble godkjent av University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health Animal Care and Use Committee.
1. Avl av mus for å uttrykke fluorescerende reporterprotein i interneuron subpopulasjoner
- Par homozyogous, Cre-avhengig tdTomato mannlig mus med enten homozygot SOM-Cre kvinnelig eller homozygot PV-Cre kvinnelig mus.
MERK: Andre spesifikke nevronpopulasjoner kan målrettes ved å bruke de riktige Cre-linjene. - La heterozygote avkom modnes til minst 3 ukers alder før du fortsetter. For eksperimenter beskrevet her, er genotyping ikke nødvendig, da homozygote foreldre produserer avkom som alle er heterozygote for både celletypespesifikke Cre-rekombinase og Cre-avhengige reporteralleler.
2. Utføre ensidig stereotaksisk injeksjon av viral konstruksjon
- Juster innstillingene til mikropipettetrekkeren for injeksjonspipetter som angitt i instrumentets brukerhåndbok (se tabell 1 for anbefalte innstillinger). Trekk glassmikropipetten.
- Bryt spissen av den skarpe enden av pipetten slik at spissdiameteren er ca. 30 μm med minimal avsmalnning over flere millimeter.
- Ved hjelp av tidligere dokumenterte prosedyrer, bestem deg for hvilken titer og volum av virus som skal injiseres. I forsøkene beskrevet her, ga 1,0 μL (titer: 3,1-5,7 TU/ml) injisert ensidig gode resultater.
- Fyll hele volumet av pipetten med mineralolje. Legg pipetten på mikrosprøyten og tilfør en liten mengde mineralolje gjennom spissen for å sikre at spissen ikke er tilstoppet.
- Frontfyll minst 1,0 μL viral konstruksjon. Den rekombinante adenoassosierte virale vektoren som ble brukt i disse eksperimentene var AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Ordne steril drapering i et kirurgisk område. Steriliser verktøy for stereotaksisk prosedyre og legg den på draperingen.
- Bedøv SOM-tdTomato eller PV-tdTomato heterozygot dyr ved bruk av isofluran (3% for induksjon, 1,5-2% for vedlikehold) og oksygenblanding. Bekreft periodisk kirurgisk nivå av anestesi med tåklemme gjennom hele operasjonen. Sørg for at dyret ikke beveger seg utover den kirurgiske anestesiplanen ved å overvåke respirasjoner hvert 10-15 minutt.
- Barber toppen av dyrets hode. Påfør 70% isopropylalkohol og jodbasert løsning liberalt på kirurgisk område og oftalmisk salve til øyekontakter for å forhindre tørking av membranen. Administrer bupivakain/lidokain (1:1-forhold, 1,0 mg/kg) subkutant til operasjonsstedet for lokalbedøvelse.
- Monter dyret i stereotaksisk ramme.
- Bruk skalpell til å lage snitt langs sagittal akse av hud som ligger over den dorsale overflaten av skallen. Trekk inn huden ved hjelp av tang. Hydrat skallen med 0,9% saltvann etter behov.
- På overflaten av skallen markerer du lett krysset mellom fremre og laterale koordinater med et kryss i blyant. Bor et hull på passende koordinater i tverrplanet (i mm i forhold til Bregma, for cingulate cortex (Cg) injeksjon: fremre 0,2, lateral 0,3; for bakre thalamus (Po) injeksjon: bakre 2,25, lateral 3,4).
MERK: Merkingen bør strekke seg utover grensene til burrhullet for å gi veiledning for nøyaktig plassering av pipette. - Slå på og balanser luftbordet.
- Flytt elektrodemanipulatoren av den stereotaksiske rammen ved 0° for injeksjoner i Cg, eller 45° i koronalplanet for injeksjoner i Po.
- Fest sprøytepumpen til elektrodemanipulatoren. Fest mikrosprøytepumpekontrolleren til sprøytepumpen.
- Naviger pipettespissen nær (men ikke berøre) overflaten av hjernen, i skjæringspunktet mellom markeringer som er opprettet i trinn 2.11. Før pipetten ca. 1 mm/s langs lengdeaksen inn i hjernen, enten 0,9 mm (injeksjon i Cg) eller 3,1 mm (injeksjon i Po). Vent i 10 min før du fortsetter.
- Injiser 1,0 μL viral konstruksjon over en periode på 10 min (100 nL/min). Hvis det observeres velvære av virus fra pipetteinnstikksstedet, reduseres injeksjonshastigheten til 50 nL/min.
- Etter injeksjon, vent i 10 minutter før du sakte trekker injeksjonspipetten.
- Sutur for å lukke snittet i hodebunnen og administrere 2-5 mg/kg meloksikam subkutant.
- Seponer isofluran og overvåk dyr under anestesi. Tillat gjenoppretting i henhold til prosedyrer beskrevet av institusjonens dyrepleie- og brukskomité, inkludert videre administrering av smertestillende midler.
3. Forberedelse av akutte hjerneskiver
- Tillat minst 3 uker for uttrykk for viral konstruksjon før høsting av vev.
- Forbered 1 liter kunstig cerebral spinalvæske for skiveprosedyre (skiver kunstig cerebral spinalvæske, sACSF). Se tabell 2 for ingredienser.
- Gjennom hele skiveprosedyren tilføres sACSF med oppløst 95% O 2/5% CO2 -blanding, levert via gassdispersjonsrør.
- Forbered iskaldt bad for vibrerende bladmikrotom. Monter iskaldt prøvetrinn på mikrotom og fest safirblad på plass for vevsseksjonering.
- Bedøv mus med 3% isofluran og oksygen til tap av rettingsrefleks.
- Halshugg musen med giljotin og senk hodet umiddelbart i 4 °C sACSF. For å bevare vevets helse, fullfør følgende trinn så raskt som mulig.
- Åpne skallehulen ved å lage et lite snitt ved bunnen av skallen og forsiktig fjerne hver skalleplate. Fjern forsiktig underliggende dura mater.
- Mens hjernen fortsatt er i skallehulen, bruk barberbladet til å fjerne lillehjernen. Lag et andre vertikalt kutt langs sagittalplanet i venstre halvkule, like lateralt til midtlinjen.
- Forbered vevblokk for seksjonering.
- Løft hjernen forsiktig fra skallehulen. Plasser hjernen på filterpapiret med det flate, sagittale planet nede. Før filterpapiret over blokkeringsmalen og juster hjernen til den underliggende maloversikten (supplerende figur 1).
- Lag to parallelle kutt i koronaplanet som angitt av linjene på malen. Tilsett en liten dråpe sACSF for å holde filterpapiret vått, om nødvendig.
- Plasser vevsblokken i 4 °C sACSF kort mens trinn 3.8.4 utføres.
- Påfør en liten mengde superlim på det iskalde prøvestadiet.
- Løft vevsblokken fra kald sACSF. Bruk hjørnet av et absorberende håndkle for å transportere bort overflødig sACSF. Lim det bakre koronale planet av vevsblokken til prøvetrinnet, med hjernens dorsale overflate vendt mot safirbladet.
- Samle 500 μm tykke koronale hjerneskiver. Plasser skiver av interesse på nylonnett (supplerende figur 2) i 34 °C sACSF og la beholderen nå romtemperatur.
MERK: For eksperimenter beskrevet her, ble elektrofysiologiske opptak samlet fra en koronal seksjon sentrert omtrent 2,25 mm bakre til bregma for å studere et ikke-primært sensorisk område, medial sekundær visuell cortex (V2MM).
4. Fremstilling av eksperimentelle poser med kunstig cerebral spinalvæske (eACSF) som inneholder oppløst flyktig bedøvelsesmiddel isofluran
- Forbered 300 ml av en stamblanding på 3,0% isofluran.
- I en forseglet polytetrafluoretylen gasspose, tilsett ~ 100 ml 95% O 2/5% CO2 gassblanding til 20-30 ml flytende isofluran og en liten mengde 0,9% saltvann. Vent minst 30 minutter for å tillate likevekt av isofluran mellom væske- og gassfaser.
- Bestem mengden mettet isoflurangass,V-lør, for å legge til lagerposen ved hjelp av følgende ligning:
der P%lager er målsammensetningen til stamgassen (3 % i dette tilfellet), V-lager er det endelige volumet av stamgassposen, P isofluran er partialtrykket tilisofluran ved romtemperatur (~240 mmHg), og Ptotalt er atmosfæretrykket (~760 mmHg). - Tilsett den beregnede mengden mettet gass i en tom gasspose og fyll posen med et volum på 95% O 2/5% CO2 gassblanding for å bringe det totale volumet av lagerpose til 300 ml.
- Forbered 2 liter kunstig cerebral spinalvæske for perfusjon av skiven under forsøket (eksperimentell ACSF, eACSF). Se tabell 2 for ingredienser. Oppløs 95% O 2/5% CO2 gassblanding i oppløsning.
- Klargjør to separate poser med kontroll- og isofluranoppløsninger.
- Til en tom polytetrafluoretylen gasspose, tilsett 600 ml eACSF og 600 ml 95% O 2/5% CO2 gassblanding. Merk denne posen som Control.
- Til en annen tom polytetrafluoretylengasspose, tilsett 300 ml eACSF. Merk denne posen som Isofluran.
- Velg en fysiologisk relevant likevektig gassfasekonsentrasjon av isofluran. Forsøkene ble utført med gasskonsentrasjoner tilsvarende 1,3 % isofluran. Mus mister rettingsrefleks, og antagelig bevissthet, ved 0,9% inhalert isofluran.
- Bruk følgende ligning for å beregne ekvivalent gassfasekonsentrasjon ved romtemperatur, P% (T-rom) 31:
der P%(T-legemet) er den fysiologisk relevante gassfasekonsentrasjonen valgt i trinn 4.3.3,T-rom er 25 °C ogT-legeme er 37 °C. - Bruk følgende ligning for å bestemme volumet av gass fra lagergasspose,V-lager, for å legge til isofluranoppløsningen.
derV-løsning er volumet av eACSF i ISOFLURANPOSEN (300 ml), P%(T-rom) legges inn fra ligning (2), λ er saltvann/gass Ostwald-partisjonskoeffisienten til isofluran (λ = 1,232), og P%lager er gassfasekonsentrasjonen til stamgassposen (P%stock = 3,0%). - Til isofluranoppløsningsposen tilsettes volumet av gass fra lagergassposen, Vlager, beregnet i trinn 4.3.5.
- Tilsett et volum på 95 % O 2/5 % CO2 gassblanding for å bringe det totale volumet av gass i isofluranoppløsningsposen til 300 ml.
- Rist posene med Control og Isofluran på shakeren i minst 1 time for å muliggjøre likevekt i isofluranfasen.
- Etter at alle data er samlet inn, kan riktig konsentrasjon verifiseres ved å bruke en bedøvelsesgassmonitor for å måle likevektig gasskonsentrasjon av isofluran over den gjenværende oppløsningen i posen.
- Rapporter eksperimentelle konsentrasjoner av flyktige gasser i vandige enheter, da millimolare konsentrasjoner er mer robuste mot temperaturendringer. Bruk følgende ligning for å konvertere romtemperatur gassfasekonsentrasjon, P% (Trom), til ekvivalent vandig konsentrasjon (Cvandig, i mM) 31:
hvor α er saltvann/gass Bunsen-partisjonskoeffisienten for isofluran ved 25 °C32.
5. Klargjøring av maskinvare og programvare for flerkanalsopptak
- Konfigurer 16-kanals datainnsamlingssystem i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Flere kommersielt tilgjengelige forsterkere og datainnsamlingssystemer kan brukes til å samle inn flerkanalsopptak. I forsøkene som er beskrevet her, leveres analoge signaler via et elektrodereferansepanel til to forsterkere, hvor de forsterkes (2000x) og filtreres (0,1-10kHz). Analoge innganger til datainnsamlingssystemet digitaliseres ved 40kHz. - Fest riktig 16-kanals headstageadapter til en mikroskopmikromanipulator. Orienter adapteren slik at de kvinnelige kontaktportene vender nedover.
- Juster driftsvinkelen til denne mikromanipulatoren slik at den er orientert nedover mot opptakskammeret, i en vinkel omtrent 70 ° i forhold til horisontal.
- Koble headstage-inngangen til en 16 x 1-sonde for in vitro-elektrofysiologi via headstageadapteren forankret til mikromanipulatoren.
- Koble headstage-utgangskontakten til datainnsamlingssystemet.
- Installer passende programvare for datainnsamling. Konfigurer 15 inngangskanaler for å korrespondere med inngangssignaler fra de første 15 flerkanals sondekontaktene. Konfigurer den gjenværende kanalen til å motta inndata fra den intracellulære elektroden.
MERK: Pass på å vurdere elektrode- og adapterkart når du samler inn og analyserer data, for å sikre at riktig signal tilsvarer elektrodekontakten den ble samlet inn fra.
6. Konfigurasjon av lysstimuleringsprotokoller
- Sett opp lysleveringssystem og installer den medfølgende programvaren.
- Åpne programvaren. Velg maskinvarekablingskonfigurasjon der en utløserkilde (Digital / TTL-utgang) gir utløser inn-signal til lysleveringssystemet, og lysleveringssystemet gir utløsersignal til en 470 nm LED.
- Monter objektivlinsen med høy effekt. Bruk digitalkamera til å kalibrere høyeffektsmålet for bruk med lysleveringssystem.
- Opprett ny profilsekvens med lysstimuleringsprofiler.
- Lag et valgfritt mønster. I forsøkene beskrevet her, brukes en sirkel med diameter 150 μm for å tillate lagspesifikk aktivering av aksonterminaler.
- Hvis du vil lage en profilsekvens, kopierer og limer du inn denne profilen for hvert av et hvilket som helst antall forsøk.
- Opprett en bølgeformliste som inneholder bølgeformer av hvilken som helst lysintensitet, pulsvarighet eller pulstall.
- Tilordne bølgeformer tilfeldig til hver profil. Hver profil med sin tildelte bølgeform tilsvarer en utløserpuls fra en digital TTL-inngang, eller en prøve.
- Lagre profilsekvensen.
- I datainnsamlingsprogramvaren oppretter du en ny protokoll.
- Angi at antall forsøk skal være lik antall profiler i profilsekvensen som nettopp ble opprettet.
- Velg signalinnganger som samsvarer med de som er konfigurert i trinn 5.6. Konfigurer en protokoll som gir en enkelt digital TTL-utgang, og ta opp fra disse 16 inngangskanalene i passende tid før og etter den digitale utløseren.
7. Plassering av flerkanalssonde i ex vivo hjernevevskive
- Perfuse boblet eACSF (ikke i forseglede poser) ved 3-6 ml / min.
- Overfør hjerneskiven som inneholder interesseområde til nettinggitter i mikroskopperfusjonskammer. Anker med platinaharpe (se supplerende figur 3).
- Roter maskegitteret slik at linjen med elektrodekontakter på den distale enden av flerkanalssonden er omtrent vinkelrett på den piale overflaten.
- Under bred belysning og under fin kontroll av mikromanipulatoren, senk flerkanalssonden mot overflaten av skiven.
- Roter filterkubetårnet for å koble til riktig filterkube for visualisering av det fluorescerende reporterproteinet uttrykt i aksonterminaler av kortikale afferenter. Roter om nødvendig stykket for å justere sonden mer presist med den piale overflaten.
- Plasser sonden like over skiveplanet, ~ 200 μm kort av den endelige målposisjonen langs x-aksen, og la minst en kanal utenfor grensen til vevsområdet som registreres
- Sett sonden sakte inn i skiven ved å bevege manipulatoren langs lengdeaksen. For å minimere skade på vevet, må du bare fremme sonden i den grad at de skarpe spissene bare er synlige under vevsoverflaten. Dette vil minimere skade på vevet samtidig som elektrodekontaktene er i kontakt med vevet.
8. Patch klemme målrettede nevroner og oppnå helcellekonfigurasjon
- Bytt eACSF-kilde til bagged Control-løsning.
- Identifiser fluorescerende merket celle for målrettet patchklemmeopptak.
- Begrens blenderåpningen iris membran til minste diameter. Koble til en objektivlinse med lav effekt og få vevet i fokus.
- Sentrer lyset over et område av vev ved siden av (men ikke overlappende) flerkanalssonden.
- Koble til det kraftige (40x eller 60x) målet for nedsenking av vann, og vær forsiktig for å unngå kontakt mellom flerkanalssonden og objektivlinsen.
- Roter filterkubetårnet for å aktivere riktig filtersett for å tillate avbildning av celler som uttrykker Cre-avhengig fluorescerende markør.
- Identifiser en fluorescerende merket celle som et mål for patchklemmeopptak. Løft objektivlinsen for å skape god plass til å senke en patchpipette.
- Legg en plasterpipette (se tabell 1) med intern løsning (tabell 2) og monter pipetten i elektrodeholderen. Bruk 1 ml sprøyte, påfør positivt trykk tilsvarende ~0,1 ml luft.
- Senk plasterpipetten i oppløsningen. Sett pipettespissen i fokus under visuell veiledning.
- Hent helcelleopptak fra målcellen ved hjelp av trinnene som tidligere er demonstrert33.
- Hvis du planlegger å vurdere endringer i cellens iboende egenskaper (f.eks. Inngangsmotstand, handlingspotensial avfyringshastighet som svar på nåværende trinn), utfør disse opptakene. Ellers flytter du til aksonstimuleringsprotokollen nedenfor.
9. Lagspesifikk optogenetisk aktivering av aksonterminaler
- Manipuler synsfeltet i x-y-planet for å justere lysstimuleringsprofilen med ønsket plassering på stykket.
- Last inn lysstimuleringsprotokollen og klargjør lysleveringssystemet for å motta en digital TTL-puls.
- Optogenetisk aktiver aksonterminaler samtidig som ekstracellulære feltpotensialer og intracellulære membranfluktuasjoner registreres.
- Bytt eACSF-kilde til isofluranoppløsning og vask legemidlet i 15 minutter. Samle om nødvendig spontane opptak under innvaskingen.
- Gjenta trinn 9.2-9.3.
- Bytt eACSF-kilde til kontrollløsning og vask stoffet ut i 20 minutter. Samle om nødvendig spontane opptak under utvasking.
- Gjenta trinn 9.2-9.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje med trinn beskrevet i protokollen er vist i figur 1. Kortikale innganger som kommer fra høyere ordens kortikale områder eller fra ikke-primære thalamiske kjerner har delvis overlappende terminalfelt i lag 1 av ikke-primær visuell cortex24. For å isolere uavhengige thalamokortikale eller kortikokortikale afferenteveier ble det injisert en viral vektor som inneholdt ChR2 og en eYFP fluorescerende reporter i enten Po eller Cg. Celler innenfor injeksjonsradiusen tar opp virusvektoren og uttrykker etter 2-4 uker den uspesifikke kationkanalen ChR2 og reporteren i både soma og projiserende aksoner (figur 2A). Koronale skiver ble samlet inn. Med riktig filterkube engasjert, ble aksoner som uttrykker viruskonstruksjonen avbildet (figur 2B). Bruken av ChR2 for å aktivere aksonterminaler muliggjør aktivering av afferenter uten forutsetning for en vedlagt soma.
Dyrene som ble brukt i forsøkene beskrevet her var SOM-tdTomato eller PV-tdTomato hybriddyr, som uttrykker det fluorescerende reporterproteinet tdTomato i henholdsvis somatostatin- (SOM+) eller parvalbumin-positive (PV+) internevroner. SOM+ eller PV+-internevroner i lag 2/3 ble målrettet for patchklemming under visuell veiledning med riktig filterkube engasjert (lag 1C). Disse internevronene har dendritter i lag 1 og er mål for kortikokortikale innganger (figur 3A).
Tilsetning av 125 ml 3,0 % isoflurangass og 175 ml 95 % O 2/5 % CO2 til en forseglet pose resulterte i en forlikevektskonsentrasjon av gass på 1,3 %. Gass oppløst i eACSF i henhold til partisjonskoeffisienten; den forventede likevektskonsentrasjonen av isofluran i gassfase ved romtemperatur var 0,6 % (figur 2D). Dette ble bekreftet via gassmonitor.
Vevsskiven ble overført til opptakskammeret og 16x1 flerkanals opptakssonde ble plassert ortogonalt til kortikal laminae (figur 2E). En 150 μm sirkel på 470 nm lys sentrert over kortikal lag 1 ble levert via den objektive lysbanen, mens ekstracellulære feltpotensialer ble samlet inn ved hjelp av 16 x 1 flerkanalssonde og målrettede helcellepatchklemmeopptak ble utført i interneuroner. Et skjema over opptaksoppsettet er vist i figur 2F.
Postsynaptiske potensialer (PSP) ble observert i internevroner som respons på et tog med fire 2 ms lyspulser (10 Hz; Figur 3A). Det ble også registrert lokale feltpotensialer (figur 3B). Nåværende kildetetthet (CSD; Figur 3C) og flerenhetsaktivitet (MUA; Figur 3D) ble hentet ut fra lokale feltpotensialer. Ti studier med flere ulike lysintensiteter ble brukt til å gjennomføre post hoc-analyser. Amplituden av strømvasker hentet fra CSD økte som en funksjon av lysintensitet (figur 4A). En ikke-lineær logistisk ligning med tre parametere var tilpasset dataene for sammenligninger på tvers av veier. PSP-amplitude økte også med nåværende synkeamplitude (figur 4B).
Synaptisk respons på thalamokortikale og kortikokortikale innganger ble målt under kontroll, isofluran (0,28 mM) og restitusjonsforhold. Postsynaptiske responser av somatostatin- (figur 5A) på kortikokortikale stimuli ble undertrykt under isofluran, i likhet med fremkalte strømvasker (figur 5B).
Figur 1: Et skjema som beskriver tidslinjen for viktige trinn i protokollen.
Topp: Beskriver tidslinje for trinn som er nødvendige for avl av transgene dyr og uttrykk for viral vektor. Bunn: Viser trinn og tidslinje for å forberede materialer og gjennomføre eksperimenter på dagen for utarbeidelse av skiver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Injeksjon av virusvektor og preparering ex vivo koronale hjerneskiver.
(A) Skjematisk fremstilling av injeksjon av viral vektor i SOM-tdTomato eller PV-tdTomato hybridmus. (B) Koronale skiver av det mediale parietale assosiasjonsområdet (mPtA) ble høstet, og thalamokortikale (øverste) eller kortikokortiske (nederste) afferente fibre ble identifisert av deres eYFP-reporter i lag 1. Dette tallet er endret med tillatelse fra24. (C) Overlegg av eYFP-merkede aksonterminaler i lag 1 (grønn) og tdTomato-merkede SOM+-internevroner (rød) i overfladisk lag 2/3. (D) Forseglede poser ble fremstilt med en 50:50 løsning-til-gass-blanding. (E) Plassering av en 16 x 1 sonde i mPtA (svart omriss). (F) Skjematisk for opptaksoppsettet i kortikaskiven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Samtidige intracellulære og flerkanals ekstracellulære opptak i kortikal skive.
(A) Helcellestrøm klemmeplastopptak fra soma av et lag 2/3 PV + interneuron. Fire pulser (2 ms hver, blå piler) med blått lys (2,2 mW) ved 10 Hz ble levert til kortikokortikale aksonterminaler i L1. Gjennomsnittlig (rødt spor) på ti forsøk (grå spor) er vist. (B) Rådata fra 16 kanaler med ekstracellulær 16 x 1 sonde. Kanaler plassert i kortikalt vev er vist i svart, og de som ligger utenfor cortex i grått. (C) Et strømkildetetthetsdiagram, hentet fra det lokale feltpotensialsignalet, viser synaptiske strømvasker (blå) i lag 1. (D) Flerenhetsaktivitet, generert ved å påføre et høypassfilter på det lokale feltpotensialsignalet, isolerer skyteaktivitet fremkalt i lavere lag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammenligning av svar fra opptak i to ulike skiver.
Flere lysintensiteter ble brukt til å fremkalle synaptiske responser i kortikal lag 1. For hver studie ble toppamplituden til den fremkalte responsen ekstracellulær strømvask og EPSP-er i lag 2/3 PV+ internevroner. (A) Ekstracellulære responsprofiler av thalamokortikale og kortikokortiske afferenter sammenlignes som en funksjon av lysintensitet. (B) Forholdet mellom nåværende synkeamplitude og EPSP-amplitude er baneavhengig. Innenfor hver stimulusvei ble data fra (A) og (B) samlet inn samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Påføring av isofluran oppløst i eACSF under samtidige opptak.
(A) Intracellulær helcellestrømklemmeopptak fra lag 2/3 SOM+ internevron ved aktivering av kortikokortikale afferenter under kontroll-, isofluran- og vaskeforhold. Vertikale blå linjer indikerer lysstimuli (2 ms; 1,65 mW). (B) Spor av strømkildetetthet ekstrahert fra elektrode i lag 1. Data ble samlet inn samtidig med de som ble samlet inn i (A). Restitusjon av respons ved vask viser depresjon av synaptisk respons ved isofluran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mikropipette til virusinjeksjon | ||||
| Glass | ID: 0,05 mm, OD: 0,11 mm | |||
| Looper | 1 | |||
| Varme | Trekke | Vel | Tid | Trykk |
| Rampe + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Mikropipette for opptak av helcellepatchklemme | ||||
| Glass | ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm | |||
| Looper | 4 | |||
| Varme | Trekke | Vel | Tid | Trykk |
| Rampe | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tabell 1: Anbefalt glass og parametere for trekking av mikropipetter til virusinjeksjoner og helcelleplasterklemmeopptak. Glass som brukes til virale injeksjoner og opptak av helcellepatchklemme er beskrevet, samt parametrene for å trekke mikropipetter ved hjelp av mikropipettetrekkeren. Se bruksanvisninger for mikropipetteavtrekker for ytterligere anbefalinger eller finjustering av innstillinger.
| Skiver ACSF, sACSF (i mM) | Eksperiment ACSF, eACSF (i mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| KCl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glukose | 10 | 10 |
| Intern løsning | ||
| K-glukonat | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| EGTA | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tabell 2: Sammensetning av kunstig cerebral spinalvæske og intracellulær løsning. Reagenser og konsentrasjoner for sACSF, eACSF og intracellulær pipetteoppløsning for patchklemmeopptak er oppført.
Supplerende figur 1: Mal for klargjøring av vevsblokk for å samle hjerneskiver. Malen justeres til riktig størrelse, skrives ut og limes til et mikroskoplysbilde. En dekselslipp limes over malen for å forlenge bruken. Vevsblokken er plassert på et stykke filterpapir med sagittalplanet nede, justert til den rosa bakgrunnen, og et vertikalt kutt er laget i koronalplanet langs den svarte linjen. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Inkubasjonskammer for høstede hjerneskiver. Kammeret er fylt med sACSF og boblet med 95% O 2/5% CO2 gassblanding via en bøyd nål festet til slangen. Inkubasjonsplattformen er laget av nylon strukket over en plastsirkulær montering. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 3: Platinastrukturer for skive i opptakskammer. Hjerneskive overføres til opptakskammer via pipette og plasseres på toppen av nylonnett, som strekkes over et hesteskoformet stykke flatt platinatråd og superlimes på plass. Platinaharpe plasseres over hjerneskive for å forankre den på plass under opptak. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Tilleggstabell 1: Ostwald (λ) og Bunsen (α) koeffisienter for andre flyktige anestetika. Tilpass denne protokollen for studier av andre flyktige gassanestetika, som halotan, sevofluran eller desfluran. Erstatt ligningene beskrevet i protokollen med de riktige koeffisientene som er oppført i denne tabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskrives en protokoll for evaluering av intra- og ekstracellulære responser på selektivt aktiverte afferente veier i ex vivo hjerneskiver.
Bruken av optogenetiske verktøy og parallelle opptaksordninger gjør det mulig for etterforskere å undersøke responser fra lokale populasjoner til afferente innganger fra fjerne hjernegrupper, samtidig som de registreres fra målrettede populasjoner av interneuroner. Bruken av optogenetisk teknologi gjør det mulig å bevare og aktivere aksonterminaler av afferente projeksjoner selv om cellelegemene ikke lenger er festet. Dette avlaster geometriske restriksjoner som tidligere ble pålagt ex vivo-skiver , da bevaring av langdistanse elektriske tilkoblinger ikke lenger er avgjørende. Likevel bør det tas hensyn til å forberede skiver i et geometrisk plan som bevarer eventuelle gjenværende forbindelser av interesse. For eksempel er pyramideceller orientert vertikalt langs den kortikale kolonnen, og fremkalt nettverksaktivitet målt av flerkanalsprobene i disse forsøkene krever at slike lokale forbindelser bevares så mye som mulig. Dermed ble koronale skiver forberedt på å holde lokal tilkobling intakt.
Ved valg av optogenetiske konstruksjoner og relevante fluorescerende reporterproteiner må egenskaper til deres eksitasjons-/emisjonsspektra og mikroskopiske optikk vurderes. Vedvarende lysstimulering kan resultere i delvis inaktivering av mange kanalrhodopsinvarianter34, noe som kan unngås ved å velge reporterproteiner hvis eksitasjonsspektra ikke overlapper med opsinens. Alternative varianter med forskjellig kinetikk eller lysfølsomhet kan også velges avhengig av det eksperimentelle paradigmet35, inkludert manipulasjoner ved bruk av alternative eksitatoriske eller hemmende opsiner. Filterkuber må også være riktig justert med de valgte fluorescerende reporterne, slik at afferente aksonterminaler eller interneuroner kan avbildes uavhengig og uten å aktivere uttrykte opsiner. For å redegjøre for variabiliteten i virusuttrykk, kan det også være relevant for etterforskere å normalisere enhver optogenetisk indusert aktivitet til ekspresjonsnivået av viruskonstruksjonen, målt ved den fluorescerende utgangen av reporterproteinet.
Levering av forhåndsberegnede konsentrasjoner av flyktige anestetika til skivevev er også mulig ved hjelp av metodene som er skissert her. Ved valg av egnede fysiologisk relevante gaslikevektsprosenter bør utprøver stå for 10-15 % tap av oppløst isoflurangass mellom perfusjonsslangen og vev36. Metodene som gjelder isofluran er presentert, men andre legemidler som halotan, sevofluran eller desfluran kan håndteres på samme måte ved bruk av adekvate Ostwald- og Bunsen-koeffisienter (supplerende tabell 1). Partisjoneringsegenskapene til flyktige anestetika sikrer at de forutsigbart vil oppløses i ACSF. Men fordi partialtrykk er mer følsomme for temperaturendringer enn vandige EC50-konsentrasjoner 37, må gasslikevektsvolumprosenter av flyktige anestetika konverteres til forventede romtemperatur millimolare konsentrasjoner for å sammenligne observerte effekter med fysiologisk relevante doser in vivo. Hvis du velger å studere intravenøse anestetika som etomidate eller propofol i hjerneskiver, må etterforskerne vurdere diffusjonsprofiler av legemidlene som studeres, da likevektstider og fysiologisk relevante konsentrasjoner kan variere sterkt30.
I dette manuskriptet er en protokoll beskrevet for å teste effekten av flyktige anestetika på forskjellige komponenter i thalamokortikale kretser i ex vivo hjerneskiver. Mange av variablene og parameterne i de beskrevne metodene kan manipuleres for videre undersøkelser. For eksempel kan forskjellige hjerneområder, afferente veier, cellemål eller flyktige anestetika studeres ved å tilpasse de skisserte metodene for å svare på nye spørsmål. Kombinert med andre teoretiske og eksperimentelle metoder, vil studier av unike cellulære og nettverkskomponenter ved hjelp av ex vivo hjerneskiver fremme vår forståelse av den dynamiske hjernen, og endringene den gjennomgår under farmakologiske og patofysiologiske endringer i bevissthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Bryan Krause for teknisk støtte og veiledning om dette prosjektet.
Dette arbeidet ble støttet av International Anesthesia Research Society (IMRA til AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 til MIB), og Institutt for anestesiologi, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison, WI, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C.
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K.
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G.
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
