本研究的目的是开发烧伤伤口愈合的穆林模型。使用预热的黄铜模板在小鼠的后皮上引起热灼伤。燃烧的组织被除去,并覆盖与皮肤移植从基因相似的捐赠小鼠的尾巴收获。
琐碎的肤浅伤口愈合没有并发症的主要意图。深层伤口,如全厚烧伤,通过二次意图愈合,需要手术脱毛和皮肤移植。将供体移植物成功整合到受助人伤口床取决于及时招募免疫细胞、强健的血管反应和新的细胞外基质形成。新型治疗剂的发展,针对伤口愈合的一些关键过程,由于缺乏可靠的临床前模型和伤口闭合的优化客观评估而受阻。在这里,我们描述了一个廉价和可重复的模型,实验全厚度烧伤伤口重建与异体皮肤移植。伤口在BALB/C和SKH1-Hrhr背景麻醉的近亲繁殖野生型小鼠的多苏姆表面诱发。烧伤使用直径为10毫米的黄铜模板生产,该模板预热至80°C,以恒定压力提供20 s。 烧伤埃沙尔在受伤后24小时被切除,并更换为从基因相似的供体小鼠尾部收获的全厚度移植物。手术不需要专门的设备,手术技术也很容易遵循。在大多数研究环境中,该方法可以毫不费力地实现和复制。某些限制与模型相关。由于技术困难,无法收获较薄的分裂厚度皮肤移植。我们在这里描述的手术方法允许使用全厚度的皮肤移植重建烧伤伤口。它可用于进行临床前治疗测试。
手术脱毛和皮肤移植是用于管理慢性伤口1,烧伤伤口2,和急性伤口,如创伤伤口3的常见临床做法。皮肤移植是指外科手术,它涉及从身体的一个部位去除健康的皮肤,并转移到另一部分。捐赠者移植物取代了丢失的组织,为细胞迁移和生长提供了一个结构脚手架。在整合到接收方现场后,皮肤移植物通过提供微生物入侵、外部环境有害影响和水分过度流失等防护,取代了失去的皮肤屏障。成功的皮肤移植整合取决于几个因素。其中包括在微生物感染和及时解决炎症时作出充分的免疫反应,在伤口场建立健壮的血管生成,以及在接受者床和供体移植物之间建立血管性血管性血管。当移植物开始降解时,居民皮肤细胞必须被能够产生新的细胞外基质的细胞所取代。同时,表皮角蛋白细胞必须爬过新产生的基质,形成新表皮,重新上皮化伤口。因此,很明显,细胞从接受者床有效迁移到供体移植物是影响成功移植物结合的另一个决定性因素。鉴于伤口愈合涉及的大量因素,由于伦理限制,在人体试验中可能无法控制,因此有必要进行临床前实验皮肤移植模型。开发烧伤伤口愈合和相关皮肤移植的临床前模型对于了解皮肤组织修复所涉及的复杂机制非常重要,并且对于测试新的治疗剂至关重要。伤口愈合的体外模型无法准确模拟皮肤组织的复杂性。体内动物模型是了解组织修复机制不可或缺的调查工具。
在啮齿动物身上开发了几种皮肤移植技术,以模拟手术切除和烧伤伤口重建7,8,9。,8,9然而,大多数前面描述的程序未能在皮肤移植之前诱发热烧伤。而不是烧伤伤口,诱导一个完整的厚度切除伤口,然后重建与全厚度的皮肤同体7。各种解剖地标,如耳朵,尾巴和背部已被用来收获啮齿动物7,8的捐赠皮肤。报告了不同的移植固定和稳定技术,包括”无缝合技术“9,缝合7和手术胶10,11,12。10,11,12
本研究的目的是开发一个全厚度烧伤伤口的穆林模型,将回顾目前烧伤治疗的黄金标准方法,其中包括不活的组织切除和皮肤移植。使用预热的黄铜模板在鼠标的多苏姆表面引起热灼伤。烧伤埃沙尔被切除,并替换为从捐赠小鼠尾部收获的全厚移植物。这种实验模型有三个主要优点。首先,在受助小鼠的背上可能诱发多个烧伤伤口,从受助小鼠的单尾中可收获四个供体皮肤移植物。这意味着,可能使用相同的接受者和捐赠动物来比较几种实验和控制疗法。根据所需的给药途径,控制治疗可能包括对车辆或安慰剂控制的局部或全身给药(例如,软膏的局部应用、皮下、内皮或静脉注射溶液)。其次,可以控制治疗的时间和实验的终点。第三,这个模型取决于伤口的重建使用从尾巴收获的全厚度移植,这是已知的有更高的概率,成功地纳入捐赠地点相比,从背部13收获的皮肤。这可能是由于表皮兰格汉斯细胞的数量减少,在皮肤免疫生物学中起着关键作用,并且与皮肤移植排斥14有关。
建议的伤口愈合和移植整合模型很可能应用于转基因和敲除小鼠。使用转基因小鼠将有助于阐明某些基因在伤口修复过程中可能扮演的角色。也可以考虑在损伤现场进行局部伤口制剂或治疗抗体的皮下注射。
由于技术困难,由表皮和部分真皮组成的分厚皮肤移植在小鼠中很难获得。众所周知,由表皮和全厚真皮组成的全厚度皮肤移植物需要一个血管良好的伤口床才能成功整合。无法在小鼠身上收获分裂厚度皮肤移植物可能被视为此模型的一个限制。皮肤移植到接受者伤口床的固定是通过应用手术胶粘胶实现的,与其他组织固定方法相比,这种粘胶与更少的创伤和快速降解有关。先前的研究表明,在手术后15小时,与手术胶相比,粘附与更强的组织固定有关,这可能被认为是手术的缺点。然而,在后来的点,用手术胶粘剂治疗的伤口的生物力学强度变得可与缝合15和优于主食固定16。使用手术胶水固定组织后,伤口必须用伤口敷料覆盖。虽然小鼠的后面伤口很难被动物接触,但另一方面,伤口敷料很容易被动物操纵和切除。可能需要频繁更换伤口敷料。
麻醉引起的小啮齿动物体温过低是一个有据可查的现象17。体温过低是此过程的副作用,它会导致并发症,并可能损害动物健康和数据质量。因此,此方法保证实施温度管理策略,尤其是在使用无毛 SKH1-Hrhr 时。
使用小鼠模仿人体伤口闭合的最显著限制是皮肤解剖学和生理学的区别。老鼠的伤口主要通过收缩愈合,而人类伤口通过造粒组织形成和再上皮18愈合。为了解释这种差异,目前的模型可以修改,并结合夹板环紧紧粘在伤口周围,以防止皮肤收缩19。鉴于这种体内协议的一些优点和缺点,这个模型可以作为一个工具来研究伤口愈合中的某些过程,这些过程不可能在体外研究。
根据烧伤23的厚度分类,全厚度烧伤的特点是皮肤整体厚度和皮下组织某些部分明显介入。这种类型的伤口只能通过收缩或皮肤移植2愈合。本文中描述的方法的固有限制是,只有全厚度嫁接,而不是分裂厚度嫁接,这是常在临床环境中使用,收获从小鼠的尾巴。这是由于技术难度,因为鼠标皮肤太薄,获得分裂厚度嫁接。必须指出,全厚度移植需要一个良好的血管化伤口床,而分裂厚度的皮肤移植能够生存在捐赠点与较少的血管24。先前的研究表明,在小鼠背部诱发的烧伤伤口与新血管5的强健形成有关。这表明,一个良好的血管化区域,如小鼠的伤口,可以被认为是诱导烧伤伤口的解剖里程碑。
烧伤伤口深度是需要考虑的重要因素。烧伤伤口的深度必须在单个小鼠之间保持一致。烧伤伤口深度的可重复性取决于黄铜模板的温度、压力和热暴露持续时间。必须组织验证烧伤伤口深度。重要的是要记住,过度的压力或皮肤长时间暴露在预热的黄铜模板可能会伤害底层组织。椎柱周围的组织,包括中枢和周围神经系统的成分,对热敏感,如果损坏可能导致后腿瘫痪。
虽然没有术后死亡率与外科手术直接相关,但少数无毛SKH1-Hrhr小鼠对感冒特别敏感,出现体温过低,全身麻醉后无法恢复。因此,在所有美容活动中必须提供补充热量,在麻醉小鼠时需要持续监控。
本研究中描述的方法与手术场感染不相关。然而,无菌技术必须用于防止微生物在手术周期内转移到手术伤口。用生物发光或荧光微生物接种伤口可以纳入手术程序。这项技术可能有助于研究传染性生物及其发病机制25。例如,外源性添加或注射生物发光细菌,可以允许监测微生物负担使用体内整个动物成像25。鉴于已知小鼠毛发会干扰体内整个动物荧光和生物发光成像,无毛SKH1-Hrhr小鼠是有关荧光或生物发光记者研究的理想宿主。
伤口组织样本可在不同的时间点采集,并处理进行组织学和免疫组织化学分析。蛋白质和RNA可能从皮肤活检中分离,分子生物学技术可用于评估参与伤口愈合的关键分子的表达。
本研究,我们描述了烧伤伤口愈合和异体皮肤的实验性模型。此过程可以修改,并用作临床前研究的模型。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了L’Armement,国防创新和理工学院的支持。我们感谢来自理工学院的同事Yann Plantier先生,他提供了深入的见解和专业知识,极大地帮助了视频文件的制作。作者感谢贝诺伊特·皮特曼先生和夏洛特·奥里奥女士,他们来自因瑟姆·拉沃西耶(SEIVIL)美国33号医院,保罗·布卢斯医院,维尔朱伊夫,感谢他们在该项目过程中提供的动物福利和护理专业知识。
1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' – 0,45 X 12mm |
96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
Depilating cream | Veet | ||
Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
Heating pad | Petelevage | 120070 | |
Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
Ocrygel | Tvm France | ### | |
Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |