Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af brænde sårheling. En termisk brænde blev induceret på brystskind af mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Brændt væv blev debrideret og overlejret med en hudtransplantation høstet fra halen af en genetisk lignende donormus.
Trivielle overfladiske sår helbrede uden komplikationer ved primær hensigt. Dybe sår, såsom fuld tykkelse forbrændinger, helbrede ved sekundær hensigt og kræver kirurgisk debridering og hudtransplantation. Vellykket integration af donortransplantat i en modtager sår seng afhænger rettidig rekruttering af immunceller, robust angiogenic respons og nye ekstracellulære matrix dannelse. Udviklingen af nye terapeutiske midler, som er rettet mod nogle vigtige processer, der er involveret i sårheling, hindres af manglen på pålidelige prækliniske modeller med optimeret objektiv vurdering af sårlukning. Her beskriver vi en billig og reproducerbar model af eksperimentel fuld tykkelse brænde sår rekonstrueret med en allogen hudtransplantation. Såret er induceret på dorsum overfladen af bedøvet indavlede vilde type mus fra BALB / C og SKH1-Hrhr baggrunde. Forbrændingen er fremstillet ved hjælp af en messing skabelon måler 10 mm i diameter, som er forvarmet til 80 °C og leveres ved et konstant tryk i 20 s. Burn eschar er punkteret 24 timer efter skaden og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en genetisk lignende donor mus. Ingen specialiseret udstyr er nødvendig for proceduren og kirurgiske teknikker er ligetil at følge. Metoden kan uden besvær implementeres og gengives i de fleste forskningsindstillinger. Der er knyttet visse begrænsninger til modellen. På grund af tekniske vanskeligheder er høsten af tyndere hudtransplantater i spaltningstykkelse ikke mulig. Den kirurgiske metode, vi beskriver her giver mulighed for rekonstruktion af brænde sår ved hjælp af fuld tykkelse hudtransplantationer. Det kan anvendes til at udføre prækliniske terapeutiske test.
Kirurgisk debridering og hudtransplantation er almindelige kliniske praksis, der anvendes i forvaltningen af kroniske sår1,brændesår 2, og akutte sår såsom traumatiske sår3. Hudtransplantation refererer til den kirurgiske procedure, som indebærer fjernelse af sund hud fra en del af kroppen og overføre det til en anden. Donorgrafter erstatter det tabte væv og giver et strukturelt stillads til cellulær migration og vækst. Efter integration i modtageren site, hudtransplantationer erstatte den tabte hud barriere ved at yde beskyttelse mod mikrobielle invasion, skadelige virkninger af det ydre miljø og overdreven tab af fugt4. Vellykket hudtransplantation integration afhænger af flere faktorer. Disse omfatter tilstrækkelig immunrespons ved tilstedeværelse af mikrobielle infektioner og rettidig opløsning af inflammation, robust angiogenese på sårstedet og etablering af vaskulære anastomoses mellem recipientsengen og donortransplantat5. Efterhånden som transplantatet begynder at nedbrydes, skal hjemmehørende hudceller erstattes af celler, der kan producere nye ekstracellulære matrixer. Samtidig skal de epidermale keratinocytter kravle over den nyproducerede matrix for at danne neo-epidermis og re-epithelialize såret. Det er derfor indlysende, at effektiv migration af celler fra recipientsengen til donortransplantaten er en anden afgørende faktor, der påvirker en vellykket graft inkorporering. I betragtning af det store antal faktorer, der er involveret isårheling 6, som kan være umuligt at kontrollere i de menneskelige forsøg på grund af etiske begrænsninger, modeller af præ-kliniske eksperimentelle hudtransplantation er nødvendige. Udvikling af prækliniske modeller for brændsårheling og tilhørende hudtransplantation vil være vigtig for forståelsen af komplekse mekanismer, der er involveret i kutan vævsreparation og afgørende for afprøvning af nye terapeutiske midler. In vitro-modellerne af sårheling er ude af stand til præcist at efterligne kompleksiteten af det kutane væv. In vivo-dyremodellerne er et uundværligt efterforskningsværktøj til at forstå de mekanismer, der er involveret i vævsreparation.
Flere metoder til hudtransplantation teknik blev udviklet i gnavere til at efterligne kirurgisk excision og brænde sår rekonstruktion7,8,9. De fleste af de tidligere beskrevne procedurer kunne imidlertid ikke fremkalde en termisk forbrændingsskade før hudtransplantation. I stedet for brænde sår, en fuld tykkelse excisional sår blev induceret, som derefter blev rekonstrueret med en fuld tykkelse hud allograft7. Forskellige anatomiske vartegn såsom øre, hale og ryg er blevet brugt til høst af donor huden i gnavere7,8. Der blev rapporteret forskellige graftfikserings- og stabiliseringsteknikker, herunder en “no suture technique”9,suturer 7 og kirurgisklim 10,11,12.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af en fuld tykkelse brænde sår, der ville opsummere den nuværende guld standard tilgang i brænde behandling, som indebærer ikke-levedygtige væv excision og hudtransplantation. En termisk brænde blev induceret på dorsum overfladen af en mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Burn eschar blev fjernet og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en donor mus. Der er tre vigtige fordele ved denne eksperimentelle model. For det første kan der induceres mere end ét brandsår på bagsiden af modtagermusen, og der kan høstes fire donorhudtransplantationer fra en enkelt hale af donormusen. Det betyder, at flere forsøgs- og kontrolbehandlinger potentielt kan sammenlignes med samme modtager- og donordyr. Afhængigt af den ønskede indgivelsesvej kan kontrolbehandlingen omfatte lokal eller systemisk administration af køretøjet eller placebo-kontrollen (f.eks. lokal anvendelse af salve, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs injektion af opløsning). For det andet kan tidspunktet for behandlingen og forsøgets endepunkt kontrolleres. For det tredje, denne model afhænger af genopbygningen af sår ved hjælp af fuld tykkelse grafts høstet fra halen, som er kendt for at have en højere sandsynlighed for en vellykket inkorporering i donor site i forhold til huden høstetfra bagsiden 13. Dette kan skyldes det lavere antal epidermale Langerhans celler, som spiller en central rolle i kutan immunobiologi, og er forbundet med hudtransplantationafstødning 14.
Den foreslåede model for sårheling og graft integration kan meget vel anvendes på transgene og knockout mus. Brugen af genetisk modificerede mus vil hjælpe med at belyse de roller, som visse gener kan spille under sårreparation. Eksogen påføring af topiske sårpræparater eller subkutan administration af terapeutiske antistoffer på skadesstedet kan også overvejes.
På grund af tekniske vanskeligheder er hudtransplantationer, der består af epidermis og en del af dermis, vanskelige at opnå i mus. Fuld tykkelse hudtransplantationer bestående af epidermis og fuld tykkelse dermis er kendt for at kræve en godt vaskulære sår seng for en vellykket integration. Den manglende evne til at høste hudtransplantationer i spaltetykkelser i mus kan betragtes som en begrænsning af denne model. Fikseringen af hudtransplantatet på modtagerens sårleje blev opnået ved anvendelse af den kirurgiske limlim, som er forbundet med mindre traume og hurtig nedbrydning sammenlignet med andre vævsfikseringsmidler15. Tidligere undersøgelser har vist, at suturering er forbundet med stærkere vævfiksering end den kirurgiske lim ved 24 timer efter den kirurgiske procedure15,som kan betragtes som en ulempe ved indgrebet. Men på senere tidspunkt, den biomekaniske styrke af sår behandlet med et kirurgisk klæbemiddel bliver sammenlignelig med suturer15 og bedre end korte fiksering16. Efter vævsfiksering med kirurgisk lim skal sår være dækket med en sårforbinding. Selv om sår på dorsale overflade af musen er vanskelige for dyret at nå, såret dressing, på den anden side, er let for dyret at manipulere og fjerne. Hyppige sårbandage ændringer kan være berettiget.
Anæstesi-induceret hypotermi hos små gnavere er et veldokumenteret fænomen17. Hypotermi er en bivirkning af denne procedure, som forårsager komplikationer, og potentielt kompromitterer både dyresundhed og datakvalitet. Derfor berettiger denne metode til gennemførelse af temperaturstyringsstrategier, især hvis der anvendes hårløse SKH1-Hrhr.
Den mest markante begrænsning ved at bruge mus til at efterligne menneskers sårlukning er forskellen mellem hudens anatomi og fysiologi. Musesår heler det meste via sammentrækning, mens menneskelige sår heler gennem granulering væv dannelse og re-epitelialization18. For at tage højde for denne uoverensstemmelse, den nuværende model kan ændres og anvendes i kombination med en splinting ring stramt klæbet omkring såret for at forhindre hud sammentrækning19. I betragtning af nogle fordele og ulemper ved denne in vivo protokol, denne model kunne tjene som et redskab til at studere visse processer, der er involveret i sårheling, der er umuligt at studere in vitro.
Ifølge tykkelsen klassificering af brænde skade23, fuld tykkelse forbrændinger er karakteriseret ved tydelig involvering af hele tykkelsen af huden og visse del af det subkutane væv. Denne type sår kan kun helbrede ved sammentrækning eller med hudtransplantation2. En iboende begrænsning af den metode, der er beskrevet i denne artikel er, at kun fuld tykkelse grafts, i modsætning til split tykkelse grafts, som ofte anvendes i den kliniske indstilling, blev høstet fra halen af en mus. Dette skyldtes de tekniske vanskeligheder, da musehuden er for tynd til at opnå split tykkelse grafts. Det skal påpeges, at fuld tykkelse grafts kræver en godt vaskulariseret sår seng, mens split tykkelse hudtransplantater er i stand til at overleve på donor steder med mindrevaskularisering 24. Tidligere undersøgelser viste, at et forbrændingssår fremkaldt på bagsiden af musen var forbundet med en robust dannelse af nye vaskulatur5. Dette tyder på, at et godt vaskulært område, såsom dorsum af musen, kunne betragtes som den anatomiske vartegn for induktion af brænde sår.
Brænd sårdybde er en vigtig faktor at overveje. Dybden af forbrændingssåret skal være konsistent mellem de enkelte mus. Reproducerbarheden af brændsåret dybde afhænger af temperaturen af messing skabelon, tryk og varigheden af varmeeksponeringen. Forbrændingssårets dybde skal verificeres histologisk. Det er vigtigt at huske på, at overdrevent tryk eller langvarig eksponering af huden til forvarmet messing skabelon kan skade det underliggende væv. Vævet omkring rygsøjlen, herunder komponenterne i det centrale og perifere nervesystem, er følsomme over for varme, og hvis beskadiget kan resultere i bagben lammelse.
Selv om ingen postoperativ dødelighed var direkte forbundet med den kirurgiske procedure, et lille antal hårløse SKH1-Hrhr mus, som er særligt følsomme over for kulde, udviklet hypotermi og undlod at komme sig efter den generelle anæstesi. Derfor skal der være supplerende varme under alle æstetiske begivenheder, og konstant overvågning er påkrævet, mens musen bedøves.
Den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse, var ikke forbundet med infektion på operationsstedet. Der skal dog anvendes aseptisk teknik for at forhindre overførsel af mikroorganismer til det kirurgiske sår i den perioperative periode. Inokulering af såret med bioluminescerende eller fluorescerende mikroorganismer kan indarbejdes i proceduren. Denne teknik kan være nyttig til at studere infektiøse organismer og deres patogenese25. Eksogen tilsætning eller injektion af bioluminescerende bakterier kanf.eks. I betragtning af at musehår er kendt for at forstyrre in vivo hele dyr fluorescens og bioluminescens imaging, hårløse SKH1-Hrhr mus er ideelle værter for undersøgelser, der involverer fluorescerende eller bioluminescerende reportere.
Sårvævsprøver kan indsamles på forskellige tidspunkter og behandles med henblik på histologisk og immunhistokemisk analyse. Protein og RNA kan isoleres fra hudens biopsi, og molekylærbiologiske teknikker kan anvendes til at vurdere ekspressionen af nøglemolekyler, der er involveret i sårheling.
I denne undersøgelse beskrev vi en eksperimentel model af brænde sårheling og allogen hud engraftment. Denne procedure kan ændres og tjene som model for prækliniske undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense og École Polytechnique. Vi takker vores kollega Yann Plantier fra École Polytechnique, som gav indsigt og ekspertise, som i høj grad hjalp produktionen af videofilen. Forfatterne takker Benoit Peuteman og Charlotte Auriau fra INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif for deres dyrevelfærd og plejeekspertise i løbet af dette projekt.
1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' – 0,45 X 12mm |
96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
Depilating cream | Veet | ||
Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
Heating pad | Petelevage | 120070 | |
Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
Ocrygel | Tvm France | ### | |
Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |