Målet med denne studien var å utvikle en murin modell av brenne sårheling. En termisk brenning ble indusert på dorsalhuden til mus ved hjelp av en forvarmet messingmal. Brent vev ble debrided og overlaid med en hud graft høstet fra halen av en genetisk lignende donor mus.
Trivielle overfladiske sår helbreder uten komplikasjoner ved primær intensjon. Dype sår, som full tykkelse brenner, helbrede etter sekundær intensjon og krever kirurgisk debridement og hud pode. Vellykket integrering av donortransplantatet i en mottaker sårseng avhenger av rettidig rekruttering av immunceller, robust angiogen respons og ny ekstracellulær matrisedannelse. Utviklingen av nye terapeutiske midler, som retter seg mot noen viktige prosesser som er involvert i sårheling, hindres av mangelen på pålitelige prekliniske modeller med optimalisert objektiv vurdering av sårlukking. Her beskriver vi en billig og reproduserbar modell av eksperimentell full tykkelse brenne sår rekonstruert med en allogen hud graft. Såret er indusert på dorsumoverflaten av bedøvede innavlede villtypemus fra BALB/C- og SKH1-Hrhr-bakgrunnen. Brenningen produseres ved hjelp av en messingmal som måler 10 mm i diameter, som er forvarmet til 80 °C og leveres ved et konstant trykk i 20 s. Brenn eschar utskilles 24 timer etter skaden og erstattes med en full tykkelse pode høstet fra halen av en genetisk lignende donormus. Ingen spesialisert utstyr er nødvendig for prosedyren og kirurgiske teknikker er enkle å følge. Metoden kan enkelt implementeres og reproduseres i de fleste forskningsinnstillinger. Visse begrensninger er knyttet til modellen. På grunn av tekniske problemer er innhøstingen av tynnere hudtransplantater med delt tykkelse ikke mulig. Den kirurgiske metoden vi beskriver her gjør det mulig å rekonstruksjon av brannsår ved hjelp av full tykkelse hudtransplantater. Det kan brukes til å utføre preklinisk terapeutisk testing.
Kirurgisk debridement og hud pode er vanlig klinisk praksis som brukes i forvaltningen av kroniske sår1, brenne sår2, og akutte sår som traumatiske sår3. Hudtransplantasjon refererer til den kirurgiske prosedyren, som innebærer fjerning av sunn hud fra en del av kroppen og overføre den til en annen. Donortransplantater erstatter det tapte vevet og gir et strukturelt stillas for mobilmigrasjon og vekst. Etter integrering i mottakerstedet erstatter hudtransplantater den tapte hudbarrieren ved å gi beskyttelse mot mikrobiell invasjon, skadelige effekter av det ytre miljøet og overdreven tap av fuktighet4. Vellykket integrering av hudtransplantat avhenger av flere faktorer. Disse inkluderer tilstrekkelige immunresponser i nærvær av mikrobielle infeksjoner og rettidig oppløsning av betennelse, robust angiogenese på sårstedet og etablering av vaskulære anastomoser mellom mottakersengen og donortransplantatet5. Etter hvert som transplantatet begynner å forringes, må resident dermal celler erstattes av celler som er i stand til å produsere ny ekstracellulær matrise. Samtidig må epidermale keratinocytter krype over den nyproduserte matrisen for å danne neo-epidermis og re-epitelialisere såret. Det er derfor tydelig at effektiv migrering av celler fra mottakersengen til donortransplantatet er en annen avgjørende faktor som påvirker vellykket podeinnarbeidelse. Gitt det store antallet faktorer som er involvert i sårheling6, som kan være umulig å kontrollere i de menneskelige studiene på grunn av etiske begrensninger, er modeller av preklinisk eksperimentell hudpoding nødvendig. Utvikling av prekliniske modeller for brennårsheling og tilhørende hudtransplantering vil være viktig for forståelse av komplekse mekanismer involvert i kutan vevreparasjon og avgjørende for testing av nye terapeutiske midler. In vitro-modellene for sårheling er ikke i stand til å nøyaktig etterligne kompleksiteten i kutan vev. In vivo dyremodeller er et uunnværlig undersøkende verktøy for å forstå mekanismene som er involvert i vevsreparasjon.
Flere metoder for hudtransplanteringsteknikk ble utviklet hos gnagere for å etterligne kirurgisk eksisjon og brenne sårrekonstruksjon7,,8,9. Imidlertid klarte de fleste av de tidligere beskrevne prosedyrene ikke å indusere en termisk brannskade før hudtransplantasjon. I stedet for brennsåret ble et fulltykkelsesutsår indusert, som deretter ble rekonstruert med en full tykkelse hud allograft7. Ulike anatomiske landemerker som øre, hale og rygg har blitt brukt til høsting av donorhuden hos gnagere7,8. Ulike graft fiksering og stabilisering teknikker ble rapportert, inkludert en “ingen sutur teknikk”9,suturer7 og kirurgisk lim10,,11,,12.
Formålet med denne studien var å utvikle en murine modell av en full tykkelse brenne sår som ville rekapitulere dagens gull standard tilnærming i brenne behandling, som innebærer ikke levedyktig vev excision og hud pode. En termisk brenning ble indusert på hele overflaten av en mus ved hjelp av en forvarmet messingmal. Brenn eschar ble utskåret og erstattet med en full tykkelse pode høstet fra halen av en donor mus. Det er tre viktige fordeler med denne eksperimentelle modellen. For det første kan mer enn ett brannsår induseres på baksiden av mottakermusen, og fire donorhudtransplantater kan høstes fra en enkelt hale av donormusen. Dette betyr at flere eksperimentelle og kontrollbehandlinger potensielt kan sammenlignes med samme mottaker og donordyr. Avhengig av ønsket administrasjonsmåte kan kontrollbehandlingen omfatte lokal eller systemisk administrering av kjøretøyet eller placebokontrollen (f.eks. aktuell bruk av salve, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs injeksjon av oppløsning). For det andre kan tidspunktet for behandlingen og endepunktet for eksperimentet kontrolleres. For det tredje avhenger denne modellen av rekonstruksjon av sår ved hjelp av full tykkelse grafts høstet fra halen, som er kjent for å ha en høyere sannsynlighet for vellykket inkorporering i donorområdet sammenlignet med huden høstet fra baksiden13. Dette kan skyldes det lavere antallet epidermale Langerhans-celler, som spiller en nøkkelrolle i kutan immunbiologi, og er forbundet med hudtransplantatavstøting14.
Den foreslåtte modellen for sårheling og graftintegrasjon kan godt brukes på transgene og knockout mus. Bruken av genmodifiserte mus vil bidra til å belyse rollene som visse gener kan spille under sårreparasjon. Eksogen bruk av aktuelle sårpreparater eller subkutan administrering av terapeutiske antistoffer på skadestedet kan også vurderes.
På grunn av tekniske problemer er hudtransplantater i delt tykkelse bestående av epidermis og en del av dermis vanskelig å oppnå hos mus. Full tykkelse hud grafts bestående av epidermis og full tykkelse dermis er kjent for å kreve en godt vaskularisert sår seng for vellykket integrering. Manglende evne til å høste hudtransplantater i glass i glass i glasset kan betraktes som en begrensning av denne modellen. Fiksering av hudtransplantatet til mottakerens sårseng ble oppnådd ved påføring av det kirurgiske klebelimet, som er forbundet med mindre traumer og rask nedbrytning sammenlignet med andre former for vevsfiksering15. Tidligere studier har vist at suturering er forbundet med sterkere vevsfiksering enn det kirurgiske limet ved 24 timer etter kirurgisk prosedyre15, som kan betraktes som en ulempe med prosedyren. Men på senere tidspunkter blir den biomekaniske styrken av sår behandlet med et kirurgisk lim sammenlignbar med suturer15 og bedre enn stiftfiksering16. Etter vevsfiksering med kirurgisk lim, må sår dekkes med en sårdressing. Selv om sår på den dorsale overflaten av musen er vanskelig for dyret å nå, er sårdressingen derimot lett for dyret å manipulere og fjerne. Hyppige endringer i sårdressing kan være berettiget.
Anestesi-indusert hypotermi hos små gnagere er et godt dokumentert fenomen17. Hypotermi er en bivirkning av denne prosedyren, noe som forårsaker komplikasjoner, og potensielt kompromitterer både dyrehelse og datakvalitet. Derfor garanterer denne metoden gjennomføringen av temperaturstyringsstrategier, spesielt hvis hårløse SKH1-Hrhr brukes.
Den viktigste begrensningen ved å bruke mus for å etterligne menneskelig sårlukking er forskjellen mellom hudens anatomi og fysiologi. Mus sår helbreder hovedsakelig via sammentrekning, mens menneskelige sår helbreder gjennom granulering vevdannelse og re-epitelialisering18. For å ta høyde for dette avviket, kan den nåværende modellen endres og brukes i kombinasjon med en skinnende ring tett festet rundt såret for å hindre hudkontraksjon19. Gitt noen fordeler og ulemper ved denne in vivo-protokollen, kan denne modellen tjene som et verktøy for å studere visse prosesser som er involvert i sårheling som er umulig å studere in vitro.
Ifølge tykkelseklassifiseringen av brannskader23er full tykkelsesforbrenninger preget av tydelig involvering av hele tykkelsen på huden og en viss del av det subkutane vevet. Denne typen sår kan bare helbrede ved sammentrekning eller med hud pode2. En iboende begrensning av metoden som er beskrevet i denne artikkelen er at bare full tykkelse grafts, i motsetning til split tykkelse grafts, som ofte brukes i klinisk setting, ble høstet fra halen av en mus. Dette var på grunn av de tekniske vanskelighetene, da musehuden er for tynn til å oppnå splittykkelse grafts. Det må påpekes at full tykkelse grafts krever en godt vaskularisert sår seng, mens split tykkelse hud grafts er i stand til å overleve på donor steder med mindre vascularity24. Tidligere studier viste at et brannsår indusert på baksiden av musen var forbundet med en robust dannelse av ny vaskulatur5. Dette tyder på at et godt vaskularisert område, som musens dorsum, kan betraktes som det anatomiske landemerket for induksjon av brannsår.
Brenn sårdybde er en viktig faktor å vurdere. Dybden av brennsåret må være konsistent mellom individuelle mus. Reproduserbarheten av sårdybden avhenger av temperaturen på messingmalen, trykket og varigheten av varmeeksponeringen. Brennsårsdybden må verifiseres histologisk. Det er viktig å huske på at overdreven trykk eller langvarig eksponering av huden til den forvarmede messingmalen kan skade det underliggende vevet. Vevet rundt vertebralkolonnen, inkludert komponentene i det sentrale og perifere nervesystemet, er følsomme for varme, og hvis skadet kan føre til lammelse i bakbenet.
Selv om ingen postoperativ dødelighet var direkte forbundet med den kirurgiske prosedyren, utviklet et lite antall hårløse SKH1-Hrhr-mus, som er spesielt følsomme for kulde, hypotermi og ikke klarte å gjenopprette etter den generelle anestesi. Derfor må det gis supplerende varme under alle estetiske hendelser, og konstant overvåking er nødvendig mens musen er bedøvet.
Metoden som er beskrevet i denne studien var ikke forbundet med infeksjonen på operasjonsstedet. Aseptisk teknikk må imidlertid brukes til å forhindre overføring av mikroorganismer til det kirurgiske såret i den perioperative perioden. Inokulasjon av såret med bioluminescerende eller fluorescerende mikroorganismer kan innlemmes i prosedyren. Denne teknikken kan være nyttig for å studere smittsomme organismer og deres patogenese25. For eksempel kan eksogen tilsetning eller injeksjon av bioluminescerende bakterier tillate overvåking av mikrobiell byrde ved hjelp av in vivo hele dyr imaging25. Gitt at musehår er kjent for å forstyrre in vivo hele dyr fluorescens og bioluminescence imaging, hårløse SKH1-Hrhr mus er ideelle verter for studier som involverer fluorescerende eller bioluminescence reportere.
Sårvevsprøver kan samles på forskjellige tidspunkter og behandles for histologisk og immunohistokjemisk analyse. Protein og RNA kan isoleres fra hudens biopsi og molekylærbiologiteknikker kan brukes til å vurdere uttrykket av viktige molekyler som er involvert i sårheling.
I den nåværende studien beskrev vi en eksperimentell modell av brennårshelbredelse og allogen hud engraftment. Denne prosedyren kan endres og tjene som en modell for prekliniske studier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense og École Polytechnique. Vi takker vår kollega Mr Yann Plantier fra École Polytechnique som ga innsikt og kompetanse som i stor tid hjalp produksjonen av videofilen. Forfatterne takker Mr Benoit Peuteman og Ms Charlotte Auriau fra INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif for deres dyrevelvære og omsorgsekspertise gitt i løpet av dette prosjektet.
1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' – 0,45 X 12mm |
96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
Depilating cream | Veet | ||
Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
Heating pad | Petelevage | 120070 | |
Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
Ocrygel | Tvm France | ### | |
Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |