कृंतक व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभावों से पूछताछ करने के लिए यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में द्विपक्षीय का उपयोग करने वाली पाइपलाइन
Summary
न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों के रोगजनन में हाल ही में खोजे गए रोग से जुड़े जीन की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है । गर्भाशय इलेक्ट्रोपेशन तकनीक में एक संशोधित द्विपक्षीय न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी में जीन हस्तांतरण और सामाजिक व्यवहार पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के कारक प्रभावों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन कई न्यूरोलॉजिकल रोगों के विषम आनुवंशिक आधार पर प्रकाश डाला, मस्तिष्क के विकास और समारोह में विशिष्ट जीन के योगदान का अध्ययन करने की आवश्यकता बढ़ जाती है। माउस मॉडल पर निर्भर विशिष्ट आनुवंशिक जोड़तोड़ की भूमिका का अध्ययन करने के लिए हमेशा संभव नहीं है क्योंकि ट्रांसजेनिक माउस लाइनें काफी महंगी हैं और कई उपन्यास रोग से जुड़े जीन अभी तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आनुवंशिक लाइनें नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, माउस लाइन बनाने में विकास और सत्यापन के वर्षों लग सकते हैं। गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में वीवो में सेल-प्रकार विशिष्ट तरीके से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए एक अपेक्षाकृत त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है जिसमें केवल एक विशेष आनुवंशिक हेरफेर प्राप्त करने के लिए डीएनए प्लाज्मिड विकसित करने की आवश्यकता होती है। गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में द्विपक्षीय का उपयोग ललाट कॉर्टेक्स पिरामिड न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। व्यवहार दृष्टिकोण के साथ इस जीन हस्तांतरण विधि का संयोजन एक प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स नेटवर्क के कार्य और किशोर और वयस्क चूहों के सामाजिक व्यवहार पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
Introduction
जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) ने मस्तिष्क की विकृतियों से जुड़े उपन्यास उम्मीदवार जीन की खोज को प्रेरित किया है1,2,3,4. ये अध्ययन एक प्रकार का पागलपन (एससीजेड) जैसे विनाशकारी न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों को समझने में विशेष रूप से फायदेमंद रहे हैं, जहां उपन्यास जीन की जांच ने अनुसंधान और चिकित्सीय हस्तक्षेप की नई लाइनों के लिए एक लॉन्चिंग पॉइंट के रूप में कार्य किया है5,6। SCZ के लिए जोखिम को शरण देने वाले जीन प्रसव पूर्व और प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) में पक्षपातपूर्ण अभिव्यक्ति दिखाते हैं, जो कई न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों की विकृति में फंसा हुआ क्षेत्र7। इसके अतिरिक्त, मनोरोग विकारों के माउस मॉडल पीएफसी नेटवर्क6,8,9में असामान्य गतिविधि प्रदर्शितकरतेहैं। इन परिणामों से पता चलता है कि SZC से जुड़े जीन इस क्षेत्र के विकास के तारों में एक भूमिका निभा सकता है । पीएफसी में कनेक्शन की स्थापना के लिए इन उम्मीदवार जीन के योगदान को समझने और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इन जीनों की न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों के रोगजनन में कारक भूमिका है, पशु मॉडलों का उपयोग करके आगे की जांच की आवश्यकता है । चूहों में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकें जो जन्म के पूर्व और प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान विशिष्ट न्यूरोनल सर्किट पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों के अध्ययन के लिए अनुमति देती हैं, आणविक तंत्र को समझने का एक आशाजनक तरीका है जो जीन अभिव्यक्ति को पीएफसी शिथिलता में परिवर्तन करता है।
आनुवंशिक माउस लाइनें मस्तिष्क के विकास और कार्य पर विशेष जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। हालांकि, ट्रांसजेनिक चूहों पर निर्भर होने के बाद से वहां हमेशा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइनों के लिए तंत्रिका सर्किट के विकास पर विशिष्ट जीन के प्रभाव की जांच नहीं कर रहे है सीमित किया जा सकता है । इसके अलावा, कस्टम माउस लाइनों को विकसित करने के लिए यह बेहद महंगा और समय लेने वाला हो सकता है। ट्रांसजेनिक चूहों को वायरल दृष्टिकोणों से मिलाने वाली चौरासी आनुवांशिक हेरफेर रणनीतियों के प्रयोग ने मस्तिष्क की समझ में क्रांतिकारी बदलाव किया है10,11,12. बहुत प्रगति के बावजूद, वायरल रणनीतियां वायरल वेक्टर प्रकार के आधार पर कुछ सीमाओं के साथ आती हैं, जिसमें पैकेजिंग क्षमता में सीमाएं शामिल हैं जो वायरल अभिव्यक्ति13 और वायरल अभिव्यक्ति14से जुड़े सेल विषाक्तता को प्रतिबंधित कर सकती हैं। इसके अलावा, अधिकांश प्रायोगिक स्थितियों में, एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का उपयोग करके मजबूत जीन अभिव्यक्ति के लिए लगभग 2 से 4 सप्ताह15की आवश्यकता होती है, जिससे प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान जीन में हेरफेर करने के लिए नियमित वायरल रणनीतियों को अव्यवहार्य बना दिया जाता है।
यूटेरो इलेक्ट्रोपॉपोरेशन (आईयूई) में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है जो तेजी से और सस्ती जीन हस्तांतरण16,17 के लिए अनुमति देता है, जब फ्लोरोसेंट लेबलिंग और फार्माकोजेनेटिक या ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के साथ मिलकर, न्यूरोनल सर्किट के कार्य को विच्छेदन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन जीन के विकास के साथ सेल-प्रकार विशिष्ट नॉक-डाउन या विशिष्ट जीन के नॉक आउट या प्रमोटरों18,19के मॉड्यूलेशन के माध्यम से अतिव्यक्त या ठीक से बदल सकता है। आईयूई का उपयोग करके जीन हेरफेर दृष्टिकोण विशेष रूप से लाभप्रद होते हैं जब संकीर्ण विकास खिड़कियों20के दौरान न्यूरोनल सर्किट पर जीन के प्रभाव का परीक्षण किए जाने की आवश्यकता होती है । आईयूई एक बहुमुखी तकनीक है और एक विशिष्ट प्रमोटर के तहत एक अभिव्यक्ति वेक्टर में एक जीन डालने से अतिव्यक्ति को आसानी से पूरा किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति का अतिरिक्त नियंत्रण विभिन्न शक्तियों के प्रवर्तकों का उपयोग करके या जीन अभिव्यक्ति को अस्थायी रूप सेनियंत्रितकरने में सक्षम प्रेरक प्रवर्तकों का उपयोग करके अभिव्यक्ति को चलाकर प्राप्त किया जा सकताहै। इसके अतिरिक्त, आईयूई विशिष्ट कॉर्टिकल परतों, कोशिका प्रकारों और मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है, जो हमेशा अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके संभव नहीं होता है5,17। तीन इलेक्ट्रोड के उपयोग के आधार पर आईयूई विन्यास में हाल की प्रगति, जो अधिक कुशल इलेक्ट्रिक-फील्ड वितरण उत्पन्न करती है, ने इस विधि के कार्यात्मक प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है और वैज्ञानिकों को नए सेल प्रकारों को लक्षित करने और दक्षता, सटीकता और कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने की अनुमति दी है जिन्हें23, 24लक्षित किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग हाल ही में पीएफसी फ़ंक्शन और प्रारंभिक अनुभूति5में एससीजेड से जुड़े जीन पूरक घटक 4ए (C4A)की कारक भूमिका निर्धारित करने के लिए किया गया था।
यहां प्रस्तुत एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन है जो पीएफसी सहित ललाट प्रांतस्था में उत्तेजक न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित करने के लिए जीन हस्तांतरण दृष्टिकोण को जोड़ती है, व्यवहार प्रतिमान के साथ जो न केवल सेल और सर्किट स्तर के परिवर्तनों के अध्ययन को सक्षम बनाता है, बल्कि व्यवहार को प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास और वयस्कता में निगरानी करने की अनुमति देता है। पहला वर्णित ललाट कॉर्टिकल क्षेत्रों में परत (एल) 2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को द्विपक्षीय रूप से स्थानांतरित करने की एक विधि है। इसके बाद, किशोर और वयस्क चूहों में सामाजिक व्यवहार को परखने के लिए कार्य रेखांकित किए जाते हैं। सेल काउंट को सेल ट्रांसफैक्शन की सीमा और स्थान की मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यवहार कार्यों के पूरा होने पर प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या को व्यवहार डेटा के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि अधिक से अधिक संख्या में संक्रमित कोशिकाएं व्यवहार में अधिक क्षोभ की ओर ले जाती हैं या नहीं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके साथ, एक पाइपलाइन का वर्णन किया गया है जो चूहों में व्यवहार परख के साथ ललाट कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी में रुचि के उपन्यास जीन के हेरफेर को जोड़ती है। इसके अलावा, यह पाइपलाइन प्रारंभिक प्रसवो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के लिए महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और संपादन के लिए लिसा Kretsge शुक्रिया अदा करते हैं । हम क्रूज़-मार्टिन लैब में सभी शोध सहायकों को धन्यवाद देते हैं जो व्यवहार दिमाग के परफ्यूजन और सेल गिनती के साथ मदद करने में अमूल्य थे। हम त्रिपोलर इलेक्ट्रोड के डिजाइन पर इनपुट के लिए Andrzej Cwetsch धन्यवाद, और टोड ब्लूटे और बोस्टन विश्वविद्यालय जीव विज्ञान इमेजिंग कोर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए। इस काम को एक NARSAD युवा अन्वेषक अनुदान (एसी-एम, #27202), ब्रेंटन आर Lutz पुरस्कार (एएलसी), आई एल्डेन माची पुरस्कार (एएलसी), एनएसएफ एनआरटी यूटीबी: न्यूरोफोटॉनिक नेशनल रिसर्च फैलोशिप (एएलसी, #DGE1633516), और बोस्टन विश्वविद्यालय स्नातक अनुसंधान अवसर कार्यक्रम (WWY) द्वारा समर्थित किया गया था । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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