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Biology

कृंतक व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभावों से पूछताछ करने के लिए यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में द्विपक्षीय का उपयोग करने वाली पाइपलाइन

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों के रोगजनन में हाल ही में खोजे गए रोग से जुड़े जीन की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है । गर्भाशय इलेक्ट्रोपेशन तकनीक में एक संशोधित द्विपक्षीय न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी में जीन हस्तांतरण और सामाजिक व्यवहार पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के कारक प्रभावों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन कई न्यूरोलॉजिकल रोगों के विषम आनुवंशिक आधार पर प्रकाश डाला, मस्तिष्क के विकास और समारोह में विशिष्ट जीन के योगदान का अध्ययन करने की आवश्यकता बढ़ जाती है। माउस मॉडल पर निर्भर विशिष्ट आनुवंशिक जोड़तोड़ की भूमिका का अध्ययन करने के लिए हमेशा संभव नहीं है क्योंकि ट्रांसजेनिक माउस लाइनें काफी महंगी हैं और कई उपन्यास रोग से जुड़े जीन अभी तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आनुवंशिक लाइनें नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, माउस लाइन बनाने में विकास और सत्यापन के वर्षों लग सकते हैं। गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में वीवो में सेल-प्रकार विशिष्ट तरीके से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए एक अपेक्षाकृत त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है जिसमें केवल एक विशेष आनुवंशिक हेरफेर प्राप्त करने के लिए डीएनए प्लाज्मिड विकसित करने की आवश्यकता होती है। गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में द्विपक्षीय का उपयोग ललाट कॉर्टेक्स पिरामिड न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। व्यवहार दृष्टिकोण के साथ इस जीन हस्तांतरण विधि का संयोजन एक प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स नेटवर्क के कार्य और किशोर और वयस्क चूहों के सामाजिक व्यवहार पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Introduction

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जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) ने मस्तिष्क की विकृतियों से जुड़े उपन्यास उम्मीदवार जीन की खोज को प्रेरित किया है1,2,3,4. ये अध्ययन एक प्रकार का पागलपन (एससीजेड) जैसे विनाशकारी न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों को समझने में विशेष रूप से फायदेमंद रहे हैं, जहां उपन्यास जीन की जांच ने अनुसंधान और चिकित्सीय हस्तक्षेप की नई लाइनों के लिए एक लॉन्चिंग पॉइंट के रूप में कार्य किया है5,6। SCZ के लिए जोखिम को शरण देने वाले जीन प्रसव पूर्व और प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) में पक्षपातपूर्ण अभिव्यक्ति दिखाते हैं, जो कई न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों की विकृति में फंसा हुआ क्षेत्र7। इसके अतिरिक्त, मनोरोग विकारों के माउस मॉडल पीएफसी नेटवर्क6,8,9में असामान्य गतिविधि प्रदर्शितकरतेहैं। इन परिणामों से पता चलता है कि SZC से जुड़े जीन इस क्षेत्र के विकास के तारों में एक भूमिका निभा सकता है । पीएफसी में कनेक्शन की स्थापना के लिए इन उम्मीदवार जीन के योगदान को समझने और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इन जीनों की न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों के रोगजनन में कारक भूमिका है, पशु मॉडलों का उपयोग करके आगे की जांच की आवश्यकता है । चूहों में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकें जो जन्म के पूर्व और प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान विशिष्ट न्यूरोनल सर्किट पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों के अध्ययन के लिए अनुमति देती हैं, आणविक तंत्र को समझने का एक आशाजनक तरीका है जो जीन अभिव्यक्ति को पीएफसी शिथिलता में परिवर्तन करता है।

आनुवंशिक माउस लाइनें मस्तिष्क के विकास और कार्य पर विशेष जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। हालांकि, ट्रांसजेनिक चूहों पर निर्भर होने के बाद से वहां हमेशा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइनों के लिए तंत्रिका सर्किट के विकास पर विशिष्ट जीन के प्रभाव की जांच नहीं कर रहे है सीमित किया जा सकता है । इसके अलावा, कस्टम माउस लाइनों को विकसित करने के लिए यह बेहद महंगा और समय लेने वाला हो सकता है। ट्रांसजेनिक चूहों को वायरल दृष्टिकोणों से मिलाने वाली चौरासी आनुवांशिक हेरफेर रणनीतियों के प्रयोग ने मस्तिष्क की समझ में क्रांतिकारी बदलाव किया है10,11,12. बहुत प्रगति के बावजूद, वायरल रणनीतियां वायरल वेक्टर प्रकार के आधार पर कुछ सीमाओं के साथ आती हैं, जिसमें पैकेजिंग क्षमता में सीमाएं शामिल हैं जो वायरल अभिव्यक्ति13 और वायरल अभिव्यक्ति14से जुड़े सेल विषाक्तता को प्रतिबंधित कर सकती हैं। इसके अलावा, अधिकांश प्रायोगिक स्थितियों में, एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का उपयोग करके मजबूत जीन अभिव्यक्ति के लिए लगभग 2 से 4 सप्ताह15की आवश्यकता होती है, जिससे प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान जीन में हेरफेर करने के लिए नियमित वायरल रणनीतियों को अव्यवहार्य बना दिया जाता है।

यूटेरो इलेक्ट्रोपॉपोरेशन (आईयूई) में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है जो तेजी से और सस्ती जीन हस्तांतरण16,17 के लिए अनुमति देता है, जब फ्लोरोसेंट लेबलिंग और फार्माकोजेनेटिक या ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के साथ मिलकर, न्यूरोनल सर्किट के कार्य को विच्छेदन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन जीन के विकास के साथ सेल-प्रकार विशिष्ट नॉक-डाउन या विशिष्ट जीन के नॉक आउट या प्रमोटरों18,19के मॉड्यूलेशन के माध्यम से अतिव्यक्त या ठीक से बदल सकता है। आईयूई का उपयोग करके जीन हेरफेर दृष्टिकोण विशेष रूप से लाभप्रद होते हैं जब संकीर्ण विकास खिड़कियों20के दौरान न्यूरोनल सर्किट पर जीन के प्रभाव का परीक्षण किए जाने की आवश्यकता होती है । आईयूई एक बहुमुखी तकनीक है और एक विशिष्ट प्रमोटर के तहत एक अभिव्यक्ति वेक्टर में एक जीन डालने से अतिव्यक्ति को आसानी से पूरा किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति का अतिरिक्त नियंत्रण विभिन्न शक्तियों के प्रवर्तकों का उपयोग करके या जीन अभिव्यक्ति को अस्थायी रूप सेनियंत्रितकरने में सक्षम प्रेरक प्रवर्तकों का उपयोग करके अभिव्यक्ति को चलाकर प्राप्त किया जा सकताहै। इसके अतिरिक्त, आईयूई विशिष्ट कॉर्टिकल परतों, कोशिका प्रकारों और मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है, जो हमेशा अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके संभव नहीं होता है5,17। तीन इलेक्ट्रोड के उपयोग के आधार पर आईयूई विन्यास में हाल की प्रगति, जो अधिक कुशल इलेक्ट्रिक-फील्ड वितरण उत्पन्न करती है, ने इस विधि के कार्यात्मक प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है और वैज्ञानिकों को नए सेल प्रकारों को लक्षित करने और दक्षता, सटीकता और कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने की अनुमति दी है जिन्हें23, 24लक्षित किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग हाल ही में पीएफसी फ़ंक्शन और प्रारंभिक अनुभूति5में एससीजेड से जुड़े जीन पूरक घटक 4ए (C4A)की कारक भूमिका निर्धारित करने के लिए किया गया था।

यहां प्रस्तुत एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन है जो पीएफसी सहित ललाट प्रांतस्था में उत्तेजक न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित करने के लिए जीन हस्तांतरण दृष्टिकोण को जोड़ती है, व्यवहार प्रतिमान के साथ जो न केवल सेल और सर्किट स्तर के परिवर्तनों के अध्ययन को सक्षम बनाता है, बल्कि व्यवहार को प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास और वयस्कता में निगरानी करने की अनुमति देता है। पहला वर्णित ललाट कॉर्टिकल क्षेत्रों में परत (एल) 2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को द्विपक्षीय रूप से स्थानांतरित करने की एक विधि है। इसके बाद, किशोर और वयस्क चूहों में सामाजिक व्यवहार को परखने के लिए कार्य रेखांकित किए जाते हैं। सेल काउंट को सेल ट्रांसफैक्शन की सीमा और स्थान की मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यवहार कार्यों के पूरा होने पर प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या को व्यवहार डेटा के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि अधिक से अधिक संख्या में संक्रमित कोशिकाएं व्यवहार में अधिक क्षोभ की ओर ले जाती हैं या नहीं।

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Protocol

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सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल पशु अनुसंधान के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे और बोस्टन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. डीएनए समाधान की तैयारी

  1. एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड खरीदें या वांछित प्रमोटर के साथ प्लाज्मिड में ब्याज की एक जीन को उपकच्छा दें। यहां कैग प्रमोटर (पीसीएजी-ईजीएफपी) के तहत ईजीएफपी युक्त प्लाज्मिड का इस्तेमाल किया गया।
    नोट: आवश्यक अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर वांछित प्रमोटर का निर्धारण करें। सामान्य तौर पर, सीएजी प्रमोटर के तहत प्लाज्मिड का उपयोग ट्रांसजीन के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जबकि सेल-टाइप-विशिष्ट प्रमोटर (जैसे, न्यूरॉन्स के लिए सिनेप्सिन) कम सक्रिय होते हैं। प्रयोगकर्ता को अनुभवजन्य रूप से प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए उचित अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित करना चाहिए।
  2. बैक्टीरिया को बदलना और उचित एंटीबायोटिक के साथ बैक्टीरियल मीडिया में स्टॉक बढ़ता है।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस से सक्षम कोशिकाओं (DH5α कोशिकाओं) को हटा दें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर गल जाएं।
    2. प्लाज्मिड डीएनए के 100 पीजी -100 एनजी को सक्षम कोशिकाओं के 30 माइक्रोन के साथ मिलाएं। 20 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण इनक्यूबेट।
    3. 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेटिंग करके हीट शॉक करें और फिर ट्यूब को 2 मिनट के लिए बर्फ में वापस लौटाएं।
    4. एलबी मीडिया के 200 - 1,000 माइक्रोन को परिवर्तित सक्षम कोशिकाओं में जोड़ें और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट तक बढ़ते हैं।
    5. प्लेट 200 रूपांतरित कोशिकाओं को एक पौंड आगर प्लेट में जो उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त प्लेट में रखते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करते हैं।
    6. अगले दिन, रात भर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ एलबी शोरबा के 200 मिलीलन में एक बैक्टीरियल कॉलोनी को इनक्यूबेट करें।
  3. मैक्सिपेप किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
    1. प्राप्त मैक्सिपेप किट में दिए गए निर्देशों का पालन करें। एल्यूशन स्टेप के लिए, डीएनए को एल्यूशन बफर में न करें। इसके बजाय, 1x PBS या आणविक ग्रेड पानी के या तो २०० μL का उपयोग कर डीएनए elute ।
    2. सुनिश्चित करें कि डीएनए की अंतिम एकाग्रता 1 μg/μL से अधिक है । यदि ब्याज के जीन युक्त प्लाज्मिड में रिपोर्टर जीन नहीं होता है, तो संक्रमित कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए एक रिपोर्टर अणु, जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ सह-ट्रांसफेक्ट करने के लिए एक प्लाज्मिड भी तैयार करें।
  4. प्रत्येक प्लाज्मिड के 1x पीबीएस में प्लाज्मिड डीएनए को 1x पीबीएस में कमजोर करके सर्जरी के लिए डीएनए समाधान तैयार करें। 0.1% की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए समाधान में तेजी से हरे रंग की डाई जोड़ें। द्विपक्षीय इंजेक्शन के लिए, प्रति बांध समाधान के 60 माइक्रोन तैयार करें (लगभग 10 पिल्ले के लिए)।
    नोट: यदि प्लाज्मिड में रिपोर्टर जीन नहीं है, तो जीएफपी के साथ सह-इलेक्ट्रोपोरेट। सह-विद्युतीकरण दरें आमतौर पर 95% या उससे अधिक होती हैं। हमारे हाथों में, ट्रांसफैक्शन दक्षता सह-ट्रांसफेक्शन से प्रभावित नहीं थी। सभी इलेक्ट्रोपोटेड प्लाज्मिड को 1 माइक्रोग्राम/माइक्रोन तक पतला किया जाना चाहिए।

2. आदेश या प्रजनन समय पर गर्भवती चूहों

  1. यदि समय पर गर्भवती चूहों का आदेश, आदेश चूहों भ्रूण दिवस (ई) 13 या पहले पर आने के लिए बांधों पर्याप्त समय के लिए पशु आवास के लिए acclimate अनुमति देते हैं ।  इस प्रोटोकॉल में सीडी-1 आउटस्ल नस्ल चूहों का उपयोग सभी प्रयोगों के लिए किया जाता है।
    नोट: पहले से कुछ दिनों के आदेश पशु तनाव को कम करने और पिल्ले की एक उच्च जीवित रहने की दर के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  2. यदि प्रजनन समय पर गर्भवती चूहों, एक पुरुष के साथ महिला चूहों जोड़ी रात भर, एक सप्ताह में एक बार । अगले सुबह (E0.5) पर एक योनि प्लग की उपस्थिति के लिए जांच करें। मादा चूहों के वजन की निगरानी करके गर्भावस्था का निर्धारण करें।
    नोट: गर्भावस्था के माध्यम से विभिन्न माउस उपभेदों का वजन अलग-अलग होता है, इसलिए उपयोग किए जाने वाले माउस तनाव के लिए विशिष्ट वजन का निर्धारण करें।
  3. चाहे चूहों को आदेश देना या प्रजनन करना, बांधों के तनाव को कम करने के लिए, पिंजरे में एक घोंसले के पैड और माउस घर रखें। तनाव को कम करने से पिल्ले की जीवित रहने की दर बढ़ाने में मदद मिल सकती है।

3. डिजाइन और तीन शूल इलेक्ट्रोड की विधानसभा

  1. इलेक्ट्रोड संपर्कों के लिए एक स्टॉक सामग्री के रूप में 0.063 की मोटाई के साथ ग्रेड 2 टाइटेनियम शीट का उपयोग करें।
  2. मानक मशीनिंग तकनीकों या सटीक हाथ उपकरणों का उपयोग करके, निम्नलिखित आयामों के साथ इलेक्ट्रोड बनाएं: 20 मिमी x 5 मिमी एक गोलाकार टिप के साथ और वापस ग्रूव करें। ठीक धैर्य सैंडपेपर का उपयोग कर किसी भी किसी भी किसी न किसी किनारों या burrs निकालें।
  3. इलेक्ट्रोड संपर्कों को तार करने के लिए, इलेक्ट्रोड के खांचे के चारों ओर 22 जी फंसे तांबे के तार लपेटें और टांका लगाकर सुरक्षित करें। गर्मी सिकोड़ने ट्यूबिंग का उपयोग करके इस संयुक्त को सुरक्षित रखें।
  4. फिर, दो नकारात्मक इलेक्ट्रोड बनाने के लिए एक अतिरिक्त गर्मी सिकोड़ने ट्यूबिंग का उपयोग करके ऑटोक्लेवेबल, गैर-प्रवाहकीय संदंश से जुड़े इलेक्ट्रोड को संलग्न करें। एक ऑटोक्लेवेबल, गैर-प्रवाहकीय सामग्री (जैसे सिर से एक सॉड ऑफ के साथ टूथब्रश हैंडल) के लिए एकल सकारात्मक इलेक्ट्रोड संलग्न करें। एक मानक केले प्लग के साथ तार के खुले छोर फिट।

4. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. सर्जरी से पहले सर्जरी क्षेत्र में गर्भवती बांधों लाओ पशु सुविधा से परिवहन के बाद तनाव के स्तर में कमी के लिए अनुमति देने के लिए ।
  2. स्टरलाइजिंग जर्मिसाइडल वाइप्स और फिर 70% इथेनॉल का उपयोग करके पूरी सर्जरी साइट को स्टरलाइज करें। सर्जरी शुरू करने से पहले दस्ताने बदलें।
  3. एक ग्लास मनका स्टरलाइजर में ऑटोक्लेव किए गए उपकरणों को स्टरलाइज करें।
  4. बाँझ 1x पीबीएस (लगभग 50 एमएल प्रति बांध) को 50 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करें और 38-40 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में एक ट्यूब रैक में रखें। थर्मामीटर के साथ बाँझ खारा तापमान की जांच करें।
  5. वॉटर हीटिंग सर्कुलेशन पंप को चालू करें ताकि सर्जरी शुरू होने से पहले इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सके। यह सर्जरी की अवधि के लिए माउस के शरीर के तापमान को बनाए रखेगा।
  6. प्रेशर-इंजेक्टर और इलेक्ट्रोपोरेटर चालू करें और सर्जरी से पहले उचित कार्य सुनिश्चित करें।
  7. संक्षेप में प्लाज्मिड डीएनए समाधान (चरण 1.4 में प्राप्त) को टेबलटॉप अपकेंद्रित्र पर स्पिन करें और इसे बर्फ पर रखें।
  8. एक पिपेट पुलर पर ग्लास पिपेट खींचें ताकि खींचा-ग्लास पिपेट की नोक व्यास में लगभग 50 माइक्रोन हो।
  9. डीएनए समाधान के 20-40 माइक्रोन के साथ पिपेट भरें (चरण 1.4 में प्राप्त)।
  10. सर्जरी के लिए सभी आवश्यक वस्तुओं की स्थापना करें जिसमें बालों को हटाने लोशन, आयोडीन, 70% इथेनॉल, कपास स्वैप, आंखों का मरहम, टांके, धुंध आदि शामिल हैं।
  11. एक सर्जरी शीट तैयार करें और आवश्यक जानकारी भरें, जैसे माउस आईडी और वजन, सर्जरी की तारीख, सर्जन का नाम आदि।

5. गर्भाशय इलेक्ट्रोपेशन सर्जरी में

  1. सर्जरी से पहले माउस का वजन करें और सर्जरी शीट पर इस पर ध्यान दें।
  2. 4% (v/v) ऑक्सीजन-आइसोफलुरेन मिश्रण के साथ एक इंडक्शन चैंबर में साँस लेने से एक गर्भवती माउस (E16) को एनेस्थेटाइज करें। एक बार माउस प्रेरित किया गया है, एक मुखौटा साँस लेना करने के लिए कदम और 1-1.5% (v/v) पर आइसोफ्लाणे बनाए रखने और सर्जरी के दौरान सांस लेने की निगरानी । जांच करें कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, सांस की दर ~55-65 साँस प्रति मिनट होनी चाहिए।
  3. प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिक का प्रशासन करें: बुप्रेनोरफिन (3.25 मिलीग्राम/किलो; अनुसूचित जाति) और मेलोक्सिकम (1-5 मिलीग्राम/किलो; अनुसूचित जाति) 10-30 मिलीलीटर/किलो की अधिकतम मात्रा में ।
  4. हेयर रिमूवल क्रीम का इस्तेमाल करें या ध्यान से पेट से फर निकालने के लिए रेजर का इस्तेमाल करें। पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ स्वैबिंग करके पेट को स्टरलाइज करें और इसे कम से कम 3 बार दोहराएं। एक बाँझ धुंध का उपयोग कर पेट के चारों ओर एक बाँझ क्षेत्र बनाएं, बाँझ ड्रेपिंग का भी उपयोग किया जा सकता है।
  5. पेट की त्वचा में एक मिडलाइन चीरा (3-4 सेमी) बनाओ, मांसपेशियों के माध्यम से काटने से बचने के लिए संदंश के साथ त्वचा को उठाना सुनिश्चित करें। फिर मांसपेशियों के माध्यम से काटें, फिर से महत्वपूर्ण अंगों को काटने से बचने के लिए मांसपेशियों को उठाने का ख्याल रखें।
  6. ध्यान से गर्भाशय सींग को रिंग संदंश का उपयोग करके बांध से बाहर खींचें और उन्हें धीरे से बाँझ क्षेत्र पर रखें, यह सुनिश्चित करें कि गर्भाशय सींग पैडिंग के साथ समर्थित है और बांध से बहुत दूर नहीं है। इस बिंदु से, गर्भाशय सींग को पूर्व-गर्म बाँझ 1x पीबीएस के साथ सर्जरी के बाकी हिस्सों में गीला रखें।
  7. या तो संदंश या उंगलियों का उपयोग कर एक भ्रूण की स्थिति। ध्यान से सिर के क्षैतिज विमान के संबंध में 45 डिग्री कोण पर खींचे गए ग्लास पिपेट डालें और पार्श्व वेंट्रिकल में डाला जाए, जिसे मस्तिष्क और आंख के मिडलाइन के बीच नेत्रहीन पहचाना जा सकता है। प्रत्येक पार्श्व वेंट्रिकल में या तो पिपेट को एक में डालकर और फिर दूसरे वेंट्रिकल (अनुशंसित) को इंजेक्ट करके या डीएनए समाधान को एक वेंट्रिकल में इंजेक्ट करके जब तक कि यह दोनों पार्श्व वेंट्रिकल में नहीं गुजरता है, प्रत्येक पार्श्व वेंट्रिकल में लगभग 2-3 माइक्रोन इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद एक वर्धमान आकार मौजूद है तो वेंट्रिकल को सफलतापूर्वक लक्षित किया गया है।
    नोट: कांच पिपेट की नोक सर्जरी के दौरान टूट सकता है । यदि ऐसा होता है, तो ग्लास पिपेट को बदलें, यह सुनिश्चित करते हुए कि गर्भाशय सींग को गीला रखा जाए जबकि एक नया पिपेट तैयार किया जाता है और डीएनए समाधान से भरा जाता है।
  8. ललाट प्रांतस्था में द्विपक्षीय कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, भ्रूण सिर के किनारों पर दो नकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति सिर्फ पार्श्व और थोड़ा काउडल पार्श्व वेंट्रिकल्स के लिए और आंखों के बीच सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति, बस विकासशील स्नाउट के सामने ।
  9. सुनिश्चित करें कि भ्रूण उदारता से गीला है। चार वर्ग दालें (पल्स अवधि = 50 एमएस अवधि, पल्स आयाम = 36 वी, इंटरपल्स अंतराल = 500 ms) लागू करें।
  10. इंजेक्ट और सभी भ्रूण इलेक्ट्रोपाउरेट, एक-एक करके जा रहा है ताकि प्रत्येक भ्रूण डीएनए समाधान इंजेक्शन के तुरंत बाद विद्युतीकृत किया जाता है । एक बार जब सभी भ्रूणों को इलेक्ट्रोपेटेड किया गया है, तो ध्यान से गर्भाशय सींग को पेट की गुहा में वापस डालें। इस चरण के दौरान, गर्भाशय हॉर्न प्लेसमेंट में सहायता करने के लिए बाँझ पीबीएस (1x) में पेट की गुहा को कोट करें।
  11. पेट की गुहा को बाँझ 1x पीबीएस के साथ भरें ताकि टांका पूरा होने के बाद कोई हवा की जेब न रह जाए। शोषक टांके और रेशम गैर अवशोषित टांके के साथ त्वचा के साथ मांसपेशियों टांके।
  12. बांध को कम से कम 1 घंटे के लिए गर्म कक्ष में पूरी तरह से ठीक होने दें। अगले 48 घंटे में बांधों पर नियमित रूप से जांच कराएं। जैसे ही बांध संज्ञाहरण से ठीक हो जाता है और चेतना आ जाती है, यह आगे बढ़ना और व्हिस्किंग शुरू कर देगा।
  13. यदि बांध दर्द के लक्षण दिखा रहे हैं, जैसे कि उनके शरीर को ऊपर और तेजी से सांस लेने के लिए पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक का प्रशासन करें । केवल प्रशासन अगर वहां दर्द के लक्षण के बाद से अनुसूचित जाति के इंजेक्शन बाहर बांधों तनाव सकता है, लेकिन अगर प्रयोगात्मक समूह को प्रशासित भी नियंत्रण समूह, या इसके विपरीत प्रशासन ।

6. एक मातृ बातचीत कार्य में जल्दी सामाजिक व्यवहार परख

नोट: यह प्रोटोकॉल पिछले प्रकाशनों5, 25से अनुकूलित है । चूहों के जन्म के बाद इस कार्य को पोस्टनेट डे (पी) 18-21 से करें।

  1. मातृ बातचीत मैं (MI1) कार्य में मातृ होमिंग व्यवहार ।
    1. सुनिश्चित करें कि पिंजरे बिस्तर सप्ताह में नहीं बदला गया है इससे पहले कि कार्य किया जाएगा ।
    2. एक खुला क्षेत्र (ओएफ) क्षेत्र प्राप्त करें या बनाएं जिसे निम्नलिखित आयामों के साथ आसानी से साफ किया जा सकता है (एक्रेलिक की सिफारिश की जाती है): 50 x 50 x 30 सेमी (लंबाई-चौड़ाई-ऊंचाई)। व्यवहार के प्रदर्शन के दौरान प्रकाश की स्थिति प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर भिन्न हो सकती है और उत्तेजना और चिंता जैसे व्यवहार के स्तर को प्रभावित कर सकती है। क्षेत्र के केंद्र पर स्थित एक मंद प्रकाश (लगभग 20 लक्स) के तहत व्यवहार प्रयोगों को रिकॉर्ड करें।
    3. व्यवहार परीक्षण से पहले दो दिनों के लिए, प्रति दिन पांच मिनट के लिए अखाड़े के एक कोने में एक जाल तार कप (जैसे पेंसिल कप) के नीचे रखकर बांध को अखाड़े में स्वीकार करें।
    4. परीक्षण के दिन, जो P18-21 से हो सकता है, चूहों को दूध देने से पहले, साफ-सुथरे पोंछे और 70% इथेनॉल के साथ अखाड़े को अच्छी तरह से साफ करें।
    5. दो विरोधी कोनों दोनों साफ बिस्तर युक्त और पिल्ला के घर पिंजरे से गंदे घोंसला बिस्तर युक्त एक कोने के साथ क्षेत्र की स्थापना की ।
    6. प्रत्येक पिल्ला को 3 मिनट के लिए क्षेत्र का पता लगाने की अनुमति दें, प्रत्येक पिल्ला को तटस्थ, खाली कोने में शुरू में रखें।
      नोट: 30 एफपीएस पर एक वीडियो कैमरे के साथ व्यवहार रिकॉर्ड करें। हर पिल्ला के बीच अखाड़े को अच्छी तरह से साफ करें और ताजा बिस्तर को बदलें। वैकल्पिक जो कोने एक नियंत्रण के रूप में ताजा बनाम घोंसला बिस्तर है अन्य कारणों (यानी, परिवेश शोर या प्रकाश) के कारण कोने वरीयता से बचने के लिए। यदि P18-21 विकास खिड़की में कई कूड़े चल रहा है, दिन के बीच एक ही समय में व्यवहार प्रयोग चलाते हैं । यह भी सुनिश्चित करें कि किसी दिए गए दिन के दौरान, नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह समानांतर रूप से चलाए जाते हैं।
  2. मातृ संपर्क द्वितीय (MI2) कार्य में मातृ सामाजिक संपर्क
    1. MI1 टास्क के तुरंत बाद इस टास्क को अंजाम दें।
    2. अखाड़ा स्थापित करें ताकि एक कोने में एक खाली तार जाल कप हो और विरोधी कोने में एक जाल तार कप के नीचे बांध हो। यदि चूहे कप को स्थानांतरित करने में सक्षम हैं, तो कप को वजन के साथ तौलें जिसे आंदोलन को रोकने के लिए कप के शीर्ष पर टेप किया जा सकता है। दूसरे कोने में घर के पिंजरे से गंदे घोंसले बिस्तर रखो ।
    3. MI2 टास्क चलाएं। पिल्ला को खाली कोने में रखें और 30 एफपीएस पर पांच मिनट के लिए व्यवहार रिकॉर्ड करें, पिल्ला का पता लगाने की अनुमति दें। प्रत्येक पिल्ला को अलग से चलाएं और हर पिल्ला के बीच पूरे क्षेत्र और तार जाल कप को अच्छी तरह से साफ करें।

7. वयस्क सामाजिक व्यवहार कार्य परख

  1. एक ही चूहों कि MI1 और MI2 कार्य में चला रहे थे एक बार वे वयस्क (P60-P70 या पुराने) में वयस्क सामाजिक व्यवहार चलाएं । यहां एकत्र किए गए आंकड़े एक अलग पलटन में किया गया था ।
  2. प्रयोगकर्ता को आदत की अनुमति देने के लिए लगातार 3 दिनों तक वयस्क चूहों को संभालें। सुनिश्चित करें कि चूहों द्वारा चलाए जाने वाले व्यवहार प्रयोगों से परिचित केवल प्रयोगकर्ता, आदर्श रूप से एक ही व्यक्ति सभी कार्य चलाते हैं।
  3. प्रत्येक दिन 5 मिनट के लिए 3 दिनों के लिए अखाड़े के लिए चूहों को आदत डालें।
  4. एक उपन्यास वस्तु मान्यता कार्य में परख व्यवहार सामान्य लोकोमोशन और एक उपन्यास वस्तु में रुचि को मापने के लिए। यह सामाजिक व्यवहार की अधिक सार्थक व्याख्या की अनुमति देगा यदि चूहों को सामाजिक बातचीत में एक विशिष्ट कमी है।
    1. अखाड़े के एक कोने में एक उपन्यास वस्तु (चिकनी, साफ सतहों के साथ छोटे प्लास्टिक खिलौना) के साथ 5 मिनट के लिए अखाड़े में चूहों को रखें। 70% इथेनॉल के साथ चूहों के बीच अच्छी तरह से क्षेत्र को साफ करें।
    2. उपन्यास वस्तु मान्यता के लिए, पहले उजागर 'उपन्यास ऑब्जेक्ट' रखें, जो अब परिचित है, एक कोने में और विरोधी कोने में एक नया उपन्यास वस्तु रखें। सभी कार्यों के लिए, एक नियंत्रण के रूप में परीक्षणों के बीच कोनों स्विच।
    3. उपन्यास सामाजिक संपर्क के लिए, यह सुनिश्चित करें कि उपन्यास चूहों उम्र, तनाव और सेक्स-मिलान कर रहे हैं और प्रत्येक दिन 5 मिनट के लिए लगातार 2 दिनों के लिए जाल तार कप के लिए आदत हैं। प्रत्येक परीक्षण के लिए, एक जाल तार कप के नीचे एक उपन्यास माउस रखें और विरोधी कोने में एक खाली जाल तार कप रखें। चूहों को व्यवहार रिकॉर्ड करते समय 5 मिनट के लिए अखाड़े का पता लगाने दें। प्रत्येक परीक्षण के बीच अखाड़े और जाल तार कप को अच्छी तरह से साफ करें।

8. व्यवहार डेटा का विश्लेषण

  1. शरीर के बुनियादी अंग ट्रैकिंग करने के लिए DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) का उपयोग करें। DeepLabCut को इंस्टॉल करने और उपयोग करने के तरीके पर विस्तृत नोट्स इसके गिटहब पेज पर पाए जा सकते हैं। इसके अलावा उपलब्ध एक कस्टम अजगर आधारित पुस्तकालय 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) बुनियादी शरीर के अंगों ट्रैकिंग के बाद डेटा के आगे विश्लेषण के लिए पूरा हो गया है। इस लाइब्रेरी का उपयोग करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी गिटहब पेज में पाई जा सकती है।
    1. एनाकोंडा स्थापना प्रक्रिया का उपयोग करके डीपलाबकट स्थापित करें। नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए डीपलबटट के जीयूआई सक्षम सीपीयू-केवल संस्करण के साथ-साथ जीपीयू-सक्षम संस्करण स्थापित करें।
    2. शरीर के अंगों पर नज़र रखने के लिए एक परियोजना बनाने के लिए नीचे दिए गए लिंक में उपलब्ध निर्देशों का पालन करें। Breifly, अपने डेटा सेट से फ्रेम का एक नमूना चुनें और मैन्युअल रूप से इन नमूना फ्रेम में प्रासंगिक शरीर के अंगों को चिह्नित करें। शरीर के अंगों की भविष्यवाणी करने और यह सत्यापित करने के लिए दीपलाबकट नेटवर्क को प्रशिक्षित करें कि प्रशिक्षित नेटवर्क पर्याप्त रूप से प्रदर्शन करता है।
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. शरीर की स्थिति को ट्रैक करने और एक खुले क्षेत्र में सरल बातचीत की पहचान करने के प्रयोजनों के लिए, जानवर के केंद्र की पहचान, सिर (परिचालन रूप से कान के बीच मध्य बिंदु के रूप में परिभाषित), बाएं और दाएं कान के साथ-साथ थूथन और पूंछ का आधार। शरीर के कई अंगों को ट्रैक करने के कारण उपयुक्त प्रतिस्थापन के लिए अनुमति देता है जब शरीर के कुछ अंग ऑक्सक्लूशन के कारण फ्रेम में गायब हो जाते हैं।
    4. पशु शरीर के अंगों के अलावा, पर्यावरण से संबंधित विभिन्न बिंदुओं को ट्रैक करें: जैसे व्यवहार बक्से के किनारों। ये कई सत्रों में ऐसे बिंदुओं के दोहराने योग्य अनुमान के लिए अनुमति देते हैं - भले ही व्यवहार सेटअप की स्थिति सत्रों के बीच कैमरे के सापेक्ष थोड़ी बदल जाती है।
    5. व्यवहार डेटा से शरीर के अंगों पर नज़र रखने के बाद, वीडियो के प्रत्येक फ्रेम पर भविष्यवाणी के साथ जुड़े विश्वास के आधार पर भविष्यवाणी की शरीर के अंग स्थानों को फ़िल्टर करने के लिए ध्यान रखना । कम आत्मविश्वास की भविष्यवाणियां आमतौर पर शरीर के अंगों से जुड़ी होती हैं। ऐसी भविष्यवाणियों के लिए, किसी दिए गए शरीर के हिस्से को दूसरे के साथ प्रतिस्थापित करें (यदि ऐसा प्रतिस्थापन उचित है) या शरीर के अन्य अंगों के स्थानों का उपयोग यह भविष्यवाणी करने के लिए करें कि शरीर का प्रासंगिक हिस्सा कहां होने की संभावना है। अधिकांश खुले क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए, कृंतक के शरीर का केंद्र शायद ही कभी ओक्लेड किया जाता है और उच्च सटीकता और सटीकता के साथ भविष्यवाणी की जा सकती है।
    6. जानवर के व्यवहार की कई विशेषताओं का अनुमान लगाने के लिए सेंट्रोइड के अनुमानित स्थान के साथ-साथ पर्यावरण में ट्रैक किए गए बिंदुओं के स्थान का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, खुले क्षेत्र के आंकड़ों में, स्थिति के समय व्युत्पन्न जानवर की गति की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. पूर्वाग्रह से बचने के लिए, जब संभव हो तो प्रयोगात्मक समूह के संबंध में सभी प्रयोग "अंधा" करें, खासकर जब परिणामों का आकलन करने में कोई व्यक्तिपरक तत्व हो। पुरुष और महिला समूहों में डेटा की पूलिंग द्वारा मुख्य प्रयोगात्मक परिणामों पर सेक्स मतभेदों के प्रभाव के लिए परीक्षण करें। सभी सांख्यिकीय परीक्षण समूहों के बीच जानवरों की एक समान संख्या का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ।

9. पोस्ट हॉक सेल गिनती सेल ट्रांसफैक्शन की सीमा की विशेषता के लिए

  1. माउस के अनुसार संक्रमित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें क्योंकि सभी चूहों में सफल ट्रांसफैक्शन नहीं होगा और संक्रमित कोशिकाओं की संख्या में भिन्नता होगी। इसे प्राप्त करने के लिए एक विधि में संक्रमित कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक इंटरपोलेशन के बाद कोरोनल वर्गों को बारी-बारी से संक्रमित न्यूरॉन्स की संख्या की गिनती करना शामिल है। इसके लिए, छवि और हर दूसरे कोरोनल अनुभाग (50 माइक्रोन) की गिनती करें।
    1. ऊतक को ठीक करने और फिर मस्तिष्क को विच्छेदन करने के लिए 4% पीएफए के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन का उपयोग करें। क्रायोप्रोटेक्शन के बाद, मस्तिष्क को कोरोनल खंडों में 50 माइक्रोन पर सेक्शन करें।
    2. ललाट प्रांतस्था के लिए, ब्रेग्मा से +2.75 और + 1.35 मिमी के भीतर कोशिकाओं की गणना करें। इन निर्देशांक ों में ललाट कॉर्टिकल क्षेत्र होते हैं और इसमें सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स (S1) का हिस्सा शामिल है।  इस विधि का उपयोग करके, अधिक कौडल कॉर्टिकल क्षेत्रों या उपकॉर्टिकल क्षेत्रों में कोई मनाया गया संक्रमित कोशिकाएं नहीं थीं।
    3. दाएं गोलार्द्ध से बाएं को निरूपित करना सुनिश्चित करें, जैसे कि खंड के दौरान एक सुई छेद के साथ एक गोलार्द्ध को चिह्नित करना, और कोशिकाओं को द्विपक्षीय रूप से गिनता। एक स्वचालित सेल गिनती सॉफ्टवेयर का उपयोग करें या मैन्युअल रूप से कोशिकाओं की गिनती, DAPI का उपयोग कर एक सेल शरीर की उपस्थिति की पुष्टि ।
  2. एक बार सेल काउंट प्राप्त होने के बाद, समावेशन के लिए एक सीमा निर्धारित करें। उदाहरण के लिए, केवल उन चूहों को शामिल करें जो विश्लेषण में द्विपक्षीय रूप से इलेक्ट्रोपेटेड हैं। आगे के विश्लेषण के लिए, व्यवहार प्रतिक्रियाओं से संक्रमित कोशिकाओं की संख्या को यह देखने के लिए सहसंबंधित करें कि क्या कोई संघ है। यह तकनीक कई मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करेगी, इसलिए यह जानकारी प्रदान करना आवश्यक है कि किस मस्तिष्क क्षेत्रों में आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया है।
    नोट: यह संभव है कि कुछ जीन हेरफेर न्यूरोनल माइग्रेशन, विनिर्देश और/या मौत बदल सकता है । सेल की गिनती के दौरान सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान की जांच की जाती है और प्रत्येक संक्रमित न्यूरॉन उस परत के भीतर है जो माना जाता है कि संक्रमित (यानी L2/3)। कॉर्टिकल मोटाई जैसे सकल शारीरिक मापों को भी पिया से कॉर्टिकल एल6 की दूरी को मापकर मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

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Representative Results

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कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर और तीन शूल-इलेक्ट्रोड का सफल विकास और कार्यान्वयन।
आईयूईईएस के लिए, एक सस्ती कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर पहले वर्णित डिजाइन27 (चित्रा 1A और चित्रा 2) केआधार पर बनाया गया था। एक तीन शूल इलेक्ट्रोड23,24 शूल के सुझावों से जुड़े 2 नकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ प्लास्टिक संदंश का उपयोग कर बनाया गया था और सकारात्मक इलेक्ट्रोड एक टूथब्रश हैंडल(चित्रा 1B)के अंत से जुड़ा हुआ था । उचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेटर और तीन शूल इलेक्ट्रोड का परीक्षण किया गया। आईयूई को गर्भाशय के सींगों को उजागर करके, प्लाज्मिड डीएनए इंजेक्शन और प्रत्येक भ्रूण(चित्रा 1C)को इलेक्ट्रोपोरा करके किया गया था। भ्रूण के सिर को स्थिर करने के लिए शूल का उपयोग करके तीन शूल इलेक्ट्रोड को दो हाथों में काफी आसानी से आयोजित किया जा सकता है(चित्रा 1 बी,दाएं) । L2/3 पीएफसी पिरामिड सोमस और उनकी प्रक्रियाओं को आईयूई के माध्यम से जीएफपी के साथ लेबल किया गया था, इस प्रकार जीन हस्तांतरण प्रयोग की सफलता की पुष्टि की गई थी ।

चूहों के ललाट प्रांतस्था में न्यूरॉन्स की एक बड़ी आबादी को द्विपक्षीय रूप से लक्षितकरना
संक्रमित कोशिकाओं की कुल संख्या और संक्रमित न्यूरॉन्स के वितरण की मात्रा किशोर और वयस्कचूहोंदोनों के लिए निर्धारित की जा सकती है । इस द्विपक्षीय आईयूई विधि का उपयोग करते हुए, लगभग 4000-6000 एल2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स पीसीएजी-जीएफपी प्लाज्मिड(चित्रा 3 ए)से संक्रमित थे। इसके अतिरिक्त, इनमें से अधिकांश कोशिकाओं को ललाट एसोसिएशन कॉर्टेक्स, मोटर एसोसिएशन क्षेत्रों, प्रीलिम्बिक और इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स और कक्षीय और पूर्वकाल सिंगुलेट कॉर्टेक्स(चित्रा 3 बी)सहित ललाट कॉर्टिकल क्षेत्रों में स्थानीयकृत किया गया था। एक प्रतिनिधि उदाहरण वयस्क नियंत्रण माउस (पी 60, चित्रा 3सी)में संक्रमित न्यूरॉन्स के रोस्ट्रल-कौडल वितरण और गोलार्द्धों(चित्रा 3 डी)के बीच वितरण को दर्शाता है। यह ललाट प्रांतस्था में L2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित करने और आनुवंशिक रूप से लेबल करने के लिए द्विपक्षीय आईयूई की क्षमता की पुष्टि करता है।

किशोर और वयस्क चूहों में सामाजिक व्यवहार।
मातृ संपर्क कार्य के पहले भाग ने घोंसला बिस्तर (मातृ बातचीत 1 [MI1]) खोजने के लिए नियंत्रण P18 संक्रमित चूहों (पीसीएजी-जीएफपी प्लाज्मिड के साथ आईयूई) की क्षमता का परीक्षण किया। यह किशोर चूहों की संवेदी क्षमताओं का परीक्षण करता है। नियंत्रण चूहों ताजा बिस्तर की खोज से अधिक समय बिताया अपने घोंसले बिस्तर की खोज । इस प्रकार, सुझाव है कि, जैसा कि उम्मीद थी, इन चूहों में बरकरार संवेदी क्षमताएं और अन्वेषणात्मक व्यवहार(चित्रा 4A और चित्रा 3B) है। कार्य के दूसरे भाग (MI2) चूहों की प्रवृत्ति का लाभ लेता है के साथ बातचीत और उनकी मां के पास होने के लिए प्रेरित किया जाएगा । इस कार्य में, पिल्ले ने अपना अधिकांश समय अपनी मां के पास बिताया, जबकि खाली कप या घोंसला बिस्तर(चित्रा 4C,D)की खोज में काफी कम समय बिताया। इन परिणामों से पता चलता है कि आईयूई नियंत्रण चूहे सामान्य होमिंग व्यवहार प्रदर्शित करते हैं।

वयस्क नियंत्रण चूहों (P60) समय का लगभग 35% खर्च एक उपन्यास वस्तु की खोज (कुल समय क्षेत्र में बिताया = 5 मिनट, चित्रा 5A,बी)। जब एक उपन्यास और परिचित वस्तु के साथ प्रस्तुत किया, वयस्क चूहों अधिक समय बिताया उपन्यास वस्तु की खोज, नवीनता में बरकरार रुचि का सुझाव(चित्रा 5सी, डी)। मिलनसारिता कार्य में, वयस्क चूहों को नियंत्रित करने के लिए एक उपन्यास माउस और खाली कप(चित्रा 5ई, एफ)की खोज में समान मात्रा में समय बिताया। स्वतंत्र रूप से उपलब्ध दीपलाबकट सॉफ्टवेयर26का उपयोग करके इस व्यवहार को स्वचालित रूप से ट्रैक किया गया था । उदाहरण वीडियो एक माउस पर विभिन्न बिंदुओं की सफल लेबलिंग दिखाते हैं, जिसमें अंग, सेंट्रोइड, सिर और कान(वीडियो 1)शामिल हैं। दीपलाबकट का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि चूहे माउस के शरीर की लंबाई की जांच करके कब पालन कर रहे थे, क्योंकि यह दूरी कम हो जाती है जब माउस पीछे(वीडियो 2) होताहै।

Figure 1
चित्रा 1: एक कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर और एक तीन शूल इलेक्ट्रोड का उपयोग करके गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉर्मेशन में। (A)कस्टम निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर (बाएं) और उसके सामने पैनल (दाएं) की छवि । 1: पावर इंडिकेटर। 2: पावर स्विच। 3: पल्स इंडिकेटर। 4: टेस्ट मोड स्विच।  5: वोल्टेज चयनकर्ता। 6: पल्स चौड़ाई नियंत्रण। 7: इलेक्ट्रोड (+) । 8: बाहरी ट्रिगर (टीटीएल) ।  9: इलेक्ट्रोड (-) । (ख)आईयूई (दाएं) के दौरान तीन शूल इलेक्ट्रोड को पकड़ने के लिए कस्टम निर्मित तीन शूल इलेक्ट्रोड (बाएं) की छवि और अनुशंसित विधि । (ग)बाएं: E16 बांधों में किए गए आईयूई सर्जरी को दर्शाते हुए आरेख । सही: प्रतिनिधि GFP के साथ आईयूई के प्रतिनिधि 20X confocal छवि L2/3 mPFC को लक्षित । पीला तारक: L2/3 GFP + न्यूरॉन्स । लेफ्ट पैनल स्केल बार = 250 माइक्रोन। सही पैनल स्केल बार = 75 माइक्रोन। आंकड़े और डेटा Comer एट अल से अनुकूलित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर का सर्किट आरेख। कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोराटर सर्किट को चित्रित करने वाला एक आरेख पहले से वर्णित उदाहरण27कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: IUE का उपयोग कर L2/3 ललाट प्रांतस्था न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को लक्षित । (ए)किशोर नियंत्रण चूहों में जीएफपी + कोशिकाओं की कुल संख्या । N = 15 चूहों। (ख)वयस्क नियंत्रण चूहों में प्रति क्षेत्र जीएफपी + कोशिकाओं का प्रतिशत। N = 22 चूहों को नियंत्रित करें। (ग)फ्रंटल कॉर्टेक्स में संक्रमित कोशिकाओं की रोस्ट्रो-कौडल सीमा दिखाने वाले प्रतिनिधि अनुभाग । बाएं पैनलों में छवियां सही पैनलों (लाल वर्ग) से क्षेत्रों को ज़ूम कर रहे हैं। फ्रंटल एसोसिएशन कॉर्टेक्स: एफआरए। अनुपूरक मोटर कॉर्टेक्स: एम 2। प्रीलिम्बिक कॉर्टेक्स: पीएल इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स: आईएल. पूर्वकाल सिंगुलेट कॉर्टेक्स: एसीसी. एंडिल ऑर्बिटोफ्रंटल कॉर्टेक्स: मो. वेंट्रल ऑर्बिटोफ्रंटल कॉर्टेक्स: वीओ. पार्श्व ऑर्बिटोफ्रंटल कॉर्टेक्स: लो। पूर्वकाल द्वीपीय प्रांतस्था: एअर इंडिया। ललाट कॉर्टेक्स क्षेत्र 3: Fr3।  प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स: M1।  प्राथमिक सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स: S1। पीरीफॉर्म कॉर्टेक्स: पीर। पूर्वकाल घ्राण नाभिक: एओ। कौडेट-पुटमेन: सीपीयू। काले नंबर: ब्रेग्मा निर्देशांक। लेफ्ट पैनल स्केल बार = 0.5 मिमी। राइट पैनल स्केल बार = 1 मिमी. मतलब ± SEM.(D)डेटा प्रत्येक माउस के भीतर दाएं बनाम बाएं गोलार्द्ध पर इलेक्ट्रोपेटेड कोशिकाओं की संख्या दिखाता है। पीसीएजी-जीएफपी प्लाज्मिड के साथ इलेक्ट्रोपेटेड 14 वयस्क चूहों से अनइंटरनेप्ट्रेटेड सेल मायने रखता है। जोड़ा टी टेस्ट । पी = 0.4757।  कॉमर एट अल, 20205से अनुकूलित डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: किशोर संक्रमित चूहों में संवेदी क्षमताओं, अन्वेषणात्मक व्यवहार और प्रारंभिक सामाजिक बातचीत का आकलन करना। (ए)एमआई1 कार्य में P18 नियंत्रण पिल्ला द्वारा पथ यात्रा (ब्लैक ट्रेस) का प्रतिनिधि उदाहरण। ताजा बिस्तर कोनों (ताजा 1 और 2, गुलाबी) और घोंसला बिस्तर कोने (हरा) । (ख)नियंत्रण पिल्ले MI1 कार्य में ताजा बिस्तर की तुलना में घोंसला बिस्तर की खोज अधिक समय बिताया । पी < 0.001, ****पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001। दो तरह से इनोवा और सिडक का पोस्ट टेस्ट । (ग)MI2 कार्य में एक P18 नियंत्रण पिल्ला द्वारा पथ कूच (ब्लैक ट्रेस) के प्रतिनिधि उदाहरण ।  बांध का कप (बांध: नीला), खाली कप (खाली कप: पीला), घोंसला बिस्तर कोने (घोंसला: हरा)। (घ)नियंत्रण पिल्ले खाली कप या घोंसला बिस्तर के साथ की तुलना में अपने बांध के साथ बातचीत अधिक समय बिताया । दो तरह से इनोवा और सिडक का पोस्ट टेस्ट । पी एंड एलटी; 0.0001। N = 15 चूहों को नियंत्रित करें। आंकड़े और डेटा Comer एट अल से अनुकूलित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क संक्रमित चूहों में सामाजिक बातचीत का आकलन करना। (A)उपन्यास ऑब्जेक्ट इंटरैक्शन टास्क में P60 कंट्रोल एडल्ट माउस द्वारा पथ कूच (ब्लैक ट्रेस) का प्रतिनिधि उदाहरण। गुलाबी कोने = उपन्यास वस्तु का स्थान। (ख)नियंत्रण चूहों ने उपन्यास वस्तु (5 मिनट कुल समय) की खोज में लगभग 35% समय बिताया। प्रतिशत समय कोने में बिताया उपन्यास वस्तु के साथ दिखाया गया है । (ग)उपन्यास ऑब्जेक्ट रिकग्निशन टास्क में P60 कंट्रोल एडल्ट माउस द्वारा पथ कूच (ब्लैक ट्रेस) के प्रतिनिधि उदाहरण । गुलाबी कोने: उपन्यास वस्तु का स्थान। हरा कोना: परिचित वस्तु का स्थान। (घ)नियंत्रण चूहों परिचित वस्तु की तुलना में उपन्यास वस्तु की खोज में अधिक समय बिताया । भेदभाव सूचकांक (डीआई) दिखाया गया; DI = ((उपन्यास वस्तु के साथ समय - परिचित वस्तु के साथ समय) / (परिचित वस्तु के साथ उपन्यास वस्तु + समय के साथ समय)। (ई)रोग यात्रा के प्रतिनिधि उदाहरण (काले ट्रेस) P60 नियंत्रण वयस्क माउस द्वारा मिलनसारिता कार्य में । गुलाबी कोने: जाल तार कप के तहत उपन्यास माउस का स्थान। हरा कोने: खाली जाल तार कप का स्थान। (च)नियंत्रण चूहों औसत समान समय पर खर्च एक खाली कप और एक उपन्यास माउस युक्त एक कप की खोज । ग्राफ डीआई ((उपन्यास माउस के साथ समय - खाली कप के साथ समय) / (खाली कप के साथ उपन्यास माउस + समय के साथ समय)) दिखाता है। चूंकि चूहों को कार्य से पहले सामाजिक रूप से अलग नहीं किया गया था, इसलिए एक उपन्यास माउस के साथ बातचीत करने की मुहिम कम हो सकती थी। हालांकि, अभी भी उपन्यास माउस की खोज थी। N = 22 चूहों को नियंत्रित करें। आंकड़े और डेटा Comer एट अल से अनुकूलित. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: व्यवहार कार्यों में जानवरों की स्थिति को स्वचालित रूप से ट्रैक करने के लिए DeepLabCut का उपयोग करना। सामाजिक संपर्क कार्य में एक वयस्क माउस का एक प्रतिनिधि वीडियो जिसे दीपलाबकट का उपयोग करके लेबल किया गया है। माउस के विभिन्न हिस्सों को अंग और सिर जैसे लेबल किया जा सकता है। सेंट्रोइड का उपयोग जानवर की स्थिति को ट्रैक करने के लिए उपयुक्त है लेकिन अन्य बिंदुओं का उपयोग अधिक जटिल व्यवहारों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि सजने-संवरने या पालन। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 2: व्यवहार कार्यों में पालन को स्वचालित रूप से ट्रैक करने के लिए DeepLabCut का उपयोग करना। सामाजिक संपर्क कार्य में एक वयस्क माउस का एक प्रतिनिधि वीडियो जिसे दीपलाबकट का उपयोग करके लेबल किया गया है। लाल तीर माउस के सिर की ओर इशारा करते हुए तीर के साथ माउस की लंबाई दिखाता है। माउस के पालन के साथ निर्धारित करने के लिए तीर की लंबाई का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि माउस की लंबाई, और तीर, माउस के पीछे होने पर छोटा हो जाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

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Discussion

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इसके साथ, एक पाइपलाइन का वर्णन किया गया है जो चूहों में व्यवहार परख के साथ ललाट कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी में रुचि के उपन्यास जीन के हेरफेर को जोड़ती है। इसके अलावा, यह पाइपलाइन प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास और वयस्कता दोनों के दौरान एक ही चूहों में व्यवहार के देशांतर अध्ययन के लिए अनुमति देता है। यह तकनीक जेनेटिक एनिमल मॉडल्स पर भरोसा करने की जरूरत को दरकिनार करती है जो समय और खर्च के मामले में महंगे हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल की ताकत यह है कि इसका उपयोग न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसके लिए हाल ही में जीडब्ल्यूए ने उपन्यास जेनेटिक एसोसिएशंस28,29की खोज की है । यद्यपि यह विधि उत्तेजक न्यूरॉन्स के सेल-प्रकार विशिष्ट ट्रांसफैक्शन प्रदान करती है, एक सीमा यह है कि अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारों जैसे इंटरन्यूरॉन्स या ग्लियल कोशिकाओं को लक्षित करना कम संभव है। हालांकि, कई अध्ययन अन्य मस्तिष्क कोशिका-प्रकार30, 31को लक्षित करने के लिए एक संशोधित दृष्टिकोण सुझाते हैं। इसके अतिरिक्त, भ्रूण के सिर के सापेक्ष इलेक्ट्रोड की स्थिति को संशोधित करके और आईयूई के समय को बदलकर, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को हिप्पोकैम्पस, एमिग्डाला, सेरिबैलम, और दृश्य, सोमाटोसेंसरी और मोटर कॉर्टिस24, 32सहित द्विपक्षीय रूप से संक्रमित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न विकासात्मक चरणों में आईयूई का प्रदर्शन करके विभिन्न कॉर्टिकल परतों को लक्षित किया जा सकता है।

यद्यपि आईयूई में उच्च सफलता दर हो सकती है, लेकिन कई बार आवश्यक विधि के महत्वपूर्ण कदम और समस्या निवारण होते हैं। यह आवश्यक है कि प्लाज्मिड को सावधानीपूर्वक सेल लाइनों में डिजाइन और मान्य किया जाता है। सभी क्लोनिंग के साथ के रूप में, देखभाल के लिए उचित जीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के रूप में इस तरह के अनुक्रम की पुष्टि फ्रेम में है लिया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, जीन हेरफेर (जैसे, अतिउपौता या मुंह) के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए पुष्टि की जानी चाहिए कि अभिव्यक्ति का स्तर माउस के विकास के समय पाठ्यक्रम और आईयूई की विकासात्मक तारीख में भिन्न हो सकता है। पश्चिमी दाग और क्यूपीसीआर का उपयोग आनुवंशिक अतिप्रेषण5की सीमा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है । जीएफपी जैसे रिपोर्टर जीन को एक अलग प्लाज्मिड में सह-इलेक्ट्रोपोरेट करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि जीएफपी के साथ टैग किए गए प्रोटीन को गलत तरीके से मोड़ा जा सकता है या उनका कार्य खो सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि किसी रिपोर्टर का उपयोग नहीं किया जाता है तो प्रयोगकर्ता ब्याज5के जीन के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए सीटू संकरण, क्यूपीसीआर या पश्चिमी दाग में उपयोग कर सकता है।

यदि प्लाज्मिड सत्यापित किए गए हैं, लेकिन ऐसे कोई जानवर नहीं हैं जो ट्रांसफैक्शन के लिए सकारात्मक प्रतीत होते हैं, तो उचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए सभी उपकरणों, विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेटर की अच्छी तरह से जांच करें। भ्रूण को वोल्टेज दालें वितरित करते समय, गर्भाशय सींग को गर्म नमकीन के साथ अच्छी तरह से गीला किया जाना चाहिए और इलेक्ट्रोड को वोल्टेज पल्स की पीढ़ी पर बुलबुले का उत्पादन करना चाहिए। यदि वोल्टेज वितरित होने पर कोई बुलबुले मौजूद नहीं होते हैं, तो इलेक्ट्रोपोरेटर के साथ समस्या होने की संभावना है।  वैकल्पिक रूप से, सीडीएनए को वेंट्रिकल में ठीक से इंजेक्ट नहीं किया गया हो सकता है। जब सीडीएनए को पार्श्व वेंट्रिकल में ठीक से इंजेक्ट किया जाता है, तो तेजी से हरे रंग की डाई एक वर्धमान के आकार में दिखाई देगी। अंत में, इलेक्ट्रोड की स्थिति महत्वपूर्ण है। यदि इलेक्ट्रोड थोड़ा गलत तरीके से तैनात हैं, कोशिकाओं ब्याज के क्षेत्र में संक्रमित नहीं किया जा सकता है । इसलिए, एक सफल ट्रांसफैक्शन की जांच करते समय, कुछ और कौडल मस्तिष्क वर्गों को देखने के लिए बचाएं, यदि शायद, गलत मस्तिष्क क्षेत्र संक्रमित था। एक बार इस विधि का अभ्यास किया गया है, एक अनुभवी सर्जन लगभग 90% की सफलता दर प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश कॉर्टिकल क्षेत्रों को द्विपक्षीय रूप से और यहां तक कि कुछ उपकॉर्टिकल क्षेत्रों को लक्षित करना संभव है, जिसमें हिप्पोकैम्पस23 शामिल हैं। कस्टम इलेक्ट्रोपोरेटर बनाकर लागत में और कटौती करना भी संभव है, जिसका उपयोग यहां प्रस्तुत आंकड़ों में5,27को किया गया था।

भविष्य के अध्ययन विभिन्न न्यूरोलॉजिकल रोगों में नए खोजे गए जीन उम्मीदवारों की भूमिका को समझने के लिए इस विधि का उपयोग कर सकते हैं। प्रस्तुत पाइपलाइन वयस्कता में प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास और व्यवहार पर विशिष्ट आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अपेक्षाकृत त्वरित परख प्रदान करती है। इस विधि का उपयोग करने वाले भविष्य के प्रयासों में यह पता लगाने की क्षमता है कि कौन से जीन SCZ और आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार सहित कुछ मस्तिष्क विकारों में एक कारक भूमिका निभाते हैं ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के लिए महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और संपादन के लिए लिसा Kretsge शुक्रिया अदा करते हैं । हम क्रूज़-मार्टिन लैब में सभी शोध सहायकों को धन्यवाद देते हैं जो व्यवहार दिमाग के परफ्यूजन और सेल गिनती के साथ मदद करने में अमूल्य थे। हम त्रिपोलर इलेक्ट्रोड के डिजाइन पर इनपुट के लिए Andrzej Cwetsch धन्यवाद, और टोड ब्लूटे और बोस्टन विश्वविद्यालय जीव विज्ञान इमेजिंग कोर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए। इस काम को एक NARSAD युवा अन्वेषक अनुदान (एसी-एम, #27202), ब्रेंटन आर Lutz पुरस्कार (एएलसी), आई एल्डेन माची पुरस्कार (एएलसी), एनएसएफ एनआरटी यूटीबी: न्यूरोफोटॉनिक नेशनल रिसर्च फैलोशिप (एएलसी, #DGE1633516), और बोस्टन विश्वविद्यालय स्नातक अनुसंधान अवसर कार्यक्रम (WWY) द्वारा समर्थित किया गया था । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

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References

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कृंतक व्यवहार पर आनुवंशिक प्रभावों से पूछताछ करने के लिए यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में द्विपक्षीय का उपयोग करने वाली पाइपलाइन
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Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

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