Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Трубопровод с использованием двустороннего в утробе матери электропорации для допроса генетического влияния на поведение грызунов

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

Роль недавно обнаруженных связанных с болезнью генов в патогенезах нейропсихиатрических расстройств остается неясной. Модифицированная двусторонняя в утробе матери техника электропорации позволяет передавать гены в больших популяциях нейронов и изучение причинно-следственного воздействия изменений экспрессии генов на социальное поведение.

Abstract

По мере того как исследования ассоциации генома проливают свет на неоднородные генетические основы многих неврологических заболеваний, возрастает необходимость изучения вклада конкретных генов в развитие мозга и функции. Опираясь на мышиные модели для изучения роли конкретных генетических манипуляций не всегда возможно, поскольку трансгенные линии мыши являются довольно дорогостоящими и многие новые болезни связанных генов еще не имеют коммерчески доступных генетических линий. Кроме того, для создания линии мыши могут работать годы разработки и проверки. В утробе электропорации предлагает относительно быстрый и простой метод для манипулирования экспрессией генов в клеточном типе специфическим образом in vivo, что требует только разработки плазмидной ДНК для достижения конкретной генетической манипуляции. Двусторонняя в утробе матери электропорация может быть использована для целевой больших популяций лобной коры пирамидальных нейронов. Сочетание этого метода передачи генов с поведенческими подходами позволяет изучить влияние генетических манипуляций на функцию префронтальных сетей коры и социальное поведение несовершеннолетних и взрослых мышей.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Геномные исследования ассоциации (GWAS) привели к открытию новых генов-кандидатов, которыесвязаны с патологиями мозга 1,2,3,4. Эти исследования были особенно полезны в понимании разрушительных нейропсихиатрических расстройств, таких как шизофрения (ССЗ), где исследование новых генов послужило стартовой точкой для новых направлений исследований итерапевтического вмешательства 5,6. Гены, укрывающие риск для СКЗ, проявляют предвзятое выражение в префронтальной коре (ПФУ) во время пренатального и раннего послеродового развития, региона, вовлеченного в патологию нескольких нейропсихиатрическихрасстройств 7. Кроме того, мышиные модели психических расстройств проявляют аномальную активность всетях ПФК 6,8,9. Эти результаты свидетельствуют о том, что гены, связанные с СЗК, могут играть определенную роль в развитии этого региона. Дальнейшее исследование с использованием моделей животных требуется, чтобы понять вклад этих генов-кандидатов в создание связей в ПФУ и определить, имеют ли эти гены причинно-следственную роль в патогенеза нейропсихиатрических расстройств. Методы генетических манипуляций у мышей, которые позволяют изучать изменения экспрессии генов на конкретных нейронных схемах во время пренатального и раннего послеродового развития, являются перспективным методом понимания молекулярных механизмов, которые связывают изменения экспрессии генов с дисфункцией ПФУ.

Генетические линии мыши предлагают метод для изучения влияния конкретных генов на развитие мозга и функции. Однако, полагаясь на трансгенных мышей может быть ограничение, поскольку Есть не всегда коммерчески доступны линии для изучения влияния конкретных генов на развитие нейронных цепей. Кроме того, разработка пользовательских линий мыши может быть чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой. Использование перекрестных генетических стратегий манипуляции, которые сочетают трансгенных мышей с вирусными подходами произвел революциюв понимании мозга 10,11,12. Несмотря на значительный прогресс, вирусные стратегии приходят с определенными ограничениями в зависимости от типа вирусного вектора, в том числе ограничения в упаковочной емкости, которыемогут ограничить вирусное выражение 13 и токсичность клеток, связанных свирусным выражением 14. Кроме того, в большинстве экспериментальных условий, надежная экспрессия генов с использованием адено-ассоциированного вируса (AAVs) требует примерно от 2 до 4недель 15, что делает обычные вирусные стратегии неосуществимыми для манипулирования генами во время раннего послеродового развития.

В утробе электропорации (IUE) является альтернативным подходом, который позволяет быстро и недорогопередачи генов 16,17, что,в сочетании с флуоресцентной маркировки и фармакогенетических или оптогенетических подходов, обеспечивает мощную платформу для вскрытия функции нейронных цепей. Кроме того, с развитием CRISPR-Cas9 гены редактирования генома могут быть переэкспрессированы или точно изменены через клеточный тип конкретных нокдаун или нокаут конкретных генов или через модуляцию промоутеров18,19. Подходы к манипуляции с генами с использованием IUE особенно выгодны, когда влияние генов на нейронные цепи должно быть проверено во время узких оконразвития 20. IUE является универсальной техникой и переэкспрессии может быть легко достигнуто путем вставки гена в вектор выражения под конкретным промоутером. Дополнительный контроль экспрессии генов может быть достигнут путем вождения выражение с помощью промоутеров различных сильных сторон или с помощью неизгладимых промоутеров, способныхвременно контролировать экспрессию генов 21,22. Кроме того, IUE позволяет таргетирование клеток в пределах конкретных корковых слоев, типов клеток и областей мозга, что не всегда возможно с помощьюдругих подходов 5,17. Последние достижения в конфигурации IUE, основанные на использовании трех электродов, который генерирует более эффективное распределение электрического поля, расширили функциональный репертуар этого метода и позволили ученым ориентироваться на новые типы клеток и увеличить эффективность, точность и количество клеток, которые могут бытьнаправлены 23,24. Этот метод был недавно использован для определения причинной роли компонента дополнения 4A (C4A), гена, связанного с СКЗ, в функции PFC и раннегопознания 5.

Представлено здесь экспериментальный трубопровод, который сочетает в себе подходы передачи генов к целевой больших популяций возбуждающей нейронов в лобной коре, в том числе PFC, с поведенческими парадигмами, которые не только позволяют изучать изменения клеточного и окружного уровня, но и позволяет контролировать поведение на протяжении всего раннего послеродового развития и взрослой жизни. Первый описанный метод двустороннего трансфекта больших популяций слоя (L) 2/3 пирамидальных нейронов в лобных корковых областях. Далее, задачи по анализу социального поведения у несовершеннолетних и взрослых мышей изложены. Количество клеток может быть получено после завершения поведенческих задач для количественной оценки степени и расположения трансфекции клеток. Кроме того, количество трансфицированных клеток может быть коррелировано с поведенческими данными, чтобы определить, если большее количество трансфектированных клеток приводит к большим возмущениям в поведении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все экспериментальные протоколы были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH) для исследований на животных и были одобрены Бостонским университетом институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Подготовка раствора ДНК

  1. Приобретете коммерческую плазмиду или субклон ген, представляющий интерес для плазмиды с желаемым промоутером. Здесь была использована плазмида, содержащая EGFP под руководством промоутера CAG (pCAG-EGFP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите желаемого промоутера на основе уровня выражения необходимо. В целом, плазмиды под ПРОМОУТЕР CAG могут быть использованы для достижения высоких уровней трансгена в то время как клеточный тип конкретных промоутеров (например, синапсин для нейронов), как правило, менее активны. Экспериментатор должен эмпирически определить соответствующие уровни экспрессии для каждой плазмиды.
  2. Преобразование бактерий и расти запасы в бактериальных средств массовой информации с соответствующим антибиотиком.
    1. Удалите компетентные клетки (клетки DH5) из -80 градусов по Цельсию и оттаять на льду в течение 20 минут.
    2. Смешайте 100 пг -100 нг плазмидной ДНК с 30 МКЛ компетентных клеток. Инкубировать смесь на льду в течение 20 мин.
    3. Выполните тепловой удар, инкубируя в водяной бане 42 градусов по Цельсию в течение 45 с, а затем вернуть трубку обратно на лед в течение 2 минут.
    4. Добавьте 200 - 1000 л Л.С. Л. к преобразованным компетентным клеткам и расти в течение 45 мин при 37 градусах по Цельсию на трясущимся инкубаторе.
    5. Плита 200 МКЛ преобразованных клеток в пластину LB агара, содержащую соответствующий антибиотик и инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    6. На следующий день инкубировать одну бактериальную колонию в 200 мл бульона LB с соответствующим антибиотиком при 37 градусов по Цельсию на встряхивания инкубатора на ночь.
  3. Очистите плазмидную ДНК с помощью комплекта maxiprep.
    1. Следуйте инструкциям, представленным в полученном комплекте maxiprep. Для elution шаг, не elute ДНК в буфер elution. Вместо этого, elute ДНК с использованием либо 200 йл стерильных 1x PBS или молекулярного класса воды.
    2. Убедитесь, что окончательная концентрация ДНК превышает 1 мкг/мл. Если плазмида, содержащая ген, представляющий интерес, не содержит гена репортера, то также подготовить плазмид для совместного трансфекта с молекулой репортера, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы обеспечить визуализацию трансфектированных клеток.
  4. Подготовь решение ДНК для операции, разбавляя плазмидную ДНК в 1x PBS до 1 мкг/ЛЬ окончательной концентрации каждой плазмиды. Добавьте быстрый зеленый краситель в раствор ДНК в окончательную концентрацию 0,1%. Для двусторонних инъекций приготовьте 60 мкл раствора на плотину (примерно 10 щенков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмида не содержит гена репортера, со-электропорат с GFP. Скорость со-электропорации, как правило, 95% или выше. В наших руках на эффективность трансфекции не повлияла ко-трансфекция. Все электропотезированные плазмиды должны быть разбавлены до 1 мкг/л.

2. Заказ или разведение времени беременных мышей

  1. При заказе времени беременных мышей, приказать мышам прибыть на эмбриональный день (E) 13 или раньше, чтобы плотины достаточно времени, чтобы акклиматизироваться к жилью животных.  В этом протоколе, CD-1 outbred мышей используются для всех экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заказ на несколько дней вперед снизит стресс животных и приведет к более высокой выживаемости щенков.
  2. При разведении приусадено-беременных мышей, пара самок мышей с самцом на ночь, раз в неделю. Проверьте наличие вагинальной вилки на следующее утро (E0.5). Определите беременность путем мониторинга веса самок мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные штаммы мыши имеют различные увеличения веса во время беременности, так что определить типичный прирост веса для мыши штамма используется.
  3. Будь то заказ или разведение мышей, чтобы уменьшить стресс плотин, место гнездования площадку и мышь дом в клетке. Снижение стресса может помочь увеличить выживаемость щенков.

3. Проектирование и сборка трех зубцового электрода

  1. Используйте титановые листы 2-го класса толщиной 0,063 в качестве запасного материала для электродных контактов.
  2. Используя стандартные методы обработки или высокоточные ручные инструменты, сделайте электроды со следующими размерами: 20 мм х 5 мм с закругленным кончиком и рифленой спиной. Удалите любые шероховатости или заусенцы с помощью тонкой наждачной бумаги песка.
  3. Чтобы проволоки электрод контактов, оберните 22 G мель медной проволоки вокруг канавки электрода и обеспечить путем припоя. Защитите этот сустав с помощью тепловых трубок.
  4. Затем прикрепите подключенный электрод к автоклавируемым, непроводяющим типсам, используя дополнительные тепловысодержающие трубки, чтобы сделать два отрицательных электрода. Прикрепите один положительный электрод к автоклавируемому, непроводякому материалу (например, ручке зубной щетки с отпиленой головой). Fit открытый конец провода со стандартной банановой вилкой.

4. Подготовка к операции

  1. Принесите беременные плотины в область хирургии по крайней мере за 30 минут до операции, чтобы обеспечить снижение уровня стресса после транспортировки из животного объекта.
  2. Стерилизовать весь хирургический участок с помощью стерилизации гермицидных салфеток, а затем 70% этанола. Изменение перчатки до начала операции.
  3. Стерилизовать автоклавные инструменты в стеклянном стерилизаторе бисера.
  4. Передача стерильных 1x PBS (около 50 мл на плотину) до 50 мл конических трубок и поместите в трубку стойку в водяной бане с подогревом до 38-40 градусов по Цельсию. Проверьте стерильную соленую температуру с помощью термометра.
  5. Включите насос циркуляции нагрева воды так, чтобы он нагревался до 37 градусов по Цельсию до начала операции. Это позволит поддерживать температуру тела мыши в течение всего срока операции.
  6. Включите давление-инжектор и электропоратор и обеспечить надлежащую функцию до операции.
  7. Кратко закрутить плазмидный раствор ДНК (полученный в шаге 1.4) на столешницу центрифугу и поместить его на лед.
  8. Потяните стеклянные пипетки на пипетку шкив так, что кончик вытащил стекла пипетки составляет около 50 мкм в диаметре.
  9. Заполните пипеткой 20-40 МКЛ раствора ДНК (полученного в шаге 1.4).
  10. Настройка всех необходимых предметов для хирургии, включая лосьон для удаления волос, йод, 70% этанола, хлопковые свопы, мазь для глаз, швы, марлю и т.д.
  11. Подготовьте хирургический лист и заполните необходимую информацию, такую как удостоверение личности мыши и вес, дата операции, имя хирурга и т.д.

5. В хирургии электропорации матки

  1. Взвесьте мышь перед операцией и обратите внимание на это на листе операции.
  2. Обезболить беременную мышь (E16) путем вдыхания в индукционной камере с 4% (v/v) кислородно-изофлюрановой смесью. После того, как мышь была индуцирована, перейти к маске ингаляции и поддерживать изофлюран на 1-1,5% (V / V) и контролировать дыхание на протяжении всей операции. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется, скорость дыхания должна быть 55-65 вдохов за минуту.
  3. Администрировать предоперационные анальгетики: бупренорфин (3,25 мг/кг; СК) и мелоксикам (1-5 мг/кг; SC) при максимальном объеме 10-30 мл/кг.
  4. Используйте крем для удаления волос или тщательно использовать бритву, чтобы удалить мех из живота. Стерилизовать живот путем мазка с povidone йода и 70% этанола и повторить это по крайней мере 3 раза. Создать стерильное поле вокруг живота с помощью стерильной марли, стерильные драпировки также могут быть использованы.
  5. Сделать разрез средней линии (3-4 см) в брюшной коже, будучи уверенным, чтобы поднять кожу с типсами, чтобы избежать резки через мышцы. Затем прорезать мышцы, снова заботиться, чтобы поднять мышцы, чтобы избежать резки жизненно важных органов.
  6. Аккуратно вытащите рога матки из плотины с помощью щачатых типсов и аккуратно поместите их на стерильное поле, убедившись, что рог матки поддерживается обивкой и не дергает слишком далеко от плотины. С этого момента, держать рог матки увлажненной на протяжении всей остальной части операции с предварительно разогретой стерильной 1x PBS.
  7. Позиция эмбриона с помощью миппов или пальцев. Аккуратно вставьте вытянутую стеклянную пипетку под углом 45 градусов по отношению к горизонтальной плоскости головы и вставьте в боковой желудочек, который можно визуально определить между средней линией мозга и глазом. Ввись около 2-3 йл в каждый боковой желудочек либо вставив пипетку в один, а затем другой желудочек (рекомендуется) или путем введения раствора ДНК в один желудочек, пока он не проходит в обоих боковой желудочков. Желудочек был успешно направлен, если форма полумесяца присутствует после инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик стеклянной пипетки может сломаться во время операции. Если это произойдет, замените стеклянную пипету, гарантируя, что рога матки будут увлажнены, пока готовится новая пипетка и заполняется раствором ДНК.
  8. Чтобы трансфициентные клетки двусторонне в лобной коре, положение двух отрицательных электродов по бокам головы эмбрионов только боковой и слегка caudal к боковым желудочкам и положение положительного электрода между глазами, как раз перед развивающейся морды.
  9. Убедитесь, что эмбрион щедро увлажняется. Нанесите четыре квадратных импульса (длительность пульса - 50 мс, амплитуду пульса - 36 В, межпульсовой интервал - 500 мс).
  10. Инъекции и электропорат всех эмбрионов, происходит один за другим, так что каждый эмбрион электропотери сразу после инъекции раствора ДНК. После того, как все эмбрионы были электропотери, тщательно вставьте рога матки обратно в брюшную полость. Во время этого шага, пальто брюшной полости в стерильных PBS (1x), чтобы помочь размещения рога матки.
  11. Заполните брюшную полость стерильной 1x PBS так, чтобы никакие воздушные карманы не оставались после зашвасывания завершена. Шов мышцы с абсорбируемыми швами и кожу с шелковыми неаспасаемыми швами.
  12. Разрешить плотины полностью восстановить в нагретой камере, по крайней мере 1 ч. В ближайшие 48 ч регулярно проверяйте плотины. Как плотина восстанавливается после анестезии и приходит в сознание, он начнет двигаться и взбивая.
  13. Администрирование послеоперационных анальгетиков, если плотины проявляют признаки боли, такие как balling их тела и дыхание быстро. Только управлять, если Есть признаки боли, поскольку инъекции SC может подчеркнуть плотины, но если вводить экспериментальной группы также управлять контрольной группы, или наоборот.

6. Анализ раннего социального поведения в задаче материнского взаимодействия

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущих публикаций5,25. Выполните эту задачу после того, как мыши родились от послеродового дня (P) 18-21.

  1. Материнское самонаведение в материнском взаимодействии I (MI1) задача.
    1. Убедитесь, что постельные принадлежности в клетке не меняются в течение недели до выполнения задачи.
    2. Получить или построить открытое поле (OF) арене, которые могут быть легко очищены (акрил рекомендуется) со следующими размерами: 50 х 50 х 30 см (длина ширины высоты). Условия освещения во время выполнения поведения могут варьироваться в зависимости от экспериментального вопроса и может влиять на уровни возбуждения и тревоги, как поведение. Запись поведенческих экспериментов под тусклым светом (примерно 20 люкс), расположенных над центром арены.
    3. За два дня до тестирования поведения, акклиматизировать плотину на арену, поместив его под чашку проволоки сетки (например, карандаш чашку) в углу арены в течение пяти минут в день.
    4. В день тестирования, который может быть от P18-21, прежде чем мыши были отувки, очистить арену тщательно с дезинфекции салфетки и 70% этанола.
    5. Настройка арены с двумя противоположными углами, как содержащие чистые постельные принадлежности и один угол, содержащий загрязненные постельные принадлежности гнезда из домашней клетки щенка.
    6. Позвольте каждому щенку исследовать арену в течение 3 минут, поместив каждого щенка в нейтральный, пустой угол в начале.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись поведения с видеокамерой на 30 fps. Тщательно очистить арену между каждым щенком и заменить свежие постельные принадлежности. Альтернативный, какой угол свежий по сравнению с гнездом постельных принадлежностей в качестве контроля, чтобы избежать предпочтения углу из-за других причин (например, окружающий шум или свет). Если работает несколько пометов через P18-21 развития окна, запустить поведенческие эксперименты в то же время между днями. Кроме того, обеспечить, чтобы в течение данного дня, контроль и экспериментальные группы работают параллельно.
  2. Материнское социальное взаимодействие в задаче материнского взаимодействия II (MI2)
    1. Выполните эту задачу сразу после выполнения задачи MI1.
    2. Навеяте арену так, чтобы один уголок содержит пустую чашку проволочной сетки, а противоположный уголок содержит плотину под чашкой сетки. Если мыши в состоянии переместить чашку, весят чашку вниз с весом, который может быть приклеен к верхней части чашки, чтобы предотвратить движение. Положите загрязненные постельные принадлежности гнезда из домашней клетки в другом углу.
    3. Вывыполнения задачи MI2. Поместите щенка в пустой угол и запись поведения в течение пяти минут при 30 fps, что позволяет щенку исследовать. Вы запустите каждого щенка отдельно и тщательно очистить всю арену и проволоки сетки чашки между каждым щенком.

7. Анализ задачи социального поведения взрослых

  1. Запуск взрослого социального поведения в тех же мышей, которые были запущены в MI1 и MI2 задачи, как только они взрослые (P60-P70 или старше). Собранные здесь данные были сделаны в отдельной когорте.
  2. Ручка взрослых мышей в течение 3 дней подряд, чтобы привыкание к экспериментатору. Убедитесь, что только экспериментаторы, которые были ознакомлены с мышами запустить эксперименты поведения, в идеале имеют тот же человек запустить все задачи.
  3. Привычка мышей на арену OF в течение 3 дней в течение 5 минут каждый день.
  4. Поведение анализа в задаче распознавания новых объектов для измерения общего передвижения и интереса к роману объекта. Это позволит более значимое толкование социального поведения, если мыши имеют определенный дефицит в социальных взаимодействий.
    1. Поместите мышей на арену в течение 5 минут с новым объектом (маленькая пластиковая игрушка с гладкими, очищаемыми поверхностями) в одном углу арены. Очистите арену тщательно между мышами с 70% этанола.
    2. Для распознавания новых объектов поместите ранее выставленный «новый объект», который теперь знаком, в одном углу и поместите новый новый объект в противоположный угол. Для всех задач переключитесь углы между испытаниями в качестве управления.
    3. Для новых социальных взаимодействий, убедитесь, что новые мыши возраста, напряжения и пола совпадают и акклиматизированы к чашке проволоки сетки в течение 2 дней подряд в течение 5 минут каждый день. Для каждого испытания поместите новую мышь под чашку сетки проволоки и в противоположном углу поместите пустую чашку проволоки сетки. Пусть мыши исследовать арену в течение 5 минут во время записи поведения. Очистите арену и чашки сетки проволоки тщательно между каждым испытанием.

8. Анализ поведенческих данных

  1. Используйте DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) для выполнения основных отслеживания части тела). Подробные заметки о том, как установить и использовать DeepLabCut можно найти на своей странице GitHub. Также доступна пользовательская библиотека на основе питона 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) для дальнейшего анализа данных после завершения отслеживания основных частей тела. Более подробную информацию о том, как использовать эту библиотеку, можно найти на странице GitHub.
    1. Установите DeepLabCut с помощью процесса установки анаконды. Установите GUI, способный процессор только версия DeepLabCut, а также GPU-версии для обучения сети.
    2. Следуйте инструкциям, доступным в ссылке ниже, чтобы создать проект для отслеживания частей тела. Брейфли, выберите образец кадров из набора данных и вручную отметите соответствующие части тела в этих отобранных кадрах. Обучить сеть DeepLabCut для прогнозирования частей тела и проверки того, что обученная сеть работает адекватно.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Для отслеживания положения тела и выявления простых взаимодействий в открытом поле, определить центроид животного, голову (оперативно определяется как средняя точка между ушами), левый и правый уши, а также морду и основание хвоста. Наличие нескольких частей тела отслеживается позволяет соответствующую замену, когда некоторые части тела отсутствуют в кадре из-за окклюзии.
    4. Помимо частей тела животных, отслеживать различные точки, связанные с окружающей средой: такие, как края поведения коробки. Они позволяют повторить оценку таких точек через несколько сеансов - даже если положение поведенческой установки немного меняется по отношению к камере между сессиями.
    5. После отслеживания частей тела из данных о поведении, позаботьтесь, чтобы фильтровать прогнозируемые места части тела на основе уверенности, связанной с прогнозом на каждом кадре видео. Низкие прогнозы доверия, как правило, связаны с окклюдными частями тела. Для таких прогнозов замените часть тела другой (если такая замена уместна) или используйте расположение других частей тела, чтобы предсказать, где может быть соответствующая часть тела. Для большинства открытых полевых применений центроид тела грызунов редко затмевается и может быть предсказан с высокой точностью и точностью.
    6. Используйте прогнозируемое расположение центроидов, а также расположение отслеживаемых точек в окружающей среде для оценки ряда особенностей поведения животного. Например, в открытых полевых данных для расчета скорости животного можно использовать производное от положения время.
  2. Чтобы избежать предвзятости, выполните все эксперименты "слепой" по отношению к экспериментальной группе, когда это возможно, особенно когда есть какой-либо субъективный элемент в оценке результатов. Тест на влияние половых различий на основные экспериментальные результаты путем объединения данных в мужские и женские группы. Все статистические тесты предназначены для проверки равного количества животных между группами.

9. Пост-специальный подсчет клеток для характеристики степени трансфекции клеток

  1. Определите количество клеток, трансфицированных на мышь, так как не все мыши будут иметь успешную трансфекцию и будут различия в количестве трансфицированных клеток. Один из методов достижения этой цели включает в себя подсчет числа трансфицированных нейронов в чередующихся короналовых секциях с последующим интерполяцией для оценки общего числа трансфицированных клеток. Для этого, изображение и рассчитывать любой другой корональной секции (50 мкм).
    1. Используйте транскардиальные перфузии с 4% PFA, чтобы исправить ткани, а затем вскрыть мозг. После криопротекторной операции разделите мозг в корональных секциях на 50 мкм.
    2. Для лобной коры, подсчитайте клетки в пределах 2,75 и 1,35 мм от Брегмы. Эти координаты содержат лобные корковые области и включают в себя часть соматосенсной коры (S1).  Используя этот метод, не наблюдалось трансфектных клеток в более хвостовых корковых регионах или подкорковых областях.
    3. Обязательно обозначайте левое из правого полушария, например, отмечая одно полушарие отверстием иглы во время сечения, и подсчитывайте клетки на двусторонней основе. Используйте автоматизированное программное обеспечение для подсчета ячеек или подсчитайте ячейки вручную, подтверждая наличие тела клетки с помощью DAPI.
  2. Как только количество ячеев получено, установите порог для включения. Например, только включить мышей, которые двусторонне электропотери в анализе. Для дальнейшего анализа соотносите количество клеток, трансфицированных с поведенческими реакциями, чтобы увидеть, есть ли связь. Этот метод будет направлен на несколько областей мозга, поэтому необходимо предоставить информацию о том, какие области мозга были генетически манипулировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вполне возможно, что манипулирование определенными генами может изменить миграцию нейронов, спецификации и / или смерти. Убедитесь во время подсчета клеток, что анатомия мозга рассматривается и каждый трансфицированный нейрон находится в пределах слоя, который якобы был трансфицирован (т.е. L2/3). Грубые анатомические измерения, такие как толщина коры, также могут быть количественно оценены путем измерения расстояния от пиа до корковой L6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Успешная разработка и внедрение специально построенного электропоратора и трех зубцов-электродов.
Для IUEs, недорогой специально построенный электропоратор был построен на основе ранее описанногодизайна 27 (рисунок 1A и рисунок 2). Три зубца электрод был сделан23 , 24сиспользованием пластиковых щипцов с 2 отрицательными электродами прилагается к кончикам зубцов и положительный электрод был прикреплен к концу ручки зубной щетки (Рисунок 1B). Электропоратор и три зубца электрод были протестированы для обеспечения надлежащей функции. IUE была выполнена путем разоблачения рога матки, инъекционные плазмидной ДНК и электропористинга каждого эмбриона(рисунок 1C). Три зубца электрод может быть проведен довольно легко в двух руках, как показано (Рисунок 1B, справа), используя зубцы для стабилизации головы эмбриона. L2/3 PFC пирамидальные сомы и их процессы были помечены GFP через IUE, тем самым подтверждая успех эксперимента по передаче генов.

Ориентация на большую популяцию нейронов на двусторонней основе в лобной коре мышей.
Общее количество трансфицированных клеток и распределение трансфицированных нейронов можно количественно определить как для несовершеннолетних, так и для взрослых мышей5. Используя этот двусторонний метод IUE, около 4000-6000 L2/3 пирамидальных нейронов были трансфицированы с плазмидой pCAG-GFP(рисунок 3A). Кроме того, большинство из этих клеток были локализованы в лобных корковых областях, включая лобную ассоциацию коры, области моторных ассоциаций, прелимбической и инфралибической коры и орбитальной и передней cingulate коры (Рисунок 3B). Репрезентативный пример показывает рострал-каудальное распределение трансфицированных нейронов в мыши управления для взрослых (P60, рисунок 3C)и распределение между полушариями(рисунок 3D). Это подтверждает способность двусторонних МЭЭ ориентироваться и генетически маркировать большие популяции пирамидальных нейронов L2/3 в лобной коре.

Социальное поведение у несовершеннолетних и взрослых мышей.
Первая часть задачи материнского взаимодействия проверила способность контроля P18 трансфектированных мышей (IUE с плазмидой pCAG-GFP) найти гнездовидные постельные принадлежности (материнское взаимодействие 1 «MI1»). Это проверяет сенсорные способности несовершеннолетних мышей. Контроль мышей провел больше времени, исследуя их гнездо постельных принадлежностей, чем изучение свежих постельных принадлежностей. Таким образом, предполагая, что, как и ожидалось, эти мыши имеют нетронутые сенсорные способности иисследовательское поведение (рисунок 4A и рисунок 3B). Вторая часть задачи (MI2) использует тенденцию мышей быть мотивированными, чтобы взаимодействовать с и быть рядом с их матерью. В этой задаче, щенки провели большую часть своего времени рядом с матерью, тратя значительно меньше времени на изучение пустой чашки или гнезда постельныхпринадлежностей (рисунок 4C,D). Эти результаты свидетельствуют о том, что IUE контроля мышей демонстрируют нормальное поведение самонаведения.

Взрослые мыши управления (P60) провел около 35% времени, исследуя новый объект (общее время, проведенное на арене 5 мин, рисунок 5A,B). Когда представлен роман и знакомый объект, взрослые мыши потратили больше времени на изучение романа объекта, предлагая нетронутыми интерес к новизне (Рисунок 5C,D). В задачи общительности, контроль взрослых мышей провел аналогичное количество времени, исследуя новую мышь и пустуючашку (рисунок 5E,F). Такое поведение автоматически отслеживалось с помощью свободно доступного программного обеспечения DeepLabCut26. Пример видео показывают успешную маркировку различных точек на мыши, в том числе конечностей, центроидов, головы и ушей(Видео 1). DeepLabCut был использован для определения, когда мыши были воспитания путем изучения длины тела мыши, так как это расстояние становится короче, когда мышь задней (Видео 2).

Figure 1
Рисунок 1: В утробе электропорации с использованием специально построен электропоратора и три зубца электрода. (A)Изображение изготовленного на заказ электропоратора (слева) и его передней панели (справа). 1: Индикатор мощности. 2: Выключатель питания. 3: Индикатор пульса. 4: Переключатель тестового режима.  5: Селектор напряжения. 6: Контроль ширины пульса. 7: Электрод (к). 8: Внешний триггер (TTL).  9: Электрод (-). (B) Изображение специально построенного электрода из трех зубцов (слева) и рекомендуемого метода удержания трех зубцового электрода во время IUE (справа). (C) Слева: Диаграмма, изображающая операцию IUE, выполненную на плотинах E16. Справа: репрезентативное 20X конфокального изображения IUE с GFP, нацеленное на L2/3 mPFC. звездочка желтого цвета: L2/3 нейроны GFP. Левая панель масштаба бар 250 мкм. Панель правой панели - 75 мкм. Цифры и данные, адаптированные из Comer et al., 20205. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Схема цепи пользовательского электропоратора. Диаграмма, изображающая изготовленную на заказ схему электропоратора, основанную на ранее описанныхпримерах 27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Ориентация на большие популяции L2/3 лобных нейронов коры с помощью IUE. (A)Общее количество клеток GFP у мышей-несовершеннолетних. N No 15 мышей. (B) Процент клеток GFP на область у взрослых контрольных мышей. N No 22 контрольных мышей. (C)Репрезентативные секции, показывающие ростро-каудальную степень трансфицированных клеток в лобной коре. Изображения на левых панелях являются увеличенными областями с правой панели (красный квадрат). Лобная связь коры: FrA. Дополнительная моторная кора: M2. Прелимбинальная кора: PL. Инфралимбинальная кора: IL. Передняя cingulate кора: ACC. Медиальная орбитофронтальная кора: MO. Вентальная орбитофронтальная кора: VO. Боковой орбитофронтальной коры: LO. Передняя островная кора: ИИ. Область лобной коры 3: Fr3.  Первичная моторная кора: M1.  Первичная соматосензорная кора: S1. Пириформная кора: Пир. Переднее обонятельное ядро: АО. Caudate-putamen: Cpu. Черные числа: Координаты Брегмы. Левая панель масштаба бар 0,5 мм. Панель правой панели - 1 мм. Средний ± SEM.(D)Данные, показывающие количество клеток, электропотеных в правом и левом полушарии в каждой мыши. Отображение неинтерпетлированных клеток от 14 взрослых мышей, пораженных плазмидой pCAG-GFP. Парный т-тест. р 0,4757.  Данные адаптированы из Comer et al., 20205. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка способностей сенсоримотора, исследовательского поведения и раннего социального взаимодействия у несовершеннолетних трансфицированных мышей. (A) Репрезентативный пример пути, проехавного (черный след) по щенку управления P18 в задаче MI1. Свежие уголки постельных принадлежностей (свежие 1 и 2, розовые) и уголок постельных принадлежностей гнезда (зеленый). (B)Контроль щенков провел больше времени, исследуя гнездо постельных принадлежностей, чем свежие постельные принадлежности в MI1 задачи. р-л; 0,001, рйт; 0,0001. Двухотверный пост-тест ANOVA и Sidak. (C)Репрезентативный пример пути, проехавного (черный след) по щенку управления P18 в задаче MI2.  Чашка плотины (плотина: синий), Пустая чашка (пустая чашка: желтый), гнездо угол постельных принадлежностей (гнездо: зеленый). (D) Контроль щенков провел больше времени, взаимодействуя с их плотины, чем с пустой чашки или гнезда постельных принадлежностей. Двухотверный пост-тест ANOVA и Sidak. p lt; 0.0001. N No 15 контрольных мышей. Цифры и данные, адаптированные из Comer et al., 20205. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Оценка социальных взаимодействий у взрослых трансфицированных мышей. (A)Представитель пример пути путешествовал (черный след) по P60 управления взрослой мыши в новой задаче взаимодействия объектов. розовый уголок - расположение нового объекта. (B) Контроль мышей провел около 35% времени, исследуя новый объект (5 мин общее время). Процентное время, проведенное в углу с новым объектом показано. (C)Репрезентативные примеры пути, по которому проходит (черный след) мышью-элементом управления P60 в задаче распознавания новых объектов. розовый угол: расположение нового объекта. зеленый угол: расположение знакомого объекта. (D)Контроль мышей провел больше времени, исследуя новый объект, чем знакомый объект. Индекс дискриминации (DI) показан; DI (время с новым объектом - время со знакомым объектом) / (время с новым объектом и время со знакомым объектом)). (E)Репрезентативные примеры пути, проехавного (черный след) по P60 управления взрослой мыши в задачи общительности. розовый угол: расположение новой мыши под чашкой проволоки сетки. зеленый угол: расположение пустой чашки проволоки сетки. (F) Контроль мышей провел в среднем равное время изучения пустой чашки и чашки, содержащей роман мыши. График показывает DI ((время с новой мышью - время с пустой чашкой) / (время с новой мышью и время с пустой чашкой)). Так как мыши не были социально изолированы до задачи, стремление взаимодействовать с новой мышью, возможно, было уменьшено. Тем не менее, было еще исследование романа мыши. N No 22 контрольных мышей. Цифры и данные, адаптированные из Comer et al., 20205. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Видео 1: Использование DeepLabCut для автоматического отслеживания положения животных в поведенческих задачах. Репрезентативное видео взрослой мыши в задаче социального взаимодействия, которое было помечено с помощью DeepLabCut. Различные части мыши могут быть помечены, такие как конечности и голова. Использование центроиды является целесообразным для отслеживания положения животного, но другие точки могут быть использованы для выявления более сложных поведения, таких как уход или воспитание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Справа нажмите, чтобы загрузить.)

Видео 2: Использование DeepLabCut для автоматического отслеживания воспитания в поведенческих задачах. Репрезентативное видео взрослой мыши в задаче социального взаимодействия, которое было помечено с помощью DeepLabCut. Красная стрелка показывает длину мыши со стрелкой, указывающей на голову мыши. Длина стрелки может быть использована для определения с помощью мыши поднимается, так как длина мыши, и стрелка, становится меньше, когда мышь задней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Справа нажмите, чтобы загрузить.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом случае описывается конвейер, сочетаемый в манипуляции новыми генами, представляющими интерес для больших популяций лобных корковых нейронов, с поведенческими анализами у мышей. Кроме того, этот трубопровод позволяет продольное исследование поведения у тех же мышей как во время раннего послеродового развития, так и во взрослом возрасте. Этот метод обходит необходимость полагаться на генетические модели животных, которые могут быть дорогостоящими с точки зрения времени и расходов. Сила этого протокола является то, что он может быть использован для изучения нейроразвития и нейропсихиатрических расстройств, для которых последние GWAS обнаружили новые генетическиеассоциации 28,29. Хотя этот метод обеспечивает клеточный тип конкретных трансфекции возбуждающей нейронов, одним из ограничений является то, что это менее возможно для целевой других типов клеток мозга, таких как интернейроны или глиальные клетки. Тем не менее, несколько исследований показывают, модифицированный подход к целевой других клеток мозгатипов 30,31. Кроме того, путем изменения положения электродов относительно головы эмбриона и изменения времени IUE, другие области мозга могут быть двусторонне трансфицированы в том числе гиппокампа, миндалины, мозжечка, и визуальные, соматосенсные и моторныекортики 24,32. Кроме того, различные корковые слои могут быть направлены на выполнение IUE на различных стадиях развития.

Хотя IUE может иметь высокий уровень успеха, есть критические шаги и устранение неполадок метода, который требуется время от времени. Необходимо, чтобы плазмиды тщательно проектированы и проверены в клеточных линиях. Как и все клонирования, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить надлежащее выражение гена, такие как подтверждение последовательности в кадре. Кроме того, следует подтвердить эффект манипуляции с генами (например, переэкспрессия или замалчивание), учитывая, что уровни экспрессии могут варьироваться в зависимости от времени развития мыши и даты развития IUE. Западная помарка и qPCR можно использовать для того чтобы обусловить размер генетического overexpression5. Рекомендуется совместно электропоратировать ген репортера, такой как GFP, в отдельной плазмиде, так как белки, помеченные GFP, могут быть неправильно сложены или теряют свою функцию. Кроме того, если репортер не используется экспериментатор может использовать на месте гибридизации, qPCR или западной пятно для определения уровней экспрессии гена интереса5.

Если плазмиды были проверены, но Нет животных, которые, как представляется, являются положительными для трансфекции, тщательно проверить все оборудование, особенно электропоратор, чтобы обеспечить надлежащую функцию. При доставке импульсов напряжения эмбрионам, рога матки должны быть хорошо увлажнены с разогретым солевым раствором и электроды должны производить пузырьки при генерации импульса напряжения. Если при доставке напряжения пузырьков нет, скорее всего, возникает проблема с электропоратором.  Кроме того, cDNA, возможно, не были введены должным образом в желудочек. Когда cDNA вводится правильно в боковой желудочек, быстрый зеленый краситель будет виден в форме полумесяца. Наконец, важно положение электродов. Если электроды расположены немного неправильно, клетки могут не быть трансфицированы в области интереса. Поэтому, проверяя на успешное трансфекцию, сохраните еще несколько хвостовых участков мозга, чтобы увидеть, если, возможно, неправильная область мозга была трансфицирована. После того, как этот метод практикуется, опытный хирург может рассчитывать на достижение успеха почти 90%. Этот протокол может быть изменен для целевых других областей мозга, представляющих интерес. Например, можно ориентироваться на большинство корковых регионов на двусторонней основе и даже на определенные подкортические области, включаягиппокамп 23. Также возможно дальнейшее сокращение расходов путем создания пользовательского электропоратора, который использовался в представленных здесьданных 5,27.

Будущие исследования могли бы использовать этот метод, чтобы понять роль недавно обнаруженных кандидатов гена в различных неврологических заболеваний. Представленный конвейер предлагает относительно быстрый анализ, чтобы проверить влияние конкретных генетических манипуляций на раннее послеродовое развитие и поведение во взрослую жизнь. Будущие усилия, использующие этот метод, имеют потенциал, чтобы обнаружить, какие гены играют причинно-следственную роль в некоторых расстройствах мозга, включая ССЗ и расстройство аутистического спектра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Лизу Креце за критически важную обратную связь и редактирование рукописи. Мы благодарим всех научных сотрудников в лаборатории Круз-Мартин, которые были бесценны в оказании помощи в перфузии и подсчета клеток мозга поведения. Мы благодарим Анджея Цветча за вклад в проектирование триполярного электрода, Тодда Блата и Ядро биологической визуализации Бостонского университета для использования конфокального микроскопа. Эта работа была поддержана NARSAD Молодой следователь Грант (AC-M, #27202), Брентон Р. Лутц премии (ALC), И. Олден Макки премии (ALC), NSF NRT UtB: Нейрофотоника Национальной исследовательской стипендии (ALC, #DGE1633516), и Бостонского университета undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Спонсоры не играли никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8, (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511, (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22, (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51, (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18, (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105, (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9, (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50, (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95, (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98, (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18, (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35, (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507, (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1, (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30, (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7, (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365, (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7, (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11, (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17, (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21, (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57, (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49, (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45, (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513, (1), 113-128 (2009).
Трубопровод с использованием двустороннего в утробе матери электропорации для допроса генетического влияния на поведение грызунов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter