Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores
Summary
El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.
Abstract
A medida que estudios de asociación en todo el genoma arrojan luz sobre los fundamentos genéticos heterogéneos de muchas enfermedades neurológicas, aumenta la necesidad de estudiar la contribución de genes específicos al desarrollo cerebral y la función. Confiar en modelos de ratón para estudiar el papel de manipulaciones genéticas específicas no siempre es factible, ya que las líneas transgénicas de ratón son bastante costosas y muchos genes nuevos asociados a enfermedades aún no tienen líneas genéticas disponibles comercialmente. Además, puede tomar años de desarrollo y validación para crear una línea de ratón. En la electroporación del útero ofrece un método relativamente rápido y fácil de manipular la expresión génica de una manera específica de tipo celular in vivo que sólo requiere desarrollar un plásmido de ADN para lograr una manipulación genética particular. La electroporación bilateral en el útero se puede utilizar para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas piramidales de corteza frontal. La combinación de este método de transferencia de genes con enfoques conductuales permite estudiar los efectos de las manipulaciones genéticas en función de las redes de corteza prefrontal y el comportamiento social de ratones juveniles y adultos.
Introduction
Los estudios de asociación en todo el genoma (GWAS) han impulsado el descubrimiento de nuevos genes candidatos que están asociados con patologías cerebrales1,2,3,4. Estos estudios han sido particularmente beneficiosos para entender trastornos neuropsiquiátricos devastadores como la esquizofrenia (SCZ), donde la investigación de genes novedosos ha servido como punto de partida para nuevas líneas de investigación e intervención terapéutica5,6. Los genes que albergan el riesgo de SCZ muestran expresión sesgada en la corteza prefrontal (PFC) durante el desarrollo prenatal y postnatal temprano, una región implicada en la patología de varios trastornos neuropsiquiátricos7. Además, los modelos de ratón de trastornos psiquiátricos presentan actividad anormal en las redes PFC6,8,9. Estos resultados sugieren que los genes asociados a SZC podrían desempeñar un papel en el cableado del desarrollo de esta región. Se requiere una investigación adicional utilizando modelos animales para entender la contribución de estos genes candidatos al establecimiento de conexiones en el PFC y para determinar si estos genes tienen un papel causal en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos. Las técnicas de manipulación genética en ratones que permiten el estudio de cambios de expresión génica en circuitos neuronales específicos durante el desarrollo prenatal y posnatal temprano son un método prometedor para entender los mecanismos moleculares que vinculan los cambios de expresión génica con la disfunción de la PFC.
Las líneas genéticas de ratón ofrecen un método para estudiar el impacto de genes particulares en el desarrollo y la función cerebral. Sin embargo, confiar en ratones transgénicos puede ser limitador ya que no siempre hay líneas disponibles comercialmente para examinar los efectos de genes específicos en el desarrollo de circuitos neuronales. Además, puede ser extremadamente costoso y lento desarrollar líneas de ratón personalizadas. El uso de estrategias de manipulación genética interseccional que combinan ratones transgénicos con enfoques virales ha revolucionado la comprensión del cerebro10,11,12. A pesar de muchos progresos, las estrategias virales vienen con ciertas limitaciones dependiendo del tipo de vector viral, incluyendo límites en la capacidad de envasado que pueden restringir la expresión viral13 y la toxicidad celular asociada con la expresión viral14. Además, en la mayoría de las condiciones experimentales, la expresión génica robusta utilizando el virus asociado a adeno (AAVs) requiere aproximadamente 2 a 4 semanas15,haciendo que las estrategias virales rutinarias sean inviables para manipular genes durante el desarrollo postnatal temprano.
En la electroporación del útero (IUE) es un enfoque alternativo que permite una transferencia de genes rápida y barata16,17 que, cuando se combina con etiquetado fluorescente y enfoques farmacogenéticos u optogenéticos, proporciona una potente plataforma para diseccionar la función de los circuitos neuronales. Además, con el desarrollo de genes de edición del genoma CRISPR-Cas9 se pueden sobreexprimir o alterar con precisión a través de derribo específico de tipo celular o eliminación de genes específicos o a través de la modulación de promotores18,19. Los enfoques de manipulación génica que utilizan IUE son especialmente ventajosos cuando el efecto de los genes en los circuitos neuronales debe probarse durante las estrechas ventanas de desarrollo20. IUE es una técnica versátil y la sobreexpresión se puede lograr fácilmente insertando un gen en un vector de expresión bajo un promotor específico. El control adicional de la expresión génica puede lograrse impulsando la expresión utilizando promotores de diferentes fortalezas o utilizando promotores inducibles capaces de controlar temporalmente la expresión génica21,22. Además, IUE permite la focalización de células dentro de capas corticales específicas, tipos de células y regiones cerebrales, que no siempre es factible utilizando otros enfoques5,17. Los recientes avances en la configuración de la IUE basados en el uso de tres electrodos, que genera una distribución de campo eléctrico más eficiente, han ampliado el repertorio funcional de este método y han permitido a los científicos dirigirse a nuevos tipos de células y aumentar la eficiencia, precisión y número de células que pueden ser dirigidasa 23,24. Esta técnica se utilizó recientemente para determinar el papel causal del componente complementario 4A (C4A), un gen vinculado a SCZ, en función PFC y cognición temprana5.
Aquí se presenta una canalización experimental que combina enfoques de transferencia de genes para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas excitatorias en la corteza frontal, incluyendo el PFC, con paradigmas conductuales que no sólo permite el estudio de los cambios celulares y a nivel de circuito, sino que también permite monitorear el comportamiento a lo largo del desarrollo posnatal temprano y la edad adulta. El primero descrito es un método para transfectar bilateralmente grandes poblaciones de neuronas piramidales de capa (L) 2/3 en regiones corticales frontales. A continuación, se describen las tareas para asescribir el comportamiento social en ratones juveniles y adultos. Los recuentos de celdas se pueden obtener al finalizar las tareas de comportamiento para cuantificar la extensión y la ubicación de la transfección celular. Además, el número de células transfectadas se puede correlacionar con datos de comportamiento para determinar si un mayor número de células transfectadas conduce a mayores perturbaciones en el comportamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, se describe un oleoducto que combina la manipulación de nuevos genes de interés en grandes poblaciones de neuronas corticales frontales con ensayos conductuales en ratones. Además, esta canalización permite el estudio longitudinal del comportamiento en los mismos ratones tanto durante el desarrollo postnatal temprano como en la edad adulta. Esta técnica evita la necesidad de confiar en modelos genéticos animales que pueden ser costosos en términos de tiempo y gastos. La fuerza de este protocolo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Lisa Kretsge por comentarios críticos y edición del manuscrito. Agradecemos a todos los asistentes de investigación en el laboratorio Cruz-Martín que fueron invaluables en ayudar con perfusiones y recuento celular de cerebros conductuales. Agradecemos a Andrzej Cwetsch por su contribución en el diseño del electrodo tripolar, y a Todd Blute y al Núcleo de Imágenes de Biología de la Universidad de Boston por el uso del microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Investigación Joven NARSAD (AC-M, #27202), el Premio Brenton R. Lutz (ALC), el Premio I. Alden Macchi (ALC), la NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) y el Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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