Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen
Summary
De rol van recent ontdekte ziekte-geassocieerde genen in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen blijft onduidelijk. Een gemodificeerde bilaterale in utero elektroporatie techniek maakt de genoverdracht in grote populaties neuronen en onderzoek van de veroorzakers van genexpressie veranderingen op sociaal gedrag mogelijk.
Abstract
Aangezien genoombrede associatiestudies licht werpen op de heterogene genetische onderbouwing van veel neurologische ziekten, neemt de noodzaak om de bijdrage van specifieke genen aan de ontwikkeling en functie van de hersenen te bestuderen toe. Vertrouwen op muismodellen om de rol van specifieke genetische manipulaties te bestuderen is niet altijd haalbaar, omdat transgene muislijnen vrij kostbaar zijn en veel nieuwe ziektegerelateerde genen nog geen commercieel beschikbare genetische lijnen hebben. Bovendien kan het jaren van ontwikkeling en validatie duren om een muislijn te maken. In utero biedt elektroporatie een relatief snelle en eenvoudige methode om genexpressie te manipuleren op een celspecifieke manier in vivo waarvoor alleen het ontwikkelen van een DNA-plasmide nodig is om een bepaalde genetische manipulatie te bereiken. Bilaterale in utero elektroporatie kan worden gebruikt om grote populaties van frontale cortex piramidale neuronen te targeten. Door deze genoverdrachtsmethode te combineren met gedragsbenaderingen, kan men de effecten van genetische manipulaties op de functie van prefrontale cortexnetwerken en het sociale gedrag van jonge en volwassen muizen bestuderen.
Introduction
Genoombrede associatiestudies (GWAS) hebben geleid tot de ontdekking van nieuwe kandidaatgenen die geassocieerd zijn met hersenpathologieën1,2,3,4. Deze studies zijn bijzonder nuttig geweest bij het begrijpen van verwoestende neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie (SCZ), waar het onderzoek naar nieuwe genen heeft gediend als startpunt voor nieuwe onderzoekslijnen en therapeutische interventie5,6. Genen met een risico op SCZ vertonen bevooroordeelde expressie in de prefrontale cortex (PFC) tijdens prenatale en vroege postnatale ontwikkeling, een regio die betrokken is bij de pathologie van verschillende neuropsychiatrische aandoeningen7. Bovendien vertonen muismodellen van psychiatrische stoornissen abnormale activiteit in PFC-netwerken6,8,9. Deze resultaten suggereren dat SZC-geassocieerde genen een rol kunnen spelen in de ontwikkelingsbedrading van deze regio. Verder onderzoek met behulp van diermodellen is nodig om de bijdrage van deze kandidaatgenen aan de vaststelling van verbindingen in de PFC te begrijpen en om te bepalen of deze genen een veroorzaker hebben in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen. Genetische manipulatietechnieken bij muizen die de studie van genexpressieveranderingen op specifieke neuronale circuits tijdens prenatale en vroege postnatale ontwikkeling mogelijk maken, zijn een veelbelovende methode om de moleculaire mechanismen te begrijpen die genexpressieveranderingen koppelen aan PFC-disfunctie.
Genetische muislijnen bieden een methode om de impact van bepaalde genen op de hersenontwikkeling en -functie te bestuderen. Het vertrouwen op transgene muizen kan echter beperkend zijn, omdat er niet altijd commercieel beschikbare lijnen zijn om de effecten van specifieke genen op de ontwikkeling van neurale circuits te onderzoeken. Bovendien kan het extreem duur en tijdrovend zijn om aangepaste muislijnen te ontwikkelen. Het gebruik van intersectionele genetische manipulatiestrategieën die transgene muizen combineren met virale benaderingen heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van de hersenen10,11,12. Ondanks veel vooruitgang hebben virale strategieën bepaalde beperkingen, afhankelijk van het virale vectortype, waaronder limieten in verpakkingscapaciteit die virale expressie13 en celtoxiciteit in verband met virale expressie14kunnen beperken. Bovendien vereist robuuste genexpressie met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV’s) in de meeste experimentele omstandigheden ongeveer 2 tot 4 weken15, waardoor routinematige virale strategieën onhaalbaar zijn om genen te manipuleren tijdens de vroege postnatale ontwikkeling.
In utero elektroporatie (IUE) is een alternatieve aanpak die een snelle en goedkope genoverdracht mogelijk maakt16,17 die, in combinatie met fluorescerende etikettering en farmacogenetische of optogenetische benaderingen, een krachtig platform biedt om de functie van neuronale circuits te ontleden. Bovendien kunnen met de ontwikkeling van CRISPR-Cas9 genoombewerkingsgenen worden overexpressie of precies worden gewijzigd door celspecifieke knock-down of knock-out van specifieke genen of door de modulatie van promotors18,19. Genmanipulatiebenaderingen met behulp van IUE zijn vooral voordelig wanneer het effect van genen op neuronale circuits moet worden getest tijdens smalle ontwikkelingsvensters20. IUE is een veelzijdige techniek en overexpressie kan gemakkelijk worden bereikt door een gen in een expressievector onder een specifieke promotor in te voegen. Extra controle van genexpressie kan worden bereikt door expressie te stimuleren met behulp van promotors van verschillende sterktes of met behulp van induceerbare promotors die in staat zijn om de genexpressie tijdelijk te regelen21,22. Bovendien maakt IUE het mogelijk om cellen te targeten binnen specifieke corticale lagen, celtypen en hersengebieden, wat niet altijd haalbaar is met behulp van andere benaderingen5,17. Recente vooruitgang in de IUE-configuratie op basis van het gebruik van drie elektroden, die een efficiëntere verdeling van het elektrische veld genereert, heeft het functionele repertoire van deze methode uitgebreid en wetenschappers in staat gesteld zich te richten op nieuwe celtypen en de efficiëntie, nauwkeurigheid en het aantal cellen te verhogen dat kan worden gericht23,24. Deze techniek werd onlangs gebruikt om de veroorzaker van complementcomponent 4A (C4A), een gen gekoppeld aan SCZ , in PFC-functie en vroege cognitie5te bepalen .
Hier gepresenteerd is een experimentele pijplijn die genoverdrachtsbenaderingen combineert om grote populaties van excitatory neuronen in de frontale cortex, waaronder de PFC, te targeten met gedragsparadigma’s die niet alleen de studie van veranderingen op cel- en circuitniveau mogelijk maken, maar ook mogelijk maken om gedrag te volgen tijdens de vroege postnatale ontwikkeling en volwassenheid. De eerste beschreven methode is een methode om bilaterale transfectie van grote populaties van laag (L) 2/3 piramidale neuronen in frontale corticale regio’s. Vervolgens worden taken beschreven om sociaal gedrag bij juveniele en volwassen muizen te testen. Celtellingen kunnen worden verkregen na voltooiing van gedragstaken om de omvang en locatie van celtransfectie te kwantificeren. Bovendien kan het aantal getransfecteerde cellen worden gecorreleerd met gedragsgegevens om te bepalen of een groter aantal getransfecteerde cellen leidt tot grotere verstoringen in gedrag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wordt een pijplijn beschreven die de manipulatie van nieuwe genen van belang in grote populaties frontale corticale neuronen combineert met gedragstests bij muizen. Bovendien maakt deze pijpleiding de longitudinale studie van gedrag bij dezelfde muizen mogelijk, zowel tijdens de vroege postnatale ontwikkeling als op volwassen leeftijd. Deze techniek omzeilt de noodzaak om te vertrouwen op genetische diermodellen die duur kunnen zijn in termen van tijd en kosten. De kracht van dit protocol is dat het kan worden geb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Lisa Kretsge voor kritische feedback en bewerking van het manuscript. We danken alle onderzoeksassistenten in het Cruz-Martín lab die van onschatbare waarde waren bij het helpen met perfusies en het tellen van gedraghersenen. We danken Andrzej Cwetsch voor de input over het ontwerp van de tripolar elektrode, en Todd Blute en de Boston University Biology Imaging Core voor het gebruik van de confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door een NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), de Brenton R. Lutz Award (ALC), de I. Alden Macchi Award (ALC), de NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) en het Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). De financiers hadden geen rol bij studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om het manuscript te publiceren of voor te bereiden.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
References
- Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144 (2018).
- Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
- Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).
- Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).
- Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18 (1), 3000604 (2020).
- Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).
- Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9 (1), 74 (2019).
- Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).
- Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).
- DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).
- Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).
- Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365 (6448), 48-53 (2019).
- Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7 (2), 32446 (2012).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
- Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).
- Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).
- Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).
