Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs
Summary
Le rôle des gènes récemment découverts associés à la maladie dans la pathogénie des désordres neuropsychiatriques demeure obscur. Une technique bilatérale modifiée d’électroporation in utero permet le transfert de gènes dans de grandes populations de neurones et l’examen des effets causatifs des changements d’expression génétique sur le comportement social.
Abstract
Alors que les études d’association à l’échelle du génome mettent en lumière les fondements génétiques hétérogènes de nombreuses maladies neurologiques, la nécessité d’étudier la contribution de gènes spécifiques au développement et à la fonction du cerveau augmente. S’appuyer sur des modèles muraux pour étudier le rôle de manipulations génétiques spécifiques n’est pas toujours faisable puisque les lignées de souris transgéniques sont assez coûteuses et que de nombreux nouveaux gènes associés à la maladie n’ont pas encore de lignées génétiques disponibles dans le commerce. En outre, il peut prendre des années de développement et de validation pour créer une ligne de souris. L’électroporation in utero offre une méthode relativement rapide et facile pour manipuler l’expression des gènes d’une manière spécifique de type cellulaire in vivo qui nécessite seulement le développement d’un plasmide d’ADN pour réaliser une manipulation génétique particulière. L’électroporation in utero bilatérale peut être utilisée pour cibler de grandes populations de neurones pyramidaux du cortex frontal. La combinaison de cette méthode de transfert de gènes avec des approches comportementales permet d’étudier les effets des manipulations génétiques sur la fonction des réseaux préfrontaux du cortex et le comportement social des souris juvéniles et adultes.
Introduction
Les études d’association à l’échelle du génome (GWAS) ont conduit à la découverte de nouveaux gènes candidats associés aux pathologies cérébrales1,2,3,4. Ces études ont été particulièrement bénéfiques pour comprendre les troubles neuropsychiatriques dévastateurs tels que la schizophrénie (SCZ), où l’étude de nouveaux gènes a servi de point de lancement pour de nouvelles lignes de recherche et d’interventionthérapeutique 5,6. Les gènes hébergeant le risque pour SCZ montrent l’expression biaisée dans le cortex préfrontal (PFC) pendant le développement prénatal et postnatal tôt, une région impliquée dans la pathologie de plusieurs désordres neuropsychiatriques7. En outre, les modèles de souris des désordres psychiatriques montrent l’activité anormale dans les réseauxde PFC 6,8,9. Ces résultats suggèrent que les gènes associés au SZC pourraient jouer un rôle dans le câblage développemental de cette région. Une étude plus approfondie utilisant des modèles animaux est nécessaire pour comprendre la contribution de ces gènes candidats à l’établissement de connexions dans le PFC et pour déterminer si ces gènes ont un rôle causal dans la pathogénie des troubles neuropsychiatriques. Les techniques de manipulation génétique chez la souris qui permettent l’étude des changements d’expression génétique sur des circuits neuronaux spécifiques pendant le développement prénatal et postnatal précoce sont une méthode prometteuse pour comprendre les mécanismes moléculaires qui relient les changements d’expression génétique au dysfonctionnement du PFC.
Les lignées génétiques de souris offrent une méthode pour étudier l’impact de gènes particuliers sur le développement et la fonction du cerveau. Cependant, s’appuyer sur des souris transgéniques peut être limitatif car il n’y a pas toujours de lignes disponibles dans le commerce pour examiner les effets de gènes spécifiques sur le développement de circuits neuronaux. En outre, il peut être extrêmement coûteux et long de développer des lignes de souris personnalisées. L’utilisation de stratégies intersectionnelles de manipulation génétique qui combinent des souris transgéniques avec des approches virales a révolutionnéla compréhension du cerveau 10,11,12. Malgré de nombreux progrès, les stratégies virales sont associées à certaines limitations selon le type de vecteur viral, y compris les limites de la capacité d’emballage qui peuvent restreindre l’expression virale13 et la toxicité cellulaire associée à l’expression virale14. En outre, dans la plupart des conditions expérimentales, l’expression génétique robuste utilisant le virus adéno-associé (AAV) exige approximativement 2 à 4 semaines15,rendant les stratégies virales courantes impossibles à manipuler des gènes pendant le développement postnatal tôt.
L’électroporation in utero (IUE) est une approche alternative qui permet un transfert de gènes rapide et peu coûteux16,17 qui, lorsqu’il est couplé avec l’étiquetage fluorescent et des approches pharmacogénétiques ou optogénétiques, fournit une plate-forme puissante pour disséquer la fonction des circuits neuronaux. En outre, avec le développement de CRISPR-Cas9 gènes d’édition du génome peuvent être surexprimés ou précisément modifiés par type de cellule spécifique knock-down ou knock-out de gènes spécifiques ou par la modulation des promoteurs18,19. Les approches de manipulation génétique utilisant l’IUE sont particulièrement avantageuses lorsque l’effet des gènes sur les circuits neuronaux doit être testé lors de fenêtres de développementétroites 20. L’IUE est une technique polyvalente et la surexpression peut être facilement accomplie en insérant un gène dans un vecteur d’expression sous un promoteur spécifique. Un contrôle supplémentaire de l’expression des gènes peut être réalisé en conduisant l’expression en utilisant des promoteurs de différentes forces ou en utilisant des promoteurs inductibles capables de contrôler temporellement l’expressiondes gènes 21,22. En outre, l’IUE permet le ciblage des cellules dans des couches corticales spécifiques, des types de cellules et des régions du cerveau, ce qui n’est pas toujours faisable enutilisant d’autres approches 5,17. Les progrès récents de la configuration IUE basés sur l’utilisation de trois électrodes, qui génère une distribution plus efficace des champs électriques, ont élargi le répertoire fonctionnel de cette méthode et permis aux scientifiques de cibler de nouveaux types de cellules et d’augmenter l’efficacité, la précision et le nombre de cellules qui peuvent êtreciblées 23,24. Cette technique a été récemment utilisée pour déterminer le rôle causal du composant de complément 4A (C4A), un gène lié à SCZ, dans la fonction PFC et la cognition précoce5.
Présenté ici est un pipeline expérimental qui combine des approches de transfert de gènes pour cibler de grandes populations de neurones excitatoires dans le cortex frontal, y compris le PFC, avec des paradigmes comportementaux qui permet non seulement l’étude des changements cellulaires et de niveau de circuit, mais permet également de surveiller le comportement tout au long du développement postnatal précoce et l’âge adulte. D’abord décrit est une méthode pour transfecter bilatéralement de grandes populations de couches (L) 2/3 neurones pyramidaux dans les régions corticales frontales. Ensuite, les tâches d’analyse du comportement social chez les souris juvéniles et adultes sont décrites. Le nombre de cellules peut être obtenu à la fin des tâches comportementales pour quantifier l’étendue et l’emplacement de la transfection cellulaire. En outre, le nombre de cellules transfectées peut être corrélé avec des données comportementales pour déterminer si un plus grand nombre de cellules transfectées conduit à de plus grandes perturbations du comportement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce cas, un pipeline est décrit qui combine la manipulation de nouveaux gènes d’intérêt dans de grandes populations de neurones corticals frontaux avec des analyses comportementales chez la souris. En outre, ce pipeline permet l’étude longitudinale du comportement chez les mêmes souris à la fois au cours du développement postnatal précoce et à l’âge adulte. Cette technique contourne la nécessité de s’appuyer sur des modèles animaux génétiques qui peuvent être coûteux en termes de temps et de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Lisa Kretsge pour les commentaires critiques et l’édition du manuscrit. Nous remercions tous les assistants de recherche du laboratoire Cruz-Martín qui ont été précieux pour aider aux perfusions et au comptage cellulaire des cerveaux comportementaux. Nous remercions Andrzej Cwetsch pour son apport sur la conception de l’électrode tripolar, et Todd Blute et le centre d’imagerie en biologie de l’Université de Boston pour l’utilisation du microscope confocal. Ces travaux ont été appuyés par une subvention pour les jeunes chercheurs de la NARSAD (AC-M, #27202), le Prix Brenton R. Lutz (ALC), le Prix I. Alden Macchi (ALC), le NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) et le Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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