Summary

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

Published: May 21, 2020
doi:

Summary

Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l’esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.

Abstract

Poiché gli studi di associazione a livello genomico fanno luce sulle basi genetiche eterogenee di molte malattie neurologiche, aumenta la necessità di studiare il contributo di specifici geni allo sviluppo cerebrale e alla funzione. Affidarsi a modelli di topi per studiare il ruolo di manipolazioni genetiche specifiche non è sempre fattibile poiché le linee transgeniche del topo sono piuttosto costose e molti nuovi geni associati alle malattie non hanno ancora linee genetiche disponibili in commercio. Inoltre, possono essere necessario anni di sviluppo e convalida per creare una linea del mouse. In utero l’elettroporazione offre un metodo relativamente semplice e veloce per manipolare l’espressione genica in un modo specifico di tipo cellulare in vivo che richiede solo lo sviluppo di un plasmide di DNA per ottenere una particolare manipolazione genetica. L’elettroporazione bilaterale in utero può essere utilizzata per colpire grandi popolazioni di neuroni piramidali della corteccia frontale. La combinazione di questo metodo di trasferimento genico con approcci comportamentali consente di studiare gli effetti delle manipolazioni genetiche sulla funzione delle reti di corteccia prefrontale e il comportamento sociale dei topi giovani e adulti.

Introduction

Studi di associazione a livello genomico (GWAS) hanno guidato la scoperta di nuovi geni candidati associati a patologiecerebrali 1,2,3,4. Questi studi sono stati particolarmente utili nella comprensione di devastanti disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia (SCZ), dove l’indagine di nuovi geni è servita come punto di partenza per nuove linee di ricerca e intervento terapeutico5,6. I geni che ospitano il rischio per la SCZ mostrano un’espressione distorta nella corteccia prefrontale (PFC) durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce, una regione implicata nella patologia di diversi disturbi neuropsichiatrici7. Inoltre, i modelli di topo dei disturbi psichiatrici mostrano attività anomala nellereti PFC 6,8,9. Questi risultati suggeriscono che i geni associati alla SZC potrebbero svolgere un ruolo nel cablaggio dello sviluppo di questa regione. Ulteriori indagini utilizzando modelli animali sono necessarie per comprendere il contributo di questi geni candidati alla creazione di connessioni nel PFC e per determinare se questi geni hanno un ruolo causale nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici. Le tecniche di manipolazione genetica nei topi che consentono lo studio dei cambiamenti di espressione genica su specifici circuiti neuronali durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce sono un metodo promettente per comprendere i meccanismi molecolari che collegano i cambiamenti di espressione genica alla disfunzione PFC.

Le linee genetiche del topo offrono un metodo per studiare l’impatto di particolari geni sullo sviluppo e sulla funzione cerebrale. Tuttavia, affidarsi a topi transgenici può essere limitante poiché non ci sono sempre linee disponibili in commercio per esaminare gli effetti di specifici geni sullo sviluppo di circuiti neurali. Inoltre, può essere estremamente costoso e dispendioso in termini di tempo sviluppare linee di mouse personalizzate. L’uso di strategie di manipolazione genetica intersezionale che combinano topi transgenici con approcci virali harivoluzionato la comprensione del cervello 10,11,12. Nonostante molti progressi, le strategie virali hanno alcune limitazioni a seconda del tipo di vettore virale, inclusi limiti nella capacità di confezionamento che possono limitarel’espressione virale 13 e la tossicità cellulare associata all’espressionevirale 14. Inoltre, nella maggior parte delle condizioni sperimentali, l’espressione genica robusta che utilizza virus adeno-associato (AAV) richiede circa 2-4 settimane15, rendendo le strategie virali di routine irrealizzabili per manipolare i geni durante lo sviluppo postnatale precoce.

In utero l’elettroporazione (IUE) è un approccio alternativo che consente un rapido ed economico trasferimento genico16,17 che, se abbinato all’etichettatura fluorescente e agli approcci farmacogenetici o optogenetici, fornisce una potente piattaforma per sezionare la funzione dei circuiti neuronali. Inoltre, con lo sviluppo di geni di editing del genoma CRISPR-Cas9 possono essere sovraespressi o alterati con precisione attraverso il knock-down specifico di tipo cellulare o il knock-out di geni specifici o attraverso lamodulazione dei promotori 18,19. Gli approcci di manipolazione genica che utilizzano iUE sono particolarmente vantaggiosi quando l’effetto dei geni sui circuiti neuronali deve essere testato durante le strette finestre disviluppo 20. IUE è una tecnica versatile e l’iperespressione può essere facilmente realizzata inserendo un gene in un vettore di espressione sotto uno specifico promotore. Un ulteriore controllo dell’espressione genica può essere ottenuto guidando l’espressione utilizzando promotori di diversi punti di forza o utilizzando promotori inducibili in grado di controllare temporaneamentel’espressione genica 21,22. Inoltre, IUE consente il targeting di cellule all’interno di specifici strati corticali, tipi di cellule e regioni cerebrali, il che non è sempre fattibileutilizzando altri approcci 5,17. Recenti progressi nella configurazione IUE basati sull’uso di tre elettrodi, che generano una distribuzione del campo elettrico più efficiente, hanno ampliato il repertorio funzionale di questo metodo e permesso agli scienziati di indirizzare nuovi tipi di cellule e aumentare l’efficienza, la precisione e il numero di cellule che possono essere prese dimira 23,24. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per determinare il ruolo causale della componente complementare 4A (C4A), un gene legato alla SCZ, nella funzione PFC e nella cognizioneprecoce 5.

Qui è presentata una pipeline sperimentale che combina approcci di trasferimento genico per colpire grandi popolazioni di neuroni eccitatori nella corteccia frontale, incluso il PFC, con paradigmi comportamentali che non solo consentono lo studio dei cambiamenti cellulari e a livello di circuito, ma consentono anche di monitorare il comportamento durante lo sviluppo postnatale precoce e l’età adulta. Il primo descritto è un metodo per trasfetto bilateralmente grandi popolazioni di neuroni piramidali di livello (L) 2/3 nelle regioni corticali frontali. Successivamente, vengono delineati i compiti per saggiare il comportamento sociale nei topi giovani e adulti. Il conteggio delle cellule può essere ottenuto al completamento delle attività comportamentali per quantificare l’estensione e la posizione della trasfezione cellulare. Inoltre, il numero di cellule trasfette può essere correlato con i dati comportamentali per determinare se un maggior numero di cellule trasfette porta a maggiori perturbazioni nel comportamento.

Protocol

Tutti i protocolli sperimentali sono stati condotti secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca sugli animali e sono stati approvati dal Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Preparazione della soluzione di DNA Acquista un plasmide commerciale o un subclone un gene di interesse nel plasmide con il promotore desiderato. Qui è stato utilizzato un plasmide contenente EGFP sotto il promotore CAG (pCAG-EGFP).NOTA: …

Representative Results

Sviluppo e implementazione di successo di un elettroporatore su misura e di tre elettrodi a prong.Per le IUE, è stato costruito un elettroporatore su misura economico basato su un progetto27 descritto in precedenza (Figura 1A e Figura 2). Un elettrodo a tre punte èstato realizzato 23,24 utilizzando pini di plastica con 2 elettrodi negativi attaccati alle pun…

Discussion

Qui viene descritta una pipeline che combina la manipolazione di nuovi geni di interesse in grandi popolazioni di neuroni corticali frontali con saggi comportamentali nei topi. Inoltre, questa pipeline consente lo studio longitudinale del comportamento negli stessi topi sia durante lo sviluppo postnatale precoce che in età adulta. Questa tecnica ignora la necessità di fare affidamento su modelli genetici di animali che possono essere costosi in termini di tempo e spese. Il punto di forza di questo protocollo è che pu?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Lisa Kretsge per il feedback critico e la modifica del manoscritto. Ringraziamo tutti gli assistenti di ricerca del laboratorio Cruz-Martín che sono stati preziosi nell’aiutare con le perfusioni e il conteggio cellulare dei cervelli comportamentali. Ringraziamo Andrzej Cwetsch per l’input nella progettazione dell’elettrodo tripolare, e Todd Blute e il Boston University Biology Imaging Core per l’uso del microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da un NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), dal Brenton R. Lutz Award (ALC), dall’I. Alden Macchi Award (ALC), dal NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) e dal Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.

Materials

13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor – 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

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Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

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