Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı
Summary
Nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde yakın zamanda keşfedilen hastalıkla ilişkili genlerin rolü belirsizliğini korumaktadır. Modifiye edilmiş bir in utero elektroporasyon tekniği, büyük nöron popülasyonlarında gen transferine ve gen ekspresyon değişikliklerinin sosyal davranış üzerindeki nedensel etkilerinin incelenmesine izin verir.
Abstract
Genom çapındaki ilişki çalışmaları birçok nörolojik hastalığın heterojen genetik temellerine ışık tuttukça, spesifik genlerin beyin gelişimine ve işlevine katkısını inceleme ihtiyacı artmaktadır. Belirli genetik manipülasyonların rolünü incelemek için fare modellerine güvenmek her zaman mümkün değildir, çünkü transgenik fare çizgileri oldukça maliyetlidir ve birçok yeni hastalıkla ilişkili gen henüz ticari olarak mevcut genetik çizgilere sahip değildir. Ayrıca, bir fare satırı oluşturmak için geliştirme ve doğrulama yıllar alabilir. Rahim elektroporasyonunda, gen ekspresyonunu hücre tipi spesifik bir şekilde manipüle etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yöntem sunar in vivo, sadece belirli bir genetik manipülasyonu elde etmek için bir DNA plazmidi geliştirmeyi gerektirir. Utero elektroporasyonda bilateral, frontal korteks piramidal nöronların büyük popülasyonlarını hedeflemek için kullanılabilir. Bu gen transfer yöntemini davranışsal yaklaşımlarla birleştirmek, genetik manipülasyonların prefrontal korteks ağlarının işlevi üzerindeki etkilerini ve genç ve yetişkin farelerin sosyal davranışlarını incelemenizi sağlar.
Introduction
Genom çapındaki ilişki çalışmaları (GWAS), beyin patolojileri 1 ,2,3,4ile ilişkili yeni aday genlerin keşfini yönlendirmektedir. Bu çalışmalar, yeni genlerin araştırılmasının yeni araştırma ve terapötik müdahale hatları için bir fırlatma noktası olarak hizmet ettiği şizofreni (SCZ) gibi yıkıcı nöropsikiyatrik bozuklukları anlamada özellikle yararlı olmuştur5,6. SCZ için risk barındıran genler, doğum öncesi ve erken postnatal gelişim sırasında prefrontal kortekste (PFC) önyargılı ifade gösterir, çeşitli nöropsikiyatrik bozuklukların patolojisine karışan bir bölge7. Ek olarak, psikiyatrik bozuklukların fare modelleri PFC ağlarında anormal aktivite sergiler6,8,9. Bu sonuçlar, SZC ile ilişkili genlerin bu bölgenin gelişimsel kablolarında rol oynayabileceğini göstermektedir. Bu aday genlerin PFC’de bağlantıların kurulmasına katkısını anlamak ve bu genlerin nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde nedensel bir rolü olup olmadığını belirlemek için hayvan modelleri kullanılarak daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Farelerde, doğum öncesi ve erken postnatal gelişim sırasında belirli nöronal devrelerdeki gen ekspresyon değişikliklerinin incelenmesine izin veren genetik manipülasyon teknikleri, gen ekspresyon değişikliklerini PFC disfonksiyonu ile ilişkilendiren moleküler mekanizmaları anlamak için umut verici bir yöntemdir.
Genetik fare çizgileri, belirli genlerin beyin gelişimi ve işlevi üzerindeki etkisini incelemek için bir yöntem sunar. Bununla birlikte, transgenik farelere güvenmek sınırlayıcı olabilir, çünkü belirli genlerin sinir devreleri geliştirme üzerindeki etkilerini incelemek için her zaman ticari olarak kullanılabilir çizgiler yoktur. Ayrıca, özel fare çizgileri geliştirmek son derece maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Transgenik fareleri viral yaklaşımlarla birleştiren kesişimsel genetik manipülasyon stratejilerinin kullanılması, beynin anlaşılmasında devrim yaptı10,11,12. Çok ilerlemeye rağmen, viral stratejiler viral vektör tipine bağlı olarak, viral ifade13’ü ve viral ifade ile ilişkili hücre toksisitesini kısıtlayabilecek ambalaj kapasitesi sınırları da dahil olmak üzere belirli sınırlamalarla birlikte gelir14. Ayrıca, çoğu deneysel durumda, adeno ilişkili virüs (AAVs) kullanarak sağlam gen ekspresyonu yaklaşık 2 ila 4 haftagerektirir 15, erken doğum sonrası gelişim sırasında genleri manipüle etmek için rutin viral stratejileri imkansız hale getirir.
Rahim elektroporasyonunda (UUİ), floresan etiketleme ve farmakogenetik veya optogenetik yaklaşımlarla birleştiğinde nöronal devrelerin işlevini parçalamak için güçlü bir platform sağlayan hızlı ve ucuz bir gen transferi sağlayan alternatif bir yaklaşımdır16,17. Ek olarak, CRISPR-Cas9 genom düzenleme genlerinin geliştirilmesiyle, hücre tipi spesifik devirme veya belirli genlerin nakavt edilmesi veya uyarıcıların modülasyonu yoluyla aşırı ifade edilebilir veya tam olarak değiştirilebilir18,19. İEÜ’leri kullanan gen manipülasyon yaklaşımları özellikle genlerin nöronal devreler üzerindeki etkisinin dar gelişimsel pencereler sırasında test edilmesi gerektiğinde avantajlıdır20. IUE çok yönlü bir tekniktir ve aşırı ifade, belirli bir promotör altında bir ifade vektörüne bir gen eklenerek kolayca gerçekleştirilebilir. Gen ekspresyonunun ek kontrolü, farklı güçlerdeki promotörler kullanılarak veya gen ekspresyonunun zamansal olarak kontrol edilebilen indüklenebilir promotörleri kullanarak ifadeyi yönlendirerek elde edilebilir21,22. Ayrıca, İEÜ, belirli kortikal katmanlar, hücre tipleri ve beyin bölgelerindeki hücrelerin hedeflanmasına izin verir, bu da diğer yaklaşımlar5,17kullanılarak her zaman mümkün değildir. Daha verimli bir elektrik alanı dağılımı oluşturan üç elektrot kullanımına dayanan UUİ yapılandırmasındaki son gelişmeler, bu yöntemin işlevsel repertuarını genişletti ve bilim adamlarının yeni hücre türlerini hedeflemelerine ve hedeflenebilecek hücre verimliliğini, doğruluğunu ve sayısını artırmalarına izin verdi23,24. Bu teknik son zamanlarda PFC fonksiyonunda ve erken biliş5’teSCZ’ye bağlı bir gen olan kompleman bileşeni 4A’nın (C4A)nedensel rolünü belirlemek için kullanılmıştır.
Burada sunulan, PFC de dahil olmak üzere frontal korteksteki büyük uyarıcı nöron popülasyonlarını hedeflemek için gen transferi yaklaşımlarını, sadece hücre ve devre düzeyindeki değişikliklerin incelenmesini sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda davranışın erken doğum sonrası gelişim ve yetişkinlik boyunca izlenmesini sağlayan davranış paradigmalarıyla birleştiren deneysel bir boru hattıdır. İlk olarak, frontal kortikal bölgelerdeki büyük tabaka (L) 2/3 piramidal nöron popülasyonlarını iki taraflı olarak transfect etmek için bir yöntemdir. Daha sonra, genç ve yetişkin farelerde sosyal davranışları test etme görevleri özetlenmiştir. Hücre transfeksiyonunun kapsamını ve yerini ölçmek için davranışsal görevlerin tamamlanmasıyla hücre sayıları elde edilebilir. Ayrıca, transfected hücre sayısı, daha fazla sayıda transfected hücrenin davranışta daha fazla pertürbasyona yol açıp yol açtığını belirlemek için davranışsal verilerle ilişkilendirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, frontal kortikal nöronların büyük popülasyonlarında ilgi çekici yeni genlerin manipülasyonu ile farelerdeki davranışsal tahlilleri birleştiren bir boru hattı açıklanmaktadır. Ayrıca, bu boru hattı hem erken doğum sonrası gelişim sırasında hem de yetişkinlikte aynı farelerdeki davranışların uzunlamasına incelenmesine izin verir. Bu teknik, zaman ve masraflar açısından maliyetli olabilecek genetik hayvan modellerine güvenme ihtiyacını atlar. Bu protokolün gücü, son GWAS’ın yeni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lisa Kretsge’ye eleştirel geri bildirim ve makaleyi düzenlediği için teşekkür ederiz. Cruz-Martín laboratuvarındaki tüm araştırma asistanlarına teşekkür ederiz. Tripolar elektrodun tasarımına giriş için Andrzej Cwetsch’e ve konfokal mikroskobun kullanımı için Todd Blute ve Boston Üniversitesi Biyoloji Görüntüleme Çekirdeği’ne teşekkür ederiz. Bu çalışma bir NARSAD Genç Araştırmacı Hibesi (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Ödülü (ALC), I. Alden Macchi Ödülü (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics Ulusal Araştırma Bursu (ALC, #DGE1633516) ve Boston Üniversitesi Lisans Araştırma Fırsatları Programı (WWY) tarafından desteklendi. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
References
- Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144 (2018).
- Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
- Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).
- Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).
- Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18 (1), 3000604 (2020).
- Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).
- Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9 (1), 74 (2019).
- Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).
- Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).
- DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).
- Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).
- Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365 (6448), 48-53 (2019).
- Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7 (2), 32446 (2012).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
- Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).
- Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).
- Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).
