Summary
CRISPR-Cas9基因组编辑系统是一个易于使用的基因组编辑器，已用于模型和非模型物种。在这里，我们提出了这个系统的蛋白质为基础的版本，用于将一个过早停止的科顿引入非模型丝质的共生真菌的交配基因。
Abstract
CRISPR-Cas9基因组编辑系统是一种分子工具，可用于将精确的变化引入模型和非模型物种的基因组中。该技术可用于各种基因组编辑方法，从基因敲除和敲击到更具体的变化，如在目标位置引入一些核苷酸。基因组编辑可用于多种应用，包括基因的部分功能表征、转基因生物的产生和诊断工具的开发。与之前获得的基因编辑策略相比，CRISPR-Cas9系统已被证明是易于建立的新物种，并拥有高效率和特异性。其主要原因是，编辑工具使用RNA分子来瞄准感兴趣的基因或序列，使目标分子设计简单明了，因为可以利用标准碱基配对规则。与其他基因组编辑系统类似，基于CRISPR-Cas9的方法还需要高效和有效的转化方案，以及获得高质量的序列数据来设计靶向RNA和DNA分子。自2013年推出该系统以来，它已被用于基因工程的各种模型物种，包括糖精，阿拉比多普斯塔利亚，果蝇黑色素和穆斯库鲁斯。随后，研究非模型物种的研究人员利用了该系统，并利用于研究涉及真菌二次代谢、线虫生长和植物抗病等不同过程的基因。下文详述的这个协议描述了CRISPR-Cas9基因组编辑协议的使用，用于截断参与亨泰拉·阿曼尼西斯性周期的基因，一种属于Ceratocysidaceae家族的丝质异体真菌。
Introduction
高质量、完全组装的基因组和转录组不断增加，这大大提高了研究一系列生物体1中各种生物过程的能力。模型物种和非模型物种都是如此，其中许多物种可能提供对生物过程的更多样化的理解。这些类型的数据可用于基因发现、转录网络的识别以及全基因组和转录组的比较，每种数据都具有各自的应用集。然而，当基因被预测、注释和以前所未见的速度与不同的功能通路相连时，这些基因的功能特征仍然落后，受到许多物种可用的分子工具包的有限限制。对于非模型物种来说尤其如此，基因组数据相对容易生成，但进一步的分子特征几乎不可能为,1，2。
对真菌物种生物学重要的特定基因的功能的部分表征可以通过敲除或敲击实验，然后对突变菌株进行表型分析。这两个系统完全依赖于基因工程协议的可用性，包括至少包括一个转换系统和一个基因编辑系统。有许多不同的转换系统已经开发在各种丝真菌4。像那些依赖生物和电穿孔的物理系统已经分别在特里乔德马哈齐亚努姆5和阿斯佩吉卢斯尼日尔6开发。利用氯化钙或醋酸锂等化学物质的系统在神经孢子7中已经开发。最后，依靠农业细菌图梅法辛进行转化的生物系统已经成功地在Ceratocystis albifundus8中使用过。
与不同转化协议的可用性相比，基因组编辑系统不太丰富。在丝形真菌中进行的许多传统功能表征实验都利用了分裂标记敲击结构，其形式为可选择的标记，由同源区域与基因组3中的目标区域或基因相对。该方法依赖于同源定向（HR）DNA修复，从而将敲除构造与感兴趣区域之间的同源重组进行。此重组事件导致将感兴趣的基因与可选标记序列替换。不幸的是，虽然这在许多物种是成功的，包括Cercospora尼科蒂亚纳10，阿斯佩吉卢斯富米加图斯11和格罗斯曼尼亚克拉维格拉12，同源重组率是高度可变的不同真菌物种，使这是一个低效的，有时无法使用的协议，在某些物种3。
其他基因组编辑系统，包括那些使用锌指核酶（ZFNs）和转录活化剂样效应剂核酸酶（TALENs）的系统代表了对旧系统有很大的改进，特别是考虑到它们能够做出特定和有针对性的改变13。ZFN和塔伦由核酸酶蛋白和能够识别特定核苷酸序列13的蛋白质组成。识别后，核酸酶诱导双链DNA断裂，可促进特定突变的引入。为了实现基因组变化，需要针对每个实验专门设计识别核苷酸序列的蛋白质区域。由于这种依赖蛋白质-核酸相互作用来指导编辑、设计和生产每个敲除或敲击实验的目标分子是困难的，劳动密集型14，15。,15这些挑战的例证是，很少丝真菌被使用这些系统进行基因组编辑。一个例子是基于塔伦的系统，是在水稻爆炸真菌，麦格纳波特奥里扎16开发。
可以说，基因组编辑领域最大的革命是CRISPR-Cas9系统的发现和随后的开发，该系统是一个基因组编辑器，它允许由RNA分子引导的内核糖酶对感兴趣的序列进行靶向裂解。这是对先前开发的基因组编辑器的巨大改进，这些编辑器依靠蛋白质-核酸相互作用作为CRISPR-Cas9系统的主要优势，即它依靠RNA分子来瞄准感兴趣的区域。这意味着系统依赖于RNA-DNA相互作用，因此在设计每个实验15时可以利用标准基础配对规则。
此处详细介绍的CRISPR-Cas9系统由三个主要成分组成：单导RNA（sgRNA）、Cas9酶和供体DNA（dDNA）17。sgRNA由一个称为原空间器的20核苷酸区域以及一个称为脚手架18的较长区域组成。原型空间区域用于引导编辑系统到目标区域，因此针对每个实验进行了重新设计。支架是RNA区域，物理上与Cas9酶结合，形成核糖核蛋白（RNP），因此无论目标区域如何，都是相同的。Cas9酶在物理上促进目标DNA的裂解，使用原空间器作为指南来识别这个区域19。最后一个组件，dDNA，是可选的，它的使用取决于特定的实验20。dDNA 包含应专门插入由 Cas9 酶切割区域的序列，因此非常适合基因敲击实验，当基因被引入基因组时，或在引入抗生素耐药基因或其他可选标记来取代感兴趣的基因的基因敲除实验时。dDNA的设计也可以将新的序列引入基因组。例如，如下文所述，当需要基因截断时，可以引入帧内停止科登到感兴趣的基因的特定区域。其他应用包括基因特定区域的突变，如功能域22，或引入标记序列23。
使用CRISPR-Cas9系统的一个主要好处是它的多功能性24。这种适应性的一个例子是，Cas9酶可以引入宿主细胞的三种形式之一 - DNA，RNA或蛋白质 - 取决于使用的特定转换系统。当以DNA形式引入时，cas9基因通常包含在质粒中，以及一个可选标记物、一个用于表达sgRNA的盒式磁带，以及一个编码dDNA序列25的盒式磁带。该系统的主要优点是，只需要将单个结构转换为细胞，成功的转换可确保存在 CRISRP-Cas9 培养的基因组编辑所需的所有组件。但是，此方法依赖于宿主物种的表达式系统的可用性。Cas9要成功诱导DNA损伤，需要在高水平上表达，因此，需要一个合适的和潜在的特定启动子。对于尚未开发此类启动子的非模型物种，这可能是一个减损因素，因此以RNA或蛋白质形式引入Cas9的能力可能是一个更具吸引力的选择。将RNA引入细胞会带来自身的挑战，特别是RNA不稳定，可能无法在转化过程中存活下来。此外，当以DNA或RNA形式引入时，Cas9基因序列可能需要经过合成优化，才能用于特定的宿主系统17。例如，来自链球菌的cas9基因在哺乳动物宿主细胞中可能不起作用，而经过优化的用于哺乳动物细胞的cas9基因在植物细胞中可能不起作用。所有这些挑战都可以使用Cas9的蛋白质形式来克服，它与sgRNA一起可以组装成R RNP并转化为宿主细胞26，27。,27该系统不依赖于任何内生表达系统或科登优化，因此应工作在大多数非模型物种。蛋白质系统缺点是它与基于DNA的转化系统（如农业细菌的转移）不兼容。因此，要使基于蛋白质的方法起作用，需要提供一种转化协议，如那些依赖蛋白酶或生物活性剂的转化方案。这个基于RNP的系统已经成功地用于丝质真菌，富萨里姆氧26和Mucor环氧27。
亨蒂埃拉·阿曼尼西斯，一个Ceratocysidaceae家族的成员，是一种世界性真菌，经常在刚受伤的木本植物28上发现。虽然有高质量的基因组和转录组数据可用于这个物种28，29，30，,29,30没有制定转化或基因组编辑方案。迄今为止，对H.omanensis的研究已经集中在其性周期29，31的基本遗传成分。这种真菌表现出典型的异质性循环，性生殖只发生在MAT1-1和MAT1-2交配类型31的分离物之间。相比之下，MAT1-2分离的密切相关的亨蒂拉单体能够独立性生殖和完成性周期的情况下，没有MAT1-1伴侣31。这种性能力的差异被认为是，至少部分是由于交配基因MAT1-2-7的主要差异，其中H.omanensis窝藏一个完整的长度和完整的拷贝，而基因被严重截断在H.moniliformis29，31。29,31为了进一步描述这种基因在性生殖中的作用，MAT1-2-7的H.omanensis基因被截断，以模仿在H.moniliformis21中看到的截断21。
以下协议详细介绍了 使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9 基因组编辑系统对 MAT1-2-7 基因的转化和截断。该协议是在基于同源重组的基因替换和基于质粒的CRISPR-Cas9基因组编辑失败的方法之后开发的。
Protocol
1. sgRNA的设计和合成
- 要识别构成 sgRNA 一部分的潜在原空间区域，请使用搜索功能在所使用的程序中手动搜索 5' NGG 3' 三胞胎的感兴趣基因。将这些三胞胎注释为 PAM 序列。
注意：提供各种软件程序，用于搜索和注释潜在的 PAM 和原型空间序列。- 选择每个已识别的 PAM 序列的上游 20 bp，并注释这些序列作为潜在的原型空间。
- 要确定单个原型空间器，请执行以下筛选步骤以丢弃低质量序列。
- 要测试潜在原空间器的特异性，请将 PAM 序列和原空间器合并到单个序列中，并使用它作为针对整个基因组的 BLASTn 查询。丢弃任何与目标区域以外的基因组中任何区域相似的原空间器（图1A）。
- 为了确保RNA分子将折叠成正确的3D结构，与Cas9酶结合，创建一个组合序列，包括原空间器和特定于Cas9酶的脚手架序列。
- 将每个组合的原型空间-支架序列上传到RNA二级结构预测工具（材料表）。
- 通过比较最小自由能量和质心二级结构来分析结果。
注：理想的原始空间候选者将具有相同的最小自由能量和质心二级结构。两种辅助结构应由三个茎环组成，由五环结构中断。结构还应在整个结构中表现出高结合概率（以红色表示），但表示原型空间区域（图1B ） 除外。实际能量值不相关。
- 通过选择最接近目标的特定区域的候选项，从通过上述筛选步骤的候选者中选择最终候选项。
- 要合成sgRNA作为单个RNA分子，请使用与将使用的特定Cas9酶兼容的sgRNA合成试剂盒（材料表s），使用（例如，来自链球菌皮根的Cas9）。Table of Material
注：以下步骤可能取决于使用的 sgRNA 合成试剂盒。如果使用不同的套件，请按照制造商的说明操作。或者，可以订购sgRNA预合成。使用RNA时，使用无核酸酶试剂和一次性用品。- 如果上面步骤 1.3 中选择的 20 bp 原型空间在 5' 端不包含 G，则向该区域添加 G。
- 将 T7 启动子序列添加到目标序列的 5' 端。此序列是标准的，是 5' TTCTATACGACTCACTATAG 3'。
- 将 14 nt 重叠序列添加到目标序列的 3' 端。此序列是特定于套件的，对于此处使用的套件，该序列为 5' GTAGAGCTAGA 3' 。
- 订购生成的片段 5' TTCTACGACTCACTATAG（N）20 GTTAGAGCTAGA，其中 （N）20 表示选定的原空间器预合成（材料表）。
- 根据制造商的协议（材料表），在室温下结合以下试剂：2 μL水、10μL反应缓冲液、5 μL合成原空间序列、1 μL 0.1 M DTT和2 μL转录酶。
- 在37°C下孵育该溶液30分钟，并转移到冰中。
- 加入30μL水和2μL的DNase I，在37°C下混合和孵育15分钟。
- 在 2% 的气糖凝胶上可视化生成的 sgRNA。
2. 测试sgRNA 的体外裂解能力
注意：此步骤是可选的，但建议执行。
- 设计底土器，用于放大包含所选 sgRNA 目标且使用标准 DNA 聚合酶的站点序列的片段。
注：如果可能，设计底像的方式，在目标站点的裂解将产生两个非常不同的尺寸的碎片，可以很容易地区分在标准阿加罗斯凝胶上。 - 通过孵育由上述合成的30 nM sgRNA、30 nM Cas9蛋白、10倍反应缓冲液和10μL水组成的溶液，在25°C下孵育10μL。
- 通过将目标区域的 PCR 产品添加到 RNP 溶液中，以 3 nM 的最终浓度测试 sgRNA 的裂解能力。
- 在37°C下孵育溶液15分钟。
- 在溶液中加入3微克蛋白酶K和2μgRNase，以停止裂解反应，在室温下孵育10分钟。
- 在 2% 的阿加罗斯凝胶上可视化生成的 DNA 片段。如果凝胶上观察到两 个预期 大小的波段，sgRNA 适用于体内实验。
3. dDNA的设计和合成
- 设计dDNA由三个区域组成，5'和3'区域与目标基因组区域具有互补性，中间区域具有可选标记（材料表，图2）。
注：其他特定序列也可以添加到此可选标记中。对于这个特定的实验，一个停止科登序列（5'TGA 3'）被添加到可选标记之前，从而将帧内停止codon引入基因。dDNA 可以预合成。或者，dDNA可以使用分步重叠的PCR方法进行放大和组装，详情如下。- 设计底向器，可放大 5' 和 3' 侧翼区域的大约 800 bp。将 20 nt 序列添加到 5' 区域的反向底转和 3' 区域的正向底转中，以补充可选标记的序列。
- 设计用于放大可选标记的底像，确保放大产品具有抗性基因以及已知在感兴趣的物种中工作的启动器。
- 使用高保真DNA聚合酶（材料表），放大三个dDNA区域。从被编辑的有机体的gDNA中放大5'和3'区域。从相关源放大可选标记。
- 在一次反应中，将放大的5'区域与可选标记相结合，并使用远程高保真DNA聚合酶放大整个区域。
- 在第二个单一反应中，将放大的3'区域与可选标记相结合，并使用远程高保真DNA聚合酶放大整个区域。
- 最后，将前两个PCR产品组合成一个反应，用远程、高保真DNA聚合酶放大整个dDNA序列。
- 在1%的阿加罗斯凝胶上可视化DNA片段。如果生产了两个或更多片段，请使用凝胶纯化套件从凝胶中净化正确大小的碎片。
4. 拔起原体
- 为了生产锥形，在 500 mL 烧瓶中接种 200 mL 新鲜 2% 麦芽提取物汤 （MEB），其用 1 厘米 x 1 厘米的 mycelia 覆盖的阿加块。
注：并非所有真菌都能够产生锥形。在这种情况下，也可以使用 mycelia。这通常需要在协议中进一步增加解酶浓度。- 在25°C的震动培养箱中孵育液体培养，在120转/分时摇动24-48小时。
注：此孵化时间和温度已针对 H.omanensis进行了优化。这将需要针对其他物种进行优化。 - 收获的圆锥体;通过无菌实验室布层（如米拉布）过滤液体培养，将锥形悬浮液转移到50 mL离心管中，在4°C下以3，220 x g 的离心器进行10分钟。丢弃上一杯。
- 将锥形液在 5 mL 中重新将锥形和移液器 10 μL 中的锥形重新放在显微镜幻灯片上，并盖上盖玻片。使用40倍放大倍率下的复合显微镜进行可视化，以确保只回收锥形（图3A）。
- 在 500 mL 烧瓶中，接种 200 mL 的新鲜 1% MEB，与重新排的康尼迪亚的总体积。
- 在 25 °C 的摇培养箱中孵育液体培养，在 120 rpm 时摇动长达 12 小时。
注：此孵育时间已针对 H.omanensis进行了优化。这将需要针对其他物种进行优化。 - 要收获胚芽，将液体培养物转移到 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 3，220 x g 的离心器中转移 10 分钟。丢弃上一杯。
- 将胚芽重新在高达 10 m 的 1 M Sorbitol 中重新暂停。
- 将胚芽溶液的移液 10 μL 移液到显微镜幻灯片上，并盖上盖玻片。使用40倍放大倍率下的复合显微镜进行可视化，以确保只回收细菌（图3B）。
注意：可以在这里暂停协议。在-80°C下将萌芽储存在1 M的三醇中。
- 在25°C的震动培养箱中孵育液体培养，在120转/分时摇动24-48小时。
- 为了将幼小的细菌的细胞壁解中，释放原生，在无菌的50 mL烧瓶中，将1 mL的胚芽悬浮液加入9 mL的9 mL。
注：使用不同的酶浓度和孵育时间，见表 1。酶和浓度也可能因真菌而异，需要针对每个物种进行优化。- 在25°C的震动培养箱中孵育孢子酶溶液，在80转/分时摇动2至3小时。
- 通过无菌实验室布层过滤原蛋白溶液，在 4 °C 下以 1，810 x g 的离心收集原蛋白，10 分钟。丢弃上一杯。
注：原型是无细胞壁的细胞，因此对机械干扰非常敏感。请务必小心处理，尤其是在移液时。 - 小心地在 200 μL 的 STC 缓冲液中重新填充原质颗粒 （材料表） 。
- 将原向溶液的移液器 10 μL 移到显微镜幻灯片上，并盖上盖玻片。使用40倍放大倍率下的复合显微镜进行可视化，以确保只回收的原型（图3C）。
- 使用血细胞计，计算和计算上述步骤中生成的表体数。将原蛋白溶液稀释成含有约 5 x 106 个原蛋白的等分。
注意：可以在这里暂停协议。将原型在 -80 °C 的 STC 缓冲液中储存。
5. 原型和PEG辅助转换和转化恢复
- 要开始转换，请将大约 5 x 106 个原型与一个 RNP 溶液的体积和大约 6 μg 的 dDNA 片段混合。
注：原型对机械干扰非常敏感。请务必小心处理，尤其是在移液时。- 使用移液器，缓慢地将 1 mL 新鲜准备好的 30% PTC 溶液滴到 protoplast 溶液中，并在室温下孵育溶液 20 分钟。
注意：此步骤是一个敏感且非常重要的步骤。确保使用新鲜准备的 PTC 溶液，尽可能缓慢、均匀地将溶液滴在细胞上，从而在细胞表面形成疏水层。 - 将 5 mL 的渗透控制介质 （OCM） 添加到前托 last 溶液中，缓慢而轻轻地移液器，以确保溶液完全混合。
- 在25°C的震动培养箱中孵育原向溶液，在80转/分钟时一夜摇晃。
- 使用移液器，缓慢地将 1 mL 新鲜准备好的 30% PTC 溶液滴到 protoplast 溶液中，并在室温下孵育溶液 20 分钟。
- 要选择转换的隔离物，请将溶液划分为 5 个空的 60 mm 培养板。
- 在每个培养板中加入 10 mL 的 OCM agar，并辅以 30 μg/mL 的湿霉素 B，然后缓慢旋转每个板以彻底混合。
- 在添加 10 mL 的渗透控制介质加糖并辅以 40 μg/mL 湿霉素 B 之前，允许设置第一层 agar。
- 允许第二层阿加在25°C下设置和孵育培养物，直到可以看到单个分离物通过两层加糖生长。
- 为了恢复成功转化的分离物，将能够生长的单个分离物通过加糖层，辅以 40 μg/mL 湿霉素 B 转移到新鲜麦芽提取物 agar （MEA） 板，并辅以 50 μg/mL 湿霉素 B （MEA-50）。
- 在25°C下孵育新鲜培养物5天，每天检查生长。能够在这个媒体上持续增长的文化已经成功转变，并可用于进一步研究。
6. 确认dDNA的一体化和稳定性
- 为了确认dDNA已经集成到目标区域的基因组中，设计一侧预测5'和3'插入位点的底像（图2）。
- 使用这两个底转集和高保真DNA聚合酶执行两个PCR。如果两个 PCR 产生预期大小和序列的安普利森，则 dDNA 已成功集成到目标区域中。然后，评估突变染色，以稳定整合dDNA。
- 为了确认dDNA已经稳定地集成到基因组中，并在植物生长过程中保持，执行介质转移测试。
- 将一块由月间覆盖的糖从 MEA-50 介质上积极生长的突变体分离物转移到未松的 MEA 介质中。在25°C孵育3天。
- 将一块由 mycelia 覆盖的阿加从 MEA 介质上生长的隔离体转移到 MEA-50 介质。在25°C孵育3天。
- 重复这个过程，转移积极生长的 mycelia 从补充到未补充的介质至少四轮。
注：如果分离物能够在多次转移后在 MEA-50 介质上持续生长，则 dDNA已稳定地集成到基因组中，并通过植物生长来保持。突变染色可以评估只有一个副本的集成dDNA的存在。
- 为了确认dDNA已经集成到一个位置的基因组中，执行南方印迹分析。
- 根据制造商的协议，使用Hin dIII和 EcoRI限制酶，从每个 突变菌株中总共消化30μgggDNA。
注：虽然限制酶的选择由研究人员决定，但确保限制酶的识别位点不在dDNA序列中。 - 将消化的gDNA分离在0.75%的阿加罗斯凝胶上，并使用标准程序32将DNA转移到尼龙膜上。
- 使用针对 dDNA 序列的探针使膜杂交。
- 设计底流，放大 dDNA 的短 （300 bp） 区域。
- 使用这些底土，使用 PCR DIG 标签组合合成探头。
- 使用新合成的探头使用标准程序32进行膜杂交、处理和可视化。如果每个通道中只看到一个波段，则 dDNA 仅存在于基因组中的单个位置。突变菌株现在可用于进一步的表型分析和功能表征实验。
- 根据制造商的协议，使用Hin dIII和 EcoRI限制酶，从每个 突变菌株中总共消化30μgggDNA。
7. 突变菌株的表型分析
- 进行交配实验，以确定 MAT基因的 中断是否对所研究的真菌的性能力产生影响。
注：此步骤取决于所研究的特定基因和物种。在这种情况下，目标基因被认为参与性生殖，因此进行了交配测试。例如，如果认为该基因与无性生殖有关，那么可以测量类似细胞性生产的东西。- 为了测试突变菌株的异质功能，用突变菌株和相反交配类型的菌株共同接种新鲜的 MEA 介质。在 H.omanensis的情况下，保持板盖关闭，但不是密封和孵育室温7天。视觉评估性结构的产生。
- 为了测试突变菌株的同质性，用突变菌株接种新鲜的 MEA 介质。在 H.omanensis的情况下，保持板盖关闭，但不是密封和孵育室温7天。视觉评估性结构的产生。
- 进行增长率实验，以确定 MAT 基因的中断是否对所研究的真菌的生长速率产生影响。
- 通过将大型无菌移液器尖端的背面插入阿加中，从突变菌株和野生型菌株的培养边缘创建带面覆盖的美洲狮塞。
- 用这些阿加塞接种新鲜的 MEA 介质。确保每个区域性类型至少进行三次复制。
- 在20°C下生长3天后，测量两个垂直直径的生长。
- 比较野生型和突变菌株的数据。
Representative Results
上述协议有助于将早停止的科顿引入非模型的阿莫门西的 交配基因。这个过程利用了CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个版本，因此，在该协议中最重要的步骤之一是设计和合成高质量的sgRNA。 图1 显示了这种分子的设计方式，即A）专门瞄准感兴趣的基因，并且与基因组中的其它区域几乎没有相似性，B）为了与Cas9蛋白结合而正确折叠。sgRNA 还必须能够有效地切割目标区域。sgRNA靶向和允许目标区域裂解的能力在体外 进行，产生两个预期大小的产品。
一旦成功转化，必须确保dDNA只集成到基因组中一次，并被纳入预期位置。 图 2 说明了针对插入站点的 PCR 底像的设计，可用于筛选正确集成站点的潜在转换器。通过设计 5' 和 3' 插入位置的底面，只有在 dDNA 插入到正确的区域时，才可能放大。 图4 说明，过早停止科登被引入 MAT1-2-7 基因到正确的阅读框架，确保基因将被截断的方式与 H.moniliformis类似。此外，南方印迹分析表明，dDNA结构只集成在基因组中的单个位点。
该协议的成功在突变菌株的表型分析中得到证实。在MAT1-2-7中断实验中，开发了两个独立的突变菌株。在这两种分离物中，植物径向的生长速度显著降低，表明这种新型交配基因具有多益作用（图5）。此外，突变分离物无法完成性周期，只产生不产生性孢子的不成熟的性结构（图5）。这与野生型分离物形成鲜明对比，这种分离物在潜伏的几天内完成了整个性周期（图5）。
图1：选择合适的sgRNA候选者。
（A） 合适的 sgRNA 只与基因组的目标区域相似（在此例中由 MAT 位点 序列指示）。（B） 合适的 sgRNA 将具有相同的最小自由能量和质心二级结构，主步环中具有三个茎环和五环。此外，大多数结构将具有高绑定概率（以深橙色和红色表示），而较低的绑定概率应在原空间区域（由黑色三角形表示）中看到。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：dDNA的设计、放大和组装。
第一和第二个底源对（PP1和PP2）用于放大感兴趣的基因的上游（5'）和800bp下游（3'） 的约800bp。PP1 的反向底原和 PP2 的正向底转包括与湿霉素抗性盒同源的区域。第三个底原对放大了整个湿霉素抵抗盒。以循序渐进的方式，将各种 amplicons 组装到由 5' 区域、湿霉素抗性盒和 3' 区域组成的整个 dDNA 组装。当转化为细胞时，dDNA应在Cas9酶被定向切入区域重新组合，从而用湿霉素抵抗盒取代感兴趣的基因。PP4 和 PP5 可用于确定 dDNA 是否已正确插入到基因组中，位于适当的位置。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在原型提取协议中重要的不同细胞类型。
（A） Conidia 用作协议的起始材料。这些锥形允许发芽和生长，直到他们成为年轻的细菌.年轻萌芽的理想生长阶段由两个黑色箭头表示。在 （ B ） 上看到的其他mycelial链太成熟了， 不能降解， 不应该使用.协议的最后一步是释放 （C） 圆形的原型，由黑色虚线圆圈指示。这些细胞不再有细胞壁，因此对机械破坏非常敏感。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：TGA停止科登成功整合到H.omanensis的MAT1-2-7基因中。
（A） 全长H.omanensis MAT1-2-7基因，绿色箭头指示sgRNA靶点。（B） H.omanensis MAT1-2-7基因中sgRNA靶点的放大示意图。（C） dDNA区域的放大示意图，显示与H.omanensis的MAT1-2-7基因同源的停止科登侧翼。（D）桑格序列色谱图表明停止科顿成功集成到MAT1-2-7基因中。修改自威尔逊等人 202021.请单击此处查看此图的较大版本。
图5：（A）野生型分离物和（B）突变体分离物之间的表型差异。
每个面板中的前三个图像显示了两种隔离类型的性能力差异。虽然野生类型分离形式成熟作为在性生殖期间，完成孢子从同体颈部的尖端的外化，突变分离形式只不成熟的性结构，不产生任何性孢子。每个面板中的第四个图像显示了两种隔离类型在增长率和形态上的差异。虽然野生类型分离生长得更快，与更多的空中阿米莉亚，突变显示较慢，并淹没在阿加内。修改自威尔逊等人 202021. 请单击此处查看此图的较大版本。
| 反应 | 酶浓度 | 降级时间 |
| A | 1.250毫克/千升 | 180 分 |
| B | 1.875毫克/千升 | 180 分 |
| C | 2.500毫克/千升 | 150 分 |
| D | 3.750毫克/千升 | 150 分 |
| E | 4.375毫克/千升 | 120 分 |
| F | 5.000毫克/千升 | 120 分 |
表1：三叶鱼用酶的发芽/菌细胞溶液的降解。 不同的酶浓度对应于不同的潜伏期，较低的浓度需要更长的孵育时间。
Discussion
通过引入一个帧内过早停止的 codon 以及一个抗血霉素 B 21 的基因，演示了成功转化H. omanensis和编辑MAT1-2-7基因的协议。这是使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9基因组编辑系统实现的。实验包括进行 sgRNA 的体外转录，基于 PCR 的 dDNA 组装，以及将这两种核酸与市售的 Cas9 酶共同转化为从H. omanensis 中提取的上原体 in vitro
与其他依赖许多其他分子工具的协议不同，上述协议可以成功地用于分子工具箱仍然相当有限的物种。该协议仅依赖于已建立的转换系统和NGS数据的可用性，最好是全基因组序列。虽然有效的转换系统可能需要对一个物种进行一些优化，而对于这个物种来说，这种机制是不可用的，但各种物种都有不同的协议。此外，基因组数据正越来越多地提供给最晦涩的物种， 如果它们尚未 存在，也变得更容易产生。
鉴于协议的长度，有许多步骤可以引入修改，并且可能需要故障排除。对于被视为特定物种的步骤来说，情况尤其如此。例如，此协议中有许多孵化步骤需要在特定温度和特定时间长度下进行，以便生成对实验重要的细胞类型。因此，这些步骤将需要针对物种的优化。在可能的情况下，提供了特定细胞或生长阶段的显微图，以帮助将此协议转移到不同的物种（图1）。用于降解真菌细胞细胞壁以释放原体酶的酶的类型和浓度也将特定于所研究的真菌种类。在此协议中，只使用一种解酶的来源，而在像Fusarium顶极素33等物种中提取蛋白酶需要不同的酶组合。这一步完全取决于细胞壁的化学制造，因此需要根据物种对物种进行优化。
这种方法对于研究非模型物种的人特别重要，因为不需要依赖表达系统。建立CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个流行方法是从一个或两个质粒中表达Cas9蛋白、sgRNA以及dDNA，这些质粒被转换成选择细胞。在这种情况下，Cas9 需要由能够对所研究的特定生物体中具有高表达水平的启动子表示。一般促进剂已经开发用于丝真菌，虽然它们不兼容的所有物种，他们允许低水平表达，并可以成功地用于表达，例如，抗生素耐药性基因。然而，这些促进剂通常不允许高表达，因此不能用于表达Cas9蛋白。使用基于蛋白质版本的CRISPR-Cas9基因组编辑系统克服了这一限制，允许sgRNA和dDNA与已经生产的Cas9酶共同转化为细胞。
这种基于蛋白质的系统在H.omanensis中使用，在使用经典分裂标记方法以及基于质粒的CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑的许多尝试失败后，出现了开发。虽然效率因物种的不同，但分离标记方法已经成功地使用，在不同物种，如阿尔泰纳里亚改变34，35,35和C.尼科蒂亚纳36的物种100%的效率。相比之下，尽管有80多个独立的转换和集成事件，但H.omanensis系统的效率为零。同样，基于质粒的CRISPR-Cas9系统已经成功地在Trichoderma里西（>93%）17和青霉素菊17原（高达100%）37中高效率使用。这再次与这个系统在H.omanensis中的有用性相反。尽管尝试了一些潜在的促进者，包括从家政基因预测的两个物种特异性促进剂，但Casnensis的充分表达在H.omanensis中是无法实现的。因此，这个系统不能使用。然而，使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9系统，产生了许多独立的转化剂，其中两个在正确的位置容纳了集成的dDNA。此外，这个实验只尝试了一次，并且是成功的，这进一步说明了这个系统的易用性。
该协议的未来应用包括其优化和用于其他物种的Ceratocysidaceae。已有大量NGS数据可供这些物种提供30、38、39，,38,39有关宿主特异性40、生长速率和毒性41的研究已经进行。这些研究可以通过被认为参与这些过程的基因的功能特征来加强，由于有转化和基因组编辑协议的提供，这些研究现在成为可能。
总之，由于提供了不依赖于大量生物资源和分子工具包的易于使用的基因组编辑协议，对非模型物种重要生物过程基础的基因的彻底调查正变得越来越容易获得。研究非模型物种正变得越来越容易，并且将允许发现新的途径和有趣的偏差，从标准生物过程，已经阐明的模型物种。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了比勒陀利亚大学科学技术部/国家研究基金会（NRF）树木健康生物技术卓越中心的支持。该项目还得到了BD温菲尔德教授的DST/NRF SARCHI真菌基因组学主席（格兰特编号：98353）以及阿姆·威尔逊博士的NRF博士助学金（108548）的支持。赠款持有人承认，本工作所表达的意见、结论和结论或建议是研究人员的意见、结论和结论或建议，资助机构在这方面不承担任何责任。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EcoRI-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3101S | |
| EnGen Spy Cas9 NLS protein | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0646T | Used to assemble the RNP |
| Eppendorf 5810 R centrifuge | Eppendorf, Hamberg, Germany | ||
| FastStart Taq DNA Polymerase | Sigma, St Louis, USA | 12032902001 | Standard DNA polyermase |
| GeneJET Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | K0691 | |
| HindIII-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3104S | |
| HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit | New England Biolabs, Ipswich, USA | E2050S | |
| Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus | Sigma, St Louis, USA | 10843555001 | |
| Infors HT Ecotron Shaking Incubator | Infors AG, Bottmingen, Switzerland | ||
| LongAmp Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0323S | Long-range, high-fidelity DNA polymerase |
| Malt extract agar, 2% (MEA) | 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20 | ||
| Malt extract | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | |
| Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
| Malt Extract broth, 1% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 2 g ME in 200 ml ddH20 |
| Malt Extract broth, 2% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 4 g ME in 200 ml ddH20 |
| Miracloth | Merck Millipore, New Jersey, USA | 475855 | |
| Nylon membrane (positively charged) | Sigma, St Louis, USA | 11209299001 | |
| Osmotic control medium (OCM) | 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate | ||
| Casein Hydrolysate | Sigma, St Louis, USA | 22090 | |
| Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
| Yeast extract | Sigma, St Louis, USA | Y1625 | |
| Osmotic control medium (OCM) agar | Osmotic control medium (OCM) + 1% agar | ||
| Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
| PCR DIG Labeling Mix | Sigma, St Louis, USA | 11585550910 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | F-530XL | High fidelity DNA polymerase |
| Plasmid pcb1004 | N/A | N/A | From: Carroll et al., 1994 |
| Presynthesized sgRNA | Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa | Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence | |
| Proteinase K | Sigma, St Louis, USA | P2308 | |
| PTC Solution | 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above | ||
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma, St Louis, USA | 1546605 | |
| RNase A | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | 12091021 | |
| RNAfold Webserver | Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna | N/A | http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi |
| RNAstructure | Mathews Lab | N/A | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html |
| Sorbitol, 1 M | Sigma, St Louis, USA | 1617000 | 182.17g sorbitol in 1 l ddH20 |
| STC Buffer | 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2 | ||
| Calcium chloride | Sigma, St Louis, USA | 429759 | |
| Tris-HCl pH 8.00 | Sigma, St Louis, USA | 10812846001 | |
| Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
| Trichoderma harzianum lysing enzymes | Sigma, St Louis, USA | L1412 | |
| Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
- Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
- Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
- Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
- Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
- Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
- Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
- Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
- Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
- You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
- Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
- Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
- Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
- Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
- Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
- Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
- Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
- Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
- Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
- Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
- Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
- Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
- van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
- Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
- Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
- Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
- Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
- Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
- Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
- van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
- Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
- Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
- Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).
