Summary
CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet er en brukervennlig genomredaktør som har blitt brukt i modell- og ikke-modellarter. Her presenterer vi en proteinbasert versjon av dette systemet som ble brukt til å introdusere en for tidlig stoppkodon i et parringsgen av en ikke-modell filamentøs ascomycete sopp.
Abstract
CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet er et molekylært verktøy som kan brukes til å introdusere presise endringer i genomene til både modell- og ikke-modellarter. Denne teknologien kan brukes til en rekke genomredigeringsmetoder, fra gennnockouts og knockins til mer spesifikke endringer som innføring av noen nukleotider på et målrettet sted. Genomredigering kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert delvis funksjonell karakterisering av gener, produksjon av transgene organismer og utvikling av diagnostiske verktøy. Sammenlignet med tidligere tilgjengelige genredigeringsstrategier, har CRISPR-Cas9-systemet vist seg å være lett å etablere i nye arter og har høy effektivitet og spesifisitet. Hovedårsaken til dette er at redigeringsverktøyet bruker et RNA-molekyl for å målrette genet eller sekvensen av interesse, noe som gjør målmolekyldesignen enkel, gitt at standard baseparingsregler kan utnyttes. I likhet med andre genomredigeringssystemer krever CRISPR-Cas9-baserte metoder også effektive og effektive transformasjonsprotokoller, samt tilgang til sekvensdata av god kvalitet for utformingen av RNA- og DNA-molekylene. Siden innføringen av dette systemet i 2013, det har blitt brukt til å genetisk konstruere en rekke modellarter, inkludert Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster og Mus musculus. Deretter har forskere som arbeider med ikke-modellarter benyttet seg av systemet og brukt det til studiet av gener involvert i prosesser så forskjellige som sekundær metabolisme i sopp, nematodevekst og sykdomsresistens i planter, blant mange andre. Denne protokollen nedenfor beskriver bruken av CRISPR-Cas9 genomredigeringsprotokollen for avkorting av et gen som er involvert i den seksuelle syklusen av Huntiella omanensis, en filamentøs ascomycete sopp som tilhører Ceratocystidaceae-familien.
Introduction
Den økende tilgjengeligheten av høy kvalitet, fullt monterte genomer og transkripsjoner har i stor grad forbedret evnen til å studere et bredt spekter av biologiske prosesser i en rekkeorganismer 1. Dette gjelder både modellarter og ikke-modellarter, hvorav mange kan gi en mer variert forståelse av biologiske prosesser. Slike data kan brukes til genoppdagelse, identifisering av transkripsjonsnettverk og både hele genom- og transkripsjonssammenligninger, som hver kommer med sitt eget sett med applikasjoner. Men mens gener blir spådd, kommentert og antatt knyttet til ulike funksjonelle veier i en aldri før sett hastighet, forblir den funksjonelle karakteriseringen av disse genene bak, begrenset av de molekylære verktøysettene som er tilgjengelige for mange arter. Dette er spesielt tilfelle for de ikke-modellarter, hvor genomiske data er relativt lett å generere, men hvor ytterligere molekylær karakterisering har vært nær umulig1,2.
Delvis karakterisering av funksjonene til spesifikke gener som er viktige for biologien til sopparter, kan oppnås ved enten knockout- eller knockin-eksperimenter etterfulgt av fenotypisk analyse av mutantstammene3. Disse to systemene er helt avhengige av tilgjengeligheten av genteknologiprotokoller, inkludert i det minste et transformasjonssystem og et genetisk redigeringssystem. Det finnes en rekke forskjellige transformasjonssystemer som er utviklet i en rekke filamentøse sopp4. Fysiske systemer som de som er avhengige av biolistics og elektroporasjon har blitt utviklet i Trichoderma harzianum5 og Aspergillus niger6, henholdsvis. Systemer som benytter kjemikalier som kalsiumklorid eller litiumacetat er utviklet i Neurospora crassa7. Til slutt har biologiske systemer som er avhengige av bruk av Agrobacterium tumefaciens for transformasjon blitt brukt i Ceratocystis albifundus8.
I motsetning til tilgjengeligheten av ulike transformasjonsprotokoller er genomredigeringssystemer mindre rikelig. Mange av de tradisjonelle funksjonelle karakteriseringseksperimentene utført i filamentøse sopp benyttet en delt markør knockout konstruksjon i form av en valgbar markør flankert av regioner av homologi til målområdet eller genet igenomet 3. Metoden er avhengig av homologi rettet (HR) DNA reparasjon, som anlegg homolog rekombinasjon mellom knockout konstruksjon og regionen av interesse. Denne rekombinasjonshendelsen resulterer i utskifting av genet av interesse med sekvensen av den valgbare markøren. Dessverre, mens dette var vellykket i mange arter, inkludert Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 og Grosmannia clavigera12,er frekvensen av homolog rekombinasjon svært variabel på tvers av forskjellige sopparter, noe som gjør dette til en ineffektiv og noen ganger ubrukelig protokoll i visse arter3.
Andre genomredigeringssystemer, inkludert de som bruker sinkfingerkjerner (ZFNer) og transkripsjonsaktivatorlignende effektorkjerner (TALEN) representerte en stor forbedring på de eldre systemene, spesielt gitt deres evne til å gjøre spesifikke og målrettedeendringer 13. Både ZFNer og TALEN består av et kjerneprotein og et protein som er i stand til å gjenkjenne spesifikke nukleotidsekvenser13. Ved anerkjennelse induserer kjernen en dobbel strandet DNA-pause som kan lette innføringen av spesifikke mutasjoner. For å få til genomendringer må proteinregionen som gjenkjenner nukleotidsekvensen være spesielt designet for hvert eksperiment. På grunn av denne avhengigheten av protein-nukleinsyre interaksjoner for å veilede redigering, designe og produsere målretting molekyler for hver knockout eller knockin eksperiment er vanskelig ogarbeidskrevende 14,15. Illustrerende av disse utfordringene, svært få filamentous sopp har blitt utsatt for genom redigering ved hjelp av disse systemene. Et eksempel er TALENs-baserte systemet som ble utviklet i ris blast sopp, Magnaporthe oryzae16.
Uten tvil den største revolusjonen til feltet genomredigering var oppdagelsen og den påfølgende utviklingen av CRISPR-Cas9-systemet- en genomredaktør som muliggjør målrettet spalting av en sekvens av interesse av en endonukleær som styres av et RNA-molekyl. Dette var en stor forbedring på de tidligere utviklede genomredaktørene som stolte på proteinkjernesyreinteraksjoner, da den store fordelen med CRISPR-Cas9-systemet er at det er avhengig av et RNA-molekyl for å målrette interesseområdet. Dette betyr at systemet er avhengig av en RNA-DNA-interaksjon, og dermed kan standard grunnleggende sammenkoblingsregler utnyttes når du utformer hvert eksperiment15.
CRISPR-Cas9-systemet som beskrevet her består av tre hovedkomponenter: en enkelt guide RNA (sgRNA), Cas9-enzymet og et donor-DNA (dDNA)17. SgRNA består av en 20 nukleotidregion kalt protospacer samt en lengre region kaltstillaset 18. Protospacer-området brukes til å veilede redigeringssystemet til målområdet og er dermed redesignet for hvert eksperiment. Stillaset er regionen RNA som fysisk binder seg til Cas9-enzymet for å danne ribonucleoprotein (RNP) og er dermed identisk uavhengig av regionen som skal målrettes. Cas9-enzymet letter fysisk spaltningen av målet DNA, ved hjelp av protospacer som en guide for å identifisere denne regionen19. Den siste komponenten, dDNA, er valgfritt, og bruken avhenger av det bestemte eksperimentet20. DDNA har sekvensen som spesifikt skal settes inn i regionen som kuttes av Cas9-enzymet, og er dermed ideell for genbankeforsøk der et gen blir introdusert i genomet eller for gennedslagseksperimenter der et antibiotikaresistensgen eller annen valgbar markør blir introdusert for å erstatte genet av interesse. DDNA kan også utformes på en slik måte at de introduserer nye sekvenser i genomet. For eksempel, som beskrevet nedenfor, er det mulig å introdusere en in-frame stopp codon i en bestemt region i genet av interesse når en gen avkorting er nødvendig21. Andre bruksområder inkluderer mutasjonen av bestemte områder av genet, for eksempel et funksjonelt domene22, eller innføringen av en merkesekvens23.
En stor fordel med å bruke CRISPR-Cas9-systemet er allsidigheten24. Et eksempel på denne tilpasningsevnen er at Cas9-enzymet kan introduseres i vertscellen i en av sine tre former- DNA, RNA eller protein- avhengig av det bestemte transformasjonssystemet som brukes. Når introdusert i DNA-form, er cas9 genet ofte inkludert på en plasmid sammen med en valgbar markør, en kassett for å uttrykke sgRNA og, om nødvendig, en kassett koding dDNA sekvens25. Den primære fordelen med dette systemet er at bare en enkelt konstruksjon må forvandles til cellen og vellykket transformasjon sikrer at alle nødvendige komponenter for CRISRP-Cas9-mediert genomredigering er til stede. Denne metoden er imidlertid avhengig av tilgjengeligheten av et uttrykkssystem for vertsartene. For at Cas9 skal kunne indusere DNA-skader, må det uttrykkes på høye nivåer, og dermed er det nødvendig med en egnet og potensielt spesifikk arrangør. For ikke-modell arter der slike arrangører ennå ikke er utviklet, kan dette være en avskrekkende faktor, og dermed kan evnen til å introdusere Cas9 i RNA eller proteinform være et mer attraktivt alternativ. Innføringen av RNA i cellen bringer sine egne utfordringer- spesielt ved at RNA er ustabil og kanskje ikke overlever transformasjonsprosessen. Videre, når introdusert i enten DNA eller RNA-form, kan cas9 gensekvensen må være codon-optimalisert for bruk i det bestemte vertssystemet17. For eksempel kan cas9 genet fra Streptococcus pyogenes ikke fungere i en pattedyrvertscelle, og et cas9-gen som er codon-optimalisert for bruk i en pattedyrcelle, fungerer kanskje ikke i en plantecelle. Alle disse utfordringene kan overvinnes ved hjelp av proteinformen av Cas9, som sammen med sgRNA kan monteres til en RNP og forvandles til vertscellen26,27. Dette systemet er ikke avhengig av noe endogene uttrykkssystem eller kodonoptimalisering og bør dermed fungere i de fleste ikke-modellarter. Ulempen med det proteinbaserte systemet er at det ikke er kompatibelt med DNA-baserte transformasjonssystemer som Agrobacterium-mediert overføring. Derfor, for den proteinbaserte metoden for å fungere, må en transformasjonsprotokoll som de som er avhengige av protoplaster eller biolistika være tilgjengelige. Dette RNP-baserte systemet har blitt brukt i filamentøse sopp, Fusarium oxysporum26 og Mucor circinelloides27.
Huntiella omanensis, et medlem av Ceratocystidaceae familien, er en kosmopolitisk sopp som ofte finnes på nysårne woody planter28. Mens høy kvalitet genom og transkripsjonsdata er tilgjengelige for denne arten28,,29,,30,ingen transformasjon eller genom redigering protokoller er utviklet. Hittil har forskning på H. omanensis fokusert på de underliggende genetiske komponentene i sinseksuelle syklus 29,31. Denne soppen viser en typisk heterothallic seksuell syklus, med seksuell reproduksjon forekommer utelukkende mellom isolater av MAT1-1 og MAT1-2 parring typer31. I motsetning er MAT1-2 isolater av den nært beslektede Huntiella moniliformis i stand til uavhengig seksuell reproduksjon og fullføre en seksuell syklus i fravær av en MAT1-1 partner31. Denne forskjellen i seksuelle evner antas å være, i hvert fall delvis, på grunn av en stor forskjell i parringsgenet, MAT1-2-7, hvor H. omanensis har en full lengde og intakt kopi, mens genet er sterkt avkortet i H. moniliformis29,31. For ytterligere å karakterisere rollen til dette genet i seksuell reproduksjon, ble MAT1-2-7 genet av H. omanensis avkortet for å etterligne avkortingen sett i H. moniliformis21.
Protokollen nedenfor beskriver transformasjonen av H. omanensis og avkortingen av MAT1-2-7-genet ved hjelp av en proteinbasert versjon av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet. Denne protokollen ble utviklet etter tilnærmingene til homolog rekombinasjonsbasert generstatning og plasmidbasert CRISPR-Cas9 genomredigering var mislykket.
Protocol
1. Design og syntese av sgRNA
- Hvis du vil identifisere potensielle protospacer-regioner som vil inngå som en del av sgRNA, kan du manuelt søke gjennom interessekonflikten for 5' NGG 3-trillinger ved hjelp av søkefunksjonen uansett hvilket program som brukes. Kommenter disse trillingene som PAM-sekvenser.
MERK: Ulike programmer er tilgjengelige som søker etter og kommenterer de potensielle PAM- og protospacersekvensene.- Velg 20 bp oppstrøms av hver av de identifiserte PAM-sekvensene, og kommenter disse sekvensene som potensielle protospacere.
- Hvis du vil bestemme deg for et enkelt protospacer, utfører du følgende filtreringstrinn for å forkaste sekvenser av lav kvalitet.
- Hvis du vil teste for spesifisiteten til de potensielle protospacers, kombinerer du PAM-sekvensen og protospaceren i en enkelt sekvens og bruker den som en BLASTn-spørring mot hele genomet. Kast eventuelle protospacere som viser likhet med et hvilket som helst område i andre områder enn målområdet (figur 1A).
- For å sikre at RNA-molekylet vil foldes inn i riktig 3D-struktur for binding til Cas9-enzymet, opprett en kombinert sekvens, inkludert protospaceren og stillassekvensen som er spesifikk for Cas9-enzymet.
- Last opp hver av de kombinerte protospacer-stillas sekvenser i en RNA sekundær struktur prediksjon verktøy (Table of Materials).
- Analyser resultatene ved å sammenligne minimal fri energi og centroid sekundære strukturer.
MERK: Ideelle protospacer kandidater vil ha identisk minimal fri energi og centroid sekundære strukturer. Begge sekundære strukturer bør bestå av tre stilkløkker, avbrutt av fem ringstrukturer. Strukturene bør også vise høye bindende sannsynligheter (angitt i rødt) gjennom hele strukturen, med unntak av regionen som representerer protospacer (figur 1B). De faktiske energiverdiene er ikke relevante.
- Velg en endelig kandidat fra de som har sendt de ovennevnte filtreringstrinnene, ved å velge kandidaten som er nærmest det bestemte området som målrettes.
- For å syntetisere sgRNA som et enkelt RNA-molekyl,Table of Materialbruk et sgRNA-syntesesett ( Materialestabell) som er kompatibel med det bestemte Cas9-enzymet som skal brukes (f.eks. Cas9 fra Streptococcus pyogenes).
MERK: Følgende trinn kan være avhengig av sgRNA-syntesesettet som brukes. Hvis et annet sett brukes, følger du produsentens instruksjoner. Alternativt kan sgRNA bestilles forhåndssyntetisert. Når du arbeider med RNA, bruk nukleasefrie reagenser og engangsartikler.- Hvis 20 bp protospacer valgt i trinn 1.3 ovenfor ikke har en G på 5 'slutten, legger du til en G til denne regionen.
- Legg til T7-promoteringssekvensen på 5-trinns slutten av målsekvensen. Denne sekvensen er standard og er 5' TTCTAATACGACTCACTATAG 3'.
- Legg til en 14 nt overlappingssekvens i 3-enden av målsekvensen. Denne sekvensen er kit-spesifikk og er 5 ' GTTTTAGAGCTAGA 3 ' for settet som brukes her.
- Bestill det resulterende fragmentet 5' TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, med (N)20 som representerer det valgte protospacerforsyntetisert (Materialse ).
- I samsvar med produsentens protokoll (Materialstabell ) kombinerer du følgende reagenser ved romtemperatur: 2 μL vann, 10 μL reaksjonsbuffer, 5 μL syntetisert protospacersekvens, 1 μL på 0,1 M DTT og 2 μL transkripsjonsenzym.
- Inkuber denne oppløsningen ved 37 °C i 30 min og overfør til is.
- Tilsett 30 μL vann og 2 μL DNase I, bland og inkuber ved 37 °C i ytterligere 15 min.
- Visualiser den resulterende sgRNA på en 2% agarose gel.
2. Teste in vitro Cleavage Evne til sgRNA
MERK: Dette trinnet er valgfritt, men anbefales.
- Design primere som vil forsterke et fragment som skjuler sekvensen av området som den valgte sgRNA vil målrette og forsterke regionen ved hjelp av en standard DNA polymerase.
MERK: Hvis det er mulig, design primers på en slik måte at spalting på målstedet vil produsere to fragmenter av svært forskjellige størrelser som lett kan skilles fra hverandre på en standard agarose gel. - Monter det kombinerte sgRNA-Cas9 ribonucleoproteinet (RNP) ved å inkubere en løsning bestående av 30 nM sgRNA som syntetisert ovenfor, 30 nM Cas9 protein, 10x reaksjonsbuffer og 10 μL vann ved 25 °C i 10 min.
- Test sgRNA-sgRNA-sgRNA-spaltingsevnen ved å legge til PCR-produktet i målområdet i RNP-løsningen til en endelig konsentrasjon på 3 nM.
- Inkuber oppløsningen ved 37 °C i 15 min.
- Tilsett 3 μg proteinase K og 2 μg RNase til løsningen for å stoppe spaltingsreaksjonen og inkubere ved romtemperatur i 10 min.
- Visualiser de resulterende DNA-fragmentene på en 2% agarose gel. SgRNA er egnet for in vivo eksperimentering hvis to bånd av forventet størrelse observeres på gelen.
3. Design og syntese av dDNA
- Design dDNA som skal bestå av tre regioner- 5 ' og 3 'regioner med komplementaritet til den genomiske regionen blir målrettet og en mellomregion som har en valgbar markør (Table of Materials, Figur 2).
MERK: Andre spesifikke sekvenser kan også legges til denne valgbare markøren. For dette eksperimentet ble en stop codon-sekvens (5' TGA 3') lagt til like før den valgbare markøren, og dermed introdusere en in-frame stop codon inn i genet. DDNA kan bestilles forutståt. Alternativt kan dDNA forsterkes og monteres ved hjelp av en trinnvis, overlappende PCR-tilnærming som beskrevet nedenfor.- Design primere for å forsterke ca 800 bp av 5 'og 3' flankering regioner. Legg til 20 nt sekvens som er komplementær til den valgbare markørens sekvens i 5-regionens omvendte primer og 3's region fremover primer.
- Design primere som forsterker den valgbare markøren, slik at det forsterkede produktet havner motstandsgenet, samt en promotor kjent for å fungere i arten av interesse.
- Ved hjelp av en high-fidelity DNA polymerase (Table of Materials), forsterke de tre dDNA-regionene. Forsterk de 5' og 3' regionene fra gDNA av organismen som redigeres. Forsterk den valgbare markøren fra en relevant kilde.
- I en enkelt reaksjon, kombinere den forsterkede 5 'regionen med valgbar markør og, ved hjelp av en lang rekke, high-fidelity DNA polymerase, forsterke hele regionen.
- I en annen enkelt reaksjon, kombinere den forsterkede 3 'regionen med valgbar markør og, ved hjelp av en lang rekke, high-fidelity DNA polymerase, forsterke hele regionen.
- Til slutt kombinerer du de to foregående PCR-produktene til en enkelt reaksjon og forsterker hele dDNA-sekvensen med en langtrekkende DNA-polymerase med høy kvalitet.
- Visualiser DNA-fragmentet på en 1% agarose gel. I tilfelle at to eller flere fragmenter produseres, renser du det riktig størrelse fragmentet fra gelen ved hjelp av et gelrensesett.
4. Ekstraksjon av protoplaster
- For å produsere conidia, inokulere 200 ml fersk 2% maltekstraktbuljong (MEB) i en 500 ml kolbe med en 1 cm x 1 cm mycelia-dekket agarblokk.
MERK: Ikke alle sopp er i stand til å produsere conidia. I så fall kan mycelia også brukes. Dette vil vanligvis kreve høyere konsentrasjoner av lysing enzymet videre i protokollen.- Inkuber væskekulturen i en ristende inkubator ved 25 °C med risting ved 120 o/min i 24 -48 timer.
MERK: Denne inkubasjonstiden og temperaturen er optimalisert for H. omanensis. Dette må optimaliseres for andre arter. - For å høste conidia; filtrere væskekulturen gjennom et lag med steril laboratorieklut (f.eks. Miracloth), overfør den konidiale suspensjonen til 50 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 3220 x g ved 4 °C i 10 min. Kast det overnaturlige.
- Bruk conidiaen på nytt i 5 ml vann og pipette 10 μL av konidialøsningen på et mikroskopsklie og dekk med en dekkslipp. Visualiser ved hjelp av et sammensatt mikroskop under 40x forstørrelse for å sikre at bare conidia er gjenopprettet (figur 3A).
- I en 500 ml kolbe inokulerer du 200 ml frisk 1% MEB med det totale volumet av resuspended conidia.
- Inkuber væskekulturen i en ristende inkubator ved 25 °C med risting ved 120 o/min i opptil 12 timer.
MERK: Denne inkubasjonstiden er optimalisert for H. omanensis. Dette må optimaliseres for andre arter. - For å høste germlings, overfør væskekulturen til 50 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 3220 x g ved 4 °C i 10 min. Kast det overnaturlige.
- Resuspend germlings i opptil 10 ml av 1 M sorbitol.
- Pipette 10 μL av germling oppløsning på et mikroskop lysbilde og deksel med en dekkslip. Visualiser ved hjelp av et sammensatt mikroskop under 40x forstørrelse for å sikre at bare germlings er gjenopprettet (figur 3B).
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevares i 1 M sorbitol ved -80 °C.
- Inkuber væskekulturen i en ristende inkubator ved 25 °C med risting ved 120 o/min i 24 -48 timer.
- For å lyse celleveggene til de unge germlings og frigjøre protoplastene, tilsett 1 ml av germling suspensjon til 9 ml lysing enzym ved ulike konsentrasjoner i en steril 50 ml kolbe.
MERK: Ulike enzymkonsentrasjoner og inkubasjonstider brukes og finnes i tabell 1. Enzymer og konsentrasjoner er også sannsynlig å variere avhengig av sopp og må optimaliseres for hver art.- Inkuber sporeenzymoppløsningen i en ristende inkubator ved 25 °C med risting ved 80 o/min i 2 til 3 timer.
- Filtrer protoplastoppløsningen gjennom et lag steril laboratorieklut og samle protoplastene ved sentrifugering ved 1810 x g ved 4 °C i 10 min. Kast det overnaturlige.
MERK: Protoplaster er celler uten cellevegger og er dermed svært følsomme for mekanisk forstyrrelse. Pass på å håndtere dem nøye, spesielt når pipettering. - Bruk protoplastpelleten forsiktig i 200 μL STC-buffer (Materialtabell).
- Pipette 10 μL av protoplastløsningen på et mikroskopsklie og dekk med en dekkslips. Visualiser ved hjelp av et sammensatt mikroskop under 40x forstørrelse for å sikre at bare protoplaster er gjenopprettet (figur 3C).
- Bruk et hemocytometer, telle og beregne antall protoplaster generert i trinnene ovenfor. Fortynn protoplastoppløsningen i aliquots som inneholder ca. 5 x 106 protoplaster.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar protoplaster i STC-buffer ved -80 °C.
5. Protoplast og PEG-assistert transformasjon og transformant utvinning
- For å starte transformasjonen, kombinere ca 5 x 106 protoplaster med ett enkelt volum av RNP-oppløsningen og ca. 6 μg av dDNA-fragmentet.
MERK: Protoplaster er svært følsomme for mekaniske forstyrrelser. Pass på å håndtere dem nøye, spesielt når pipettering.- Bruk en pipette til å dryppe sakte 1 ml av en nylaget 30% PTC-løsning på protoplastløsningen og inkubere oppløsningen ved romtemperatur i 20 min.
MERK: Dette trinnet er et følsomt og svært viktig trinn. Sørg for å bruke nylaget PTC-oppløsning og slippe oppløsningen over cellene så sakte og jevnt som mulig, og skape et hydrofobe lag over celleoverflaten. - Tilsett 5 ml osmotisk kontrollmedium (OCM) i protoplastløsningen og pipetten langsomt og forsiktig for å sikre at oppløsningen blandes grundig.
- Inkuber protoplastoppløsningen i en ristende inkubator ved 25 °C med risting ved 80 o/min over natten.
- Bruk en pipette til å dryppe sakte 1 ml av en nylaget 30% PTC-løsning på protoplastløsningen og inkubere oppløsningen ved romtemperatur i 20 min.
- Hvis du vil velge de transformerte isolatene, deler du løsningen i 5 tomme 60 mm kulturplater.
- Tilsett 10 ml OCM agar supplert med 30 μg/ml hygromycin B til hver kulturplate og roter langsomt hver plate for å blandes grundig.
- La det første laget av agar sette før du legger til 10 ml osmotisk kontroll medium agar supplert med 40 μg / ml hygromycin B.
- La det andre laget av agar sette og inkubere kulturer ved 25 ° C til enkelt isolater kan sees vokser gjennom begge lag av agar.
- For å gjenopprette vellykket forvandlede isolater, overfør de enkelte isolatene som er i stand til vekst gjennom agarlaget supplert med 40 μg / ml hygromycin B til friske maltekstrakt agar (MEA) plater supplert med 50 μg / ml hygromycin B (MEA-50).
- Inkuber de friske kulturene ved 25 °C i 5 dager, og se daglig etter vekst. Kulturer som er i stand til vedvarende vekst på disse mediene har lykkes med å bli forvandlet og kan brukes til videre studier.
6. Bekreftelse av integrering og stabilitet av dDNA
- For å bekrefte at dDNA er integrert i genomet ved målområdet, design primere som flankerer de spådde 5 'og 3' sett inn nettsteder (Figur 2).
- Utfør to PCR-er ved hjelp av disse to primersettene og en high-fidelity DNA polymerase. Hvis begge PCR-ene gir amplicons av forventet størrelse og sekvens, ble dDNA integrert i målområdet. Deretter vurderer du den muterte flekken for stabil integrering av dDNA.
- For å bekrefte at dDNA er stabilt integrert i genomet og vil bli opprettholdt under vegetativ vekst, utføre en medieoverføringstest.
- Overfør en blokk med mycelial-dekket agar fra en aktivt voksende mutant isolat på MEA-50 medium til usupplert MEA medium. Inkuber ved 25 °C i 3 dager.
- Overfør en blokk med mycelia-dekket agar fra isolat vokser på MEA medium til MEA-50 medium. Inkuber ved 25 °C i 3 dager.
- Gjenta denne prosessen, overføre aktivt voksende mycelia fra supplert til usupplert medium i minst fire runder.
MERK: Hvis isolatet er i stand til vedvarende vekst på MEA-50 medium etter mange overføringer, har dDNA blitt stabilt integrert i genomet og kan opprettholdes gjennom vegetativ vekst. Den muterte flekken kan vurderes for tilstedeværelse av bare en enkelt kopi av den integrerte dDNA.
- For å bekrefte at dDNA er integrert i genomet på ett sted, utfør en sørlig flekkanalyse.
- Fordøy totalt 30 μg gDNA fra hver mutert stamme ved hjelp av HindIII og EcoRI begrensning enzymer i samsvar med produsentens protokoller.
MERK: Selv om valget av begrensningsenzym er opp til forskeren, må du sørge for at begrensningsenzymets gjenkjenningssted ikke finnes i dDNA-sekvensen. - Skill den fordøyde gDNA på en 0,75% agarose gel og overfør DNA til en nylonmembran ved hjelp avstandardprosedyrer 32.
- Utvis membranen for hybridisering ved hjelp av en sonde rettet mot dDNA-sekvensen.
- Design primere for å forsterke en kort (300 bp) region av dDNA.
- Ved hjelp av disse primers, syntetisere sonden ved hjelp av en PCR DIG merking blanding.
- Bruk den nylig syntetiserte sonden for membranhybridisering, behandling og visualisering ved hjelp avstandardprosedyrer 32. Hvis bare et enkelt bånd er sett i hvert kjørefelt, er dDNA til stede på bare ett sted i genomet. Mutantstammen kan nå brukes til ytterligere fenotypiskanalyse og funksjonelle karakteriseringseksperimenter.
- Fordøy totalt 30 μg gDNA fra hver mutert stamme ved hjelp av HindIII og EcoRI begrensning enzymer i samsvar med produsentens protokoller.
7. Fenotypisk analyse av mutantstammene
- Gjennomføre parringseksperimenter for å avgjøre om forstyrrelsen av MAT-genet hadde en effekt på soppens seksuelle evner som studeres.
MERK: Dette trinnet er avhengig av det bestemte genet og arten som studeres. I dette tilfellet antas genet som målrettes å være involvert i seksuell reproduksjon og dermed parringstester ble utført. Hvis genet ble antatt, for eksempel, å være involvert i aseksuell reproduksjon, så noe som konidial produksjon kunne måles.- For å teste de heterothallic egenskapene til mutantstammen, co-inokulere frisk MEA medium med en mutant belastning samt en stamme av motsatt parring type. Ved H. omanensis, hold lokkene på platene lukket, men ikke forseglet og inkuber ved romtemperatur i 7 dager. Visuelt vurdere for produksjon av seksuelle strukturer.
- For å teste de homothallic egenskapene til mutantstammen, inokulerer friskt MEA-medium med en mutert belastning. Ved H. omanensis, hold lokkene på platene lukket, men ikke forseglet og inkuber ved romtemperatur i 7 dager. Visuelt vurdere for produksjon av seksuelle strukturer.
- Gjennomføre vekstrateeksperimenter for å avgjøre om forstyrrelsen av MAT-genet hadde en effekt på veksten av soppen som studeres.
- Lag mycelial-dekket agar plugger fra aktivt voksende kanten av kulturer av mutant og wildtype stammer ved å sette baksiden av en stor, steril pipette tips i agar.
- Inokuler fersk MEA medium med disse agar plugger. Sørg for at minst tre replikeringer per hver kulturtype er laget.
- Etter 3 dager med vekst ved 20 °C, mål veksten på to vinkelrett diameter.
- Sammenlign dataene fra wildtype og mutant stammer.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor tilrettelagt innføringen av en for tidlig stopp codon i et parring gen fra ikke-modell ascomycete, H. omanensis. Denne prosessen benyttet en versjon av CRISPR-Cas9 genom redigeringssystem og som sådan en av de viktigste trinnene i denne protokollen er design og syntese av en høy kvalitet sgRNA. Figur 1 viser hvordan dette molekylet ble designet på en slik måte at det A) spesifikt retter seg mot genet av interesse og viser liten likhet med andre regioner i genomet og B) brettes riktig for å binde seg til Cas9-proteinet. SgRNA må også være i stand til effektivt å spalte målområdet. SgRNA's evne til å målrette og tillate spaltning av målområdet ble utført in vitro, noe som gir to produkter av forventet størrelse.
Når vellykket transformasjon har funnet sted, er det viktig å sikre at dDNA har integrert seg i genomet bare én gang og på forventet sted. Figur 2 illustrerer utformingen av PCR-primere som retter seg mot innsettingsstedene, som kan brukes til å screene de potensielle transformeringene for riktig integreringssted. Ved å designe primere som flankerer 5' og 3' innsettingssteder, er forsterkning bare mulig hvis dDNA settes inn i riktig område. Figur 4 illustrerer at for tidlig stoppkodon ble introdusert i MAT1-2-7 genet i riktig leseramme, slik at genet ville bli avkortet på samme måte som H. moniliformis. Videre viste Southern blot analyse at dDNA-konstruksjonen bare ble integrert på ett enkelt sted i genomet.
Suksessen til protokollen ble bekreftet på fenotypisk analyse av mutantstammene. I tilfelle av MAT1-2-7 avbrudd eksperiment, ble to uavhengige mutant stammer utviklet. I begge isolater ble den vegetative radiale veksten betydelig redusert, noe som tyder på en pleiotropisk effekt av det nye parringsgenet (figur 5). Videre var mutant isolater ute av stand til å fullføre en seksuell syklus, produsere bare umodne seksuelle strukturer som ikke produserte seksuelle sporer (Figur 5). Dette var i motsetning til wildtype isolater, som fullførte hele seksuell syklus innen få dager etter inkubasjon (Figur 5).
Figur 1: Velge en passende sgRNA-kandidat.
(A) En passende sgRNA vil bare ha likhet med målområdet av genomet (i dette tilfellet angitt av MAT locus sekvens). (B) En egnet sgRNA vil ha identisk minimal fri energi og centroid sekundære strukturer, med de tre stammen løkker og fem ringer i den primære trinnsløyfen. Videre vil flertallet av strukturen ha høye bindende sannsynligheter (angitt i mørk oransje og rød) mens lavere bindende sannsynligheter bør ses på protospacer-regionen (indikert av de svarte trekantene). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Design, forsterkning og montering av dDNA.
De første og andre primerparene (PP1 og PP2) brukes til å forsterke ca. 800 bp oppstrøms (5') og 800 bp nedstrøms (3') av interessegen. Den omvendte primeren av PP1 og fremover primer av PP2 inkluderer regioner av homologi til hygromycin motstand kassett. Det tredje primerparet forsterker hele hygromycinmotstandskassetten. På en trinnvis måte monteres de ulike ampliklonene til hele dDNA, bestående av 5's-regionen, hygromycinresistenskassetten og 3'-regionen, er montert. Når den omdannes til cellen, bør dDNA kombineres på den regionen der Cas9-enzymet vil ha blitt rettet mot å kutte, og dermed erstatte genet av interesse med hygromycinresistenskassetten. PP4 og PP5 kan brukes til å avgjøre om dDNA er riktig satt inn i genomet på riktig sted. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: De forskjellige celletypene som er viktige under protoplastekstraksjonsprotokollen.
(A) Conidia brukes som startmateriale for protokollen. Disse conidia har lov til å spire og vokse til de er (B) unge germlings. Den ideelle vekstfasen av de unge germlings er indikert av de to svarte pilene. Andre mycelial tråder sett på (B) er for modne for nedbrytning og bør ikke brukes. Det siste trinnet i protokollen er utgivelsen av (C) runde protoplaster, indikert av de svarte, stiplede sirkler. Disse cellene har ikke lenger cellevegger og er dermed svært følsomme for mekanisk forstyrrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vellykket integrering av TGA stopper codon i MAT1-2-7 genet av H. omanensis.
(A)Det full-lengde H. omanensis MAT1-2-7 genet, med sgRNA målstedet indikert av den grønne pilen. (B)En forstørret skjematisk av sgRNA målområdet innenfor H. omanensis MAT1-2-7 genet. (C) En forstørret skjematisk av en region av dDNA viser stoppkodon flankert av armene homolog til MAT1-2-7 genet av H. omanensis. (D) Sanger sekvens kromatrammet indikerer vellykket integrering av stoppkodon i MAT1-2-7 genet. Modifisert fra Wilson et al. 202021. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: De fenotypiske forskjellene mellom (A) wildtype isolerer og (B) muterte isolerer.
De tre første bildene i hvert panel viser forskjellene i de seksuelle egenskapene til de to isolattypene. Mens wildtype isolerer form modne ascomata under seksuell reproduksjon, komplett med utstrålelse av sporer fra spissene av ascomatal necks, mutant isolerer danner bare umodne seksuelle strukturer som ikke produserer noen seksuelle sporer. Det fjerde bildet i hvert panel viser forskjellen i vekstrate og morfologi av de to isolattypene. Mens wildtype isolate vokser mye raskere og med mer antenne mycelia, mutant viser langsommere og er nedsenket i agar. Modifisert fra Wilson et al. 202021. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reaksjon | Enzymkonsentrasjon | Nedbrytningstid |
| A | 1,250 mg/ml | 180 min. |
| B | 1,875 mg/ml | 180 min. |
| C | 2,500 mg/ml | 150 min. |
| D | 3,750 mg/ml | 150 min. |
| E | 4,375 mg/ml | 120 min. |
| F | 5.000 mg/ml | 120 min. |
Tabell 1: Nedbrytning av germling/mycelia-oppløsningen med lysende enzymer fra Trichoderma harzianum. De forskjellige enzymene konsentrasjoner tilsvarer ulike inkubasjonsperioder, med lavere konsentrasjoner som krever lengre inkubasjoner.
Discussion
Protokollen for vellykket transformasjon av H. omanensis og redigering av MAT1-2-7 genet ble demonstrert ved å innføre en in-frame for tidlig stopp codon sammen med et gen for motstand mot hygromycin B21. Dette ble oppnådd ved hjelp av en proteinbasert versjon av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet. Forsøket medførte in vitro transkripsjon av sgRNA, PCR-basert montering av dDNA og samtidig transformasjon av disse to nukleinsyrer med et kommersielt tilgjengelig Cas9-enzym i protoplaster ekstrahert fra H. omanensis
I motsetning til andre protokoller som er avhengige av tilgjengeligheten av mange andre molekylære verktøy, kan protokollen beskrevet ovenfor brukes i arter som den molekylære verktøykassen fortsatt er ganske begrenset21. Protokollen er bare avhengig av et etablert transformasjonssystem og tilgjengeligheten av NGS-data, fortrinnsvis hele genomsekvensen. Mens et effektivt transformasjonssystem kan ta litt optimalisering i en art som dette ikke er tilgjengelig for, er det mange forskjellige protokoller tilgjengelig for en rekke arter. Videre blir genomdata stadig mer tilgjengelige for selv de mest obskure av arter og blir lettere å generere de novo hvis det ikke allerede eksisterer.
Gitt lengden på protokollen, er det mange trinn der endringer kan innføres og hvor feilsøking kan være nødvendig. Dette gjelder spesielt for trinnene som anses som arter spesifikke. Det er for eksempel mange inkubasjonstrinn i denne protokollen som må utføres ved bestemte temperaturer og for bestemte tidsperioder for å generere celletyper som er viktige for eksperimentet. Disse trinnene vil dermed kreve artsspesifikk optimalisering. Der det er mulig, er det gitt mikrografer av de bestemte cellene eller vekstfasene for å bidra til å overføre denne protokollen til en annen art (Figure 1). Typen og konsentrasjonen av enzymer som brukes til å forringe celleveggene i soppcellene for å frigjøre protoplastene, vil også være spesifikk for arten av sopp som studeres. I denne protokollen brukes bare en kilde til lysingenzymer fra, mens forskjellige enzymkombinasjoner er nødvendig for utvinning av protoplaster i arter som Fusarium verticillioider33. Dette trinnet avhenger helt av celleveggens kjemiske make og må dermed optimaliseres på en art til artsbasis.
Denne metoden er spesielt viktig for de som studerer ikke-modellarter, da det ikke er tillit til et uttrykkssystem. En populær metode for å etablere CRISPR-Cas9 genom redigeringssystemet er å uttrykke Cas9 protein, sgRNA samt dDNA fra en eller to plasmids som er forvandlet til cellene av valget. I dette tilfellet må Cas9 uttrykkes av en promotor som er i stand til høye nivåer av uttrykk i den bestemte organismen som studeres. Generelle arrangører er utviklet for bruk i filamentøse sopp, og selv om de ikke er kompatible i alle arter, tillater de lavt nivå uttrykk og kan med hell brukes til å uttrykke for eksempel antibiotikaresistensgener. Disse arrangørene tillater imidlertid ofte ikke høye nivåer av uttrykk og kan derfor ikke brukes til å uttrykke Cas9-proteinet. Ved hjelp av en proteinbasert versjon av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystemet overvinner denne begrensningen og gjør at sgRNA og dDNA kan bli co-forvandlet til cellen med et allerede produsert Cas9-enzym.
Utviklingen av dette proteinbaserte systemet for bruk i H. omanensis kom etter mange mislykkede forsøk på genomredigering ved hjelp av både den klassiske splittmarkørtilnærmingen samt det plasmidbaserte CRISPR-Cas9-systemet. Mens effektiviteten varierer fra arter til arter, har den splittede markørtilnærmingen blitt brukt med 100% effektivitet i arter så forskjellige som Alternaria alternata34,,35og C. nicotianae36. Til sammenligning var effektiviteten av dette systemet i H. omanensis null, til tross for mer enn 80 uavhengige transformasjons- og integreringshendelser. Tilsvarende har det plasmidbaserte CRISPR-Cas9-systemet blitt brukt med høy effektivitet i Trichoderma reesei (> 93%)17 og Penicillium chrysogenum (opptil 100%)37. Dette er igjen i motsetning til dette systemets nytte i H. omanensis. Tilstrekkelig uttrykk for Cas9-proteinet var ikke oppnåelig i H. omanensis til tross for å prøve en rekke potensielle arrangører, inkludert to artsspesifikke arrangører spådd fra rengjøringsgener. Dermed kunne dette systemet ikke brukes i det hele tatt. Ved hjelp av den proteinbaserte versjonen av CRISPR-Cas9-systemet ga imidlertid mange uavhengige transformanter, hvorav to hadde den integrerte dDNA på riktig sted. Videre ble dette eksperimentet forsøkt bare én gang og var vellykket- ytterligere illustrerer hvor enkelt dette systemet kan brukes.
Fremtidige anvendelser av denne protokollen inkluderer optimalisering og bruk i andre arter av Ceratocystidaceae. Det er allerede et vell av NGS data tilgjengelig for disseartene 30,38,39 og studier om deres vert spesifisitet40, vekstrate og virulens41 er gjennomført. Disse studiene kan styrkes ved funksjonell karakterisering av genene som antas å være involvert i disse prosessene, forskning som nå vil bli mulig på grunn av tilgjengeligheten av en transformasjons- og genomredigeringsprotokoll.
Til slutt blir grundig undersøkelse av genene som ligger til grunn for viktige biologiske prosesser i ikke-modellarter, mer tilgjengelige takket være tilgjengeligheten av brukervennlige genomredigeringsprotokoller som ikke er avhengige av eksistensen av omfattende biologiske ressurser og molekylære verktøysett. Å studere ikke-modellarter blir lettere og vil tillate oppdagelsen av nye veier og interessante avvik fra standard biologiske prosesser som har blitt belyst i modellarter.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av University of Pretoria, Institutt for vitenskap og teknologi (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Prosjektet ble i tillegg støttet av Prof BD Wingfields DST/NRF SARChI-stol i Fungal Genomics (Grant number: 98353) samt Dr AM Wilsons NRF PhD bursary (108548). Tilskuddsinnehaverne erkjenner at meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette arbeidet er forskernes og at finansieringsorganene ikke påtar seg noe ansvar overhodet i denne forbindelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EcoRI-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3101S | |
| EnGen Spy Cas9 NLS protein | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0646T | Used to assemble the RNP |
| Eppendorf 5810 R centrifuge | Eppendorf, Hamberg, Germany | ||
| FastStart Taq DNA Polymerase | Sigma, St Louis, USA | 12032902001 | Standard DNA polyermase |
| GeneJET Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | K0691 | |
| HindIII-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3104S | |
| HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit | New England Biolabs, Ipswich, USA | E2050S | |
| Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus | Sigma, St Louis, USA | 10843555001 | |
| Infors HT Ecotron Shaking Incubator | Infors AG, Bottmingen, Switzerland | ||
| LongAmp Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0323S | Long-range, high-fidelity DNA polymerase |
| Malt extract agar, 2% (MEA) | 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20 | ||
| Malt extract | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | |
| Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
| Malt Extract broth, 1% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 2 g ME in 200 ml ddH20 |
| Malt Extract broth, 2% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 4 g ME in 200 ml ddH20 |
| Miracloth | Merck Millipore, New Jersey, USA | 475855 | |
| Nylon membrane (positively charged) | Sigma, St Louis, USA | 11209299001 | |
| Osmotic control medium (OCM) | 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate | ||
| Casein Hydrolysate | Sigma, St Louis, USA | 22090 | |
| Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
| Yeast extract | Sigma, St Louis, USA | Y1625 | |
| Osmotic control medium (OCM) agar | Osmotic control medium (OCM) + 1% agar | ||
| Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
| PCR DIG Labeling Mix | Sigma, St Louis, USA | 11585550910 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | F-530XL | High fidelity DNA polymerase |
| Plasmid pcb1004 | N/A | N/A | From: Carroll et al., 1994 |
| Presynthesized sgRNA | Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa | Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence | |
| Proteinase K | Sigma, St Louis, USA | P2308 | |
| PTC Solution | 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above | ||
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma, St Louis, USA | 1546605 | |
| RNase A | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | 12091021 | |
| RNAfold Webserver | Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna | N/A | http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi |
| RNAstructure | Mathews Lab | N/A | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html |
| Sorbitol, 1 M | Sigma, St Louis, USA | 1617000 | 182.17g sorbitol in 1 l ddH20 |
| STC Buffer | 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2 | ||
| Calcium chloride | Sigma, St Louis, USA | 429759 | |
| Tris-HCl pH 8.00 | Sigma, St Louis, USA | 10812846001 | |
| Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
| Trichoderma harzianum lysing enzymes | Sigma, St Louis, USA | L1412 | |
| Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
- Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
- Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
- Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
- Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
- Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
- Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
- Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
- Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
- You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
- Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
- Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
- Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
- Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
- Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
- Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
- Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
- Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
- Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
- Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
- Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
- Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
- van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
- Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
- Sambrook, J., Green, M. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
- Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
- Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
- Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
- Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
- van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
- Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
- Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
- Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).
