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Genetics

CRISPR-Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन में फिलामेंटस Ascomycete व्याईला ओमानेन्सिस

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61367
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology, University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Summary

CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली एक आसान करने के लिए उपयोग जीनोम संपादक है कि मॉडल और गैर मॉडल प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है । यहां हम इस प्रणाली का एक प्रोटीन-आधारित संस्करण प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग एक गैर-मॉडल फिलामेंटस असोमीसिटस कवक के संभोग जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन पेश करने के लिए किया गया था।

Abstract

CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली एक आणविक उपकरण है कि मॉडल और गैर मॉडल प्रजातियों के जीनोम में एक जैसे सटीक परिवर्तन शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तकनीक का उपयोग विभिन्न प्रकार के जीनोम संपादन दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है, जीन नॉकआउट और नॉकपिन से लेकर लक्षित स्थान पर कुछ न्यूक्लियोटाइड की शुरूआत जैसे अधिक विशिष्ट परिवर्तनों तक। जीनोम संपादन का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें जीन का आंशिक कार्यात्मक लक्षण वर्णन, ट्रांसजेनिक जीवों का उत्पादन और नैदानिक उपकरणों का विकास शामिल है। पहले से उपलब्ध जीन संपादन रणनीतियों की तुलना में, CRISPR-Cas9 प्रणाली को नई प्रजातियों में स्थापित करने के लिए आसान दिखाया गया है और उच्च दक्षता और विशिष्टता समेटे हुए है । इसका प्राथमिक कारण यह है कि संपादन उपकरण जीन या ब्याज के अनुक्रम को लक्षित करने के लिए आरएनए अणु का उपयोग करता है, जिससे लक्ष्य अणु डिजाइन सीधा हो जाता है, यह देखते हुए कि मानक आधार बांधना नियमों का दोहन किया जा सकता है । अन्य जीनोम संपादन प्रणालियों के समान, CRISPR-Cas9-आधारित तरीकों के लिए कुशल और प्रभावी परिवर्तन प्रोटोकॉल के साथ-साथ लक्षित आरएनए और डीएनए अणुओं के डिजाइन के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले अनुक्रम डेटा तक पहुंच की भी आवश्यकता होती है। 2013 में इस प्रणाली की शुरुआत के बाद से, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार की मॉडल प्रजातियों को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर करने के लिए किया गया है, जिनमें सैकरोमाइसेस सेरेविसिया, अरेबिडोप्सिस थैलियाना, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और मस्कुलस शामिलहैं। इसके बाद, गैर मॉडल प्रजातियों पर काम कर रहे शोधकर्ताओं ने प्रणाली का लाभ उठाया है और यह कवक में माध्यमिक चयापचय के रूप में विविध प्रक्रियाओं में शामिल जीन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया, सूत्रकृमि विकास और पौधों में रोग प्रतिरोध, कई अंय लोगों के बीच । नीचे विस्तृत यह प्रोटोकॉल हनिएला ओमानेन्सिसके यौन चक्र में शामिल जीन के ट्रंकेशन के लिए CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रोटोकॉल के उपयोग का वर्णन करता है, जो सेराटोसिस्टिडासी परिवार से संबंधित एक फिलामेंटस एस्टाइसिटेसिट फंगस है।

Introduction

उच्च गुणवत्ता, पूरी तरह से इकट्ठे जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम की बढ़ती उपलब्धता ने जीवों की एक सरणी में विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की क्षमता में काफी सुधार किया है1। यह मॉडल प्रजातियों के साथ-साथ गैर-मॉडल प्रजातियों के बारे में सच है, जिनमें से कई जैविक प्रक्रियाओं की अधिक विविध समझ प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार के डेटा का उपयोग जीन खोज, ट्रांसक्रिप्शन नेटवर्क की पहचान और पूरे जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम दोनों तुलनाओं के लिए किया जा सकता है, जिनमें से प्रत्येक अपने स्वयं के अनुप्रयोगों के साथ आता है। हालांकि, जबकि जीन की भविष्यवाणी की जा रही है, एनोटेटेड और ख्यात रूप से पहले कभी नहीं देखी गई दर पर विभिन्न कार्यात्मक रास्तों से जुड़ा हुआ है, इन जीनों का कार्यात्मक लक्षण वर्णन पीछे रहता है, जो कई प्रजातियों के लिए उपलब्ध आणविक टूलकिट द्वारा सीमित है । यह विशेष रूप से गैर-मॉडल प्रजातियों के लिए मामला है, जहां जीनोमिक डेटा उत्पन्न करना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन जहां आगे आणविक लक्षण वर्णन असंभव1,,2के पास रहा है।

फंगल प्रजातियों के जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण विशिष्ट जीन के कार्यों का आंशिक लक्षण वर्णन या तो नॉकआउट या नॉकइन प्रयोगों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जिसके बाद उत्परिवर्ती उपभेदों का फेनोटाइपिक विश्लेषणहोसकता है । ये दोनों प्रणालियां पूरी तरह से जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल की उपलब्धता पर भरोसा करती हैं, जिनमें न्यूनतम, एक परिवर्तन प्रणाली और एक आनुवंशिक संपादन प्रणाली शामिल है । कई तरह के परिवर्तन प्रणालियां हैं जिन्हें विभिन्न प्रकार के फिलामेंटल कवक4में विकसित किया गया है । बायोलिस्टिक्स और इलेक्ट्रोपॉर्जेशन पर भरोसा करने वाले भौतिक प्रणालियों को क्रमशः ट्राइकोडर्मा हर्ज़ियानम5 और एस्परगिलस नाइजर6में विकसित किया गया है। न्यूरोस्पोरा क्रैसा7में कैल्शियम क्लोराइड या लिथियम एसीटेट जैसे रसायनों का उपयोग करने वाली प्रणालियां विकसित की गई हैं । अंत में, परिवर्तन के लिए एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस के उपयोग पर भरोसा करने वाली जैविक प्रणालियों का सफलतापूर्वक सेराटोसिस्टिस एल्बिफंडस8में उपयोग किया गया है।

विभिन्न परिवर्तन प्रोटोकॉल की उपलब्धता के विपरीत, जीनोम संपादन प्रणाली कम प्रचुर मात्रा में हैं। फिलामेंटस कवक में किए गए कई पारंपरिक कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रयोगों ने जीनोम3में लक्ष्य क्षेत्र या जीन के लिए होमोलॉजी के क्षेत्रों द्वारा घिरे एक चुनिंदा मार्कर नॉकआउट निर्माण का उपयोग किया। विधि होमोलॉजी निर्देशित (एचआर) डीएनए मरम्मत पर निर्भर करती है, जो नॉकआउट निर्माण और ब्याज के क्षेत्र के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन की सुविधा देती है। इस पुनर्संयोजन घटना के परिणामस्वरूप चयनित मार्कर के अनुक्रम के साथ ब्याज के जीन का प्रतिस्थापन होता है। दुर्भाग्य से, जबकि यह कई प्रजातियों में सफल रहा, जिसमें सेर्कोस्पोरा निकोटियाना10, एस्परगिलस फ्यूमिगेटस11 और ग्रोसमैनिया क्लैविगेरा12शामिल हैं, तो विभिन्न कवक प्रजातियों में यह एक अक्षम और कभी-कभी अनुपयोगी प्रोटोकॉलबनारहा है।

अन्य जीनोम संपादन प्रणालियों, जिनमें जिंक-फिंगर न्यूक्लियस (जेडएफएन) और ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर जैसे प्रभावक नाभिक (टैलेन्स) का उपयोग करना शामिल है, ने पुरानी प्रणालियों पर एक महान सुधार का प्रतिनिधित्व किया, विशेष रूप से विशिष्ट और लक्षित परिवर्तन करने के लिए उनकी क्षमताओं को देखतेहुए 13। जेडएफएन और टैलेन्स दोनों में एक नाभिक प्रोटीन और एक प्रोटीन शामिल है जो विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड दृश्यों को पहचानने में सक्षम है13. मान्यता पर, नाभिक एक डबल फंसे डीएनए ब्रेक को प्रेरित करता है जो विशिष्ट उत्परिवर्तनों की शुरुआत को सुविधाजनक बना सकता है। जीनोम परिवर्तन लाने के लिए, न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पहचानने वाले प्रोटीन क्षेत्र को प्रत्येक प्रयोग के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए जाने की आवश्यकता है । प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन पर इस निर्भरता के कारण प्रत्येक नॉकआउट या नॉकइन प्रयोग के लिए लक्षित अणुओं का मार्गदर्शन करने के लिए कठिन और श्रम गहन14,,15है। इन चुनौतियों का उदाहरण है, बहुत कुछ फिलामेंटस कवक इन प्रणालियों का उपयोग कर जीनोम संपादन के अधीन किया गया है । एक उदाहरण TALENs आधारित प्रणाली है कि चावल विस्फोट कवक, मैग्नापोर्टे ओरिज़ा16में विकसित किया गया था ।

यकीनन जीनोम संपादन के क्षेत्र में सबसे बड़ी क्रांति CRISPR-Cas9 प्रणाली की खोज और बाद में विकास था- एक जीनोम संपादक जो आरएनए अणु द्वारा निर्देशित एक एंडोक्यूलाइज द्वारा ब्याज के अनुक्रम के लक्षित दरार के लिए अनुमति देता है। यह पहले से विकसित जीनोम संपादकों पर एक बड़ा सुधार था जो प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन पर भरोसा करते थे क्योंकि CRISPR-Cas9 प्रणाली का प्रमुख लाभ यह है कि यह रुचि के क्षेत्र को लक्षित करने के लिए आरएनए अणु पर निर्भर करता है । इसका मतलब यह है कि प्रणाली आरएनए-डीएनए इंटरैक्शन पर निर्भर करती है और इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग15को डिजाइन करते समय मानक आधार बांधना नियमों का फायदा उठाया जा सकता है।

यहां विस्तृत रूप में CRISPR-Cas9 प्रणाली में तीन प्रमुख घटक शामिल हैं: एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए), Cas9 एंजाइम और एक दाता डीएनए (dDNA)17। एसजीआरएनए 20 न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र से बना है जिसे प्रोटोस्पेसर के साथ - साथ एक लंबा क्षेत्र भी है जिसे पाड़18कहा जाता है । प्रोटोस्पेसर क्षेत्र का उपयोग संपादन प्रणाली को लक्षित क्षेत्र में मार्गदर्शन करने के लिए किया जाता है और इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग के लिए बदल दिया जाता है। पाड़ आरएनए का क्षेत्र है जो शारीरिक रूप से राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) बनाने के लिए Cas9 एंजाइम से बांधता है और इस प्रकार लक्षित क्षेत्र की परवाह किए बिना समान है। Cas9 एंजाइम शारीरिक रूप से लक्ष्य डीएनए के दरार की सुविधा, एक गाइड के रूप में प्रोटोस्पेसर का उपयोग करने के लिए इस क्षेत्र की पहचान19। अंतिम घटक, DDNA, वैकल्पिक है और इसका उपयोग विशेष प्रयोग20पर निर्भर करता है। DDNA अनुक्रम है कि विशेष रूप से क्षेत्र में डाला जाना चाहिए Cas9 एंजाइम द्वारा काटा जा रहा है बंदरगाहों, और इस प्रकार जीन knockin प्रयोगों के लिए आदर्श है, जहां एक जीन जीनोम में या जीन नॉकआउट प्रयोगों के लिए शुरू किया जा रहा है, जहां एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन या अंय चयनित मार्कर ब्याज के जीन की जगह शुरू किया जा रहा है । डीडीएनए को इस तरह से भी डिजाइन किया जा सकता है कि जीनोम में उपन्यास दृश्यों को पेश किया जा सके। उदाहरण के लिए, जैसा कि नीचे विस्तृत है, जब जीन ट्रंकेशन कीआवश्यकताहोती है तो ब्याज के जीन में किसी विशेष क्षेत्र में इन-फ्रेम स्टॉप कोडन पेश करना संभव है। अन्य अनुप्रयोगों में जीन के विशिष्ट क्षेत्रों का उत्परिवर्तन शामिल है, जैसे कि एक कार्यात्मक डोमेन22,या टैगिंग अनुक्रम23की शुरुआत।

CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ इसकी बहुमुखी प्रतिभा24है । इस अनुकूलनशीलता का एक उदाहरण यह है कि Cas9 एंजाइम को मेजबान कोशिका में उसके तीन रूपों में से एक में पेश किया जा सकता है-डीएनए, आरएनए या प्रोटीन-विशेष परिवर्तन प्रणाली के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है । जब डीएनए रूप में पेश किया जाता है, तो cas9 जीन को अक्सर एक चुनिंदा मार्कर के साथ प्लाज्मिड पर शामिल किया जाता है, sgRNA व्यक्त करने के लिए एक कैसेट और, यदि आवश्यक हो, तो एक कैसेट dDNA अनुक्रम25को एन्कोडिंग करता है। इस प्रणाली का प्राथमिक लाभ यह है कि केवल एक ही निर्माण को सेल में बदलने की जरूरत है और सफल परिवर्तन यह सुनिश्चित करता है कि CRISRP-Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए सभी आवश्यक घटक मौजूद हैं। हालांकि, यह विधि मेजबान प्रजातियों के लिए अभिव्यक्ति प्रणाली की उपलब्धता पर निर्भर करती है। Cas9 के लिए सफलतापूर्वक डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए, यह उच्च स्तर पर व्यक्त करने की जरूरत है, और इस तरह, एक उपयुक्त और संभावित विशिष्ट विशिष्ट प्रमोटर की आवश्यकता है । गैर-मॉडल प्रजातियों के लिए जहां ऐसे प्रमोटर अभी तक विकसित नहीं हुए हैं, यह एक मुकर कारक हो सकता है और इस प्रकार आरएनए या प्रोटीन रूप में Cas9 को पेश करने की क्षमता अधिक आकर्षक विकल्प हो सकती है। सेल में आरएनए की शुरूआत अपनी चुनौतियों को लाती है-विशेष रूप से उस आरएनए में अस्थिर है और परिवर्तन प्रक्रिया से बच नहीं सकता है । इसके अलावा, जब डीएनए या आरएनए रूप में पेश किया जाता है, तो Cas9 जीन अनुक्रम को विशेष मेजबान प्रणाली17में उपयोग के लिए कोडन-अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन से cas9 जीन एक स्तनधारी मेजबान कोशिका में काम नहीं कर सकता है और एक cas9 जीन जिसे स्तनधारी कोशिका में उपयोग के लिए कोडन-अनुकूलित किया गया है, पौधे की कोशिका में काम नहीं कर सकता है। इन सभी चुनौतियों को Cas9 के प्रोटीन रूप का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, जिसे एसजीआरएनए के साथ मिलकर, आरएनपी में इकट्ठा किया जा सकता है और मेजबान सेल26,,27में तब्दील किया जा सकता है। यह प्रणाली किसी भी अंतर्जात अभिव्यक्ति प्रणाली या कोडन अनुकूलन पर भरोसा नहीं करती है और इस प्रकार अधिकांश गैर-मॉडल प्रजातियों में काम करना चाहिए। प्रोटीन आधारित प्रणाली का नुकसान यह है कि यह एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताहस्तांतरण जैसे डीएनए आधारित परिवर्तन प्रणालियों के साथ संगत नहीं है। इस प्रकार, प्रोटीन आधारित विधि के लिए काम करने के लिए, एक परिवर्तन प्रोटोकॉल जैसे कि प्रोटोप्लास्ट या बायोलिस्टिक्स पर भरोसा करते हैं, उपलब्ध होने की आवश्यकता है। इस आरएनपी आधारित प्रणाली का सफलतापूर्वक फिलामेंटस कवक, फ्यूसरियम ऑक्सीस्पोरम26 और म्यूकोर सर्कसेलाइड्स27में उपयोग किया गया है।

सेराटोसिस्टिडासी परिवार के सदस्य एंटिएला ओमानेन्सिस,एक महानगरीय कवक है जो अक्सर28के ताजा घायल वुडी पौधों पर पाया जाता है। जबकि इस प्रजाति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम डेटा उपलब्ध हैं28,,29,,30,कोई परिवर्तन या जीनोम संपादन प्रोटोकॉल विकसित नहीं किए गए हैं। आज तक, एच ओमानेंसिस पर शोध ने अपने यौन चक्र29,,31के अंतर्निहित आनुवंशिक घटकों पर ध्यान केंद्रित किया है। यह कवक एक विशिष्ट हेट्रोथेलिक यौन चक्र को प्रदर्शित करता है, जिसमें यौन प्रजनन विशेष रूप से MAT1-1 और MAT1-2 संभोग प्रकार31के अलग-थलग के बीच होता है। इसके विपरीत, बारीकी से संबंधित व्यतीला मोनोलीफॉर्मिस के MAT1-2 आइसोले स्वतंत्र यौन प्रजनन में सक्षम हैं और MAT1-1 साथी31की अनुपस्थिति में यौन चक्र को पूरा करते हैं। यौन क्षमताओं में यह अंतर कम से कम आंशिक रूप से, संभोग जीन, MAT1-2-7में एक बड़ा अंतर होने के कारण माना जाता है, जहां एच ओमानेंसिस पूरी लंबाई और बरकरार प्रतिलिपि बंदरगाहों, जबकि जीन गंभीर रूप से एच मोनोलीफॉर्मिस29, 31,में काट दियाजाताहै । यौन प्रजनन में इस जीन की भूमिका को और अधिक चित्रित करने के लिए, एच ओमानेन्सिस के MAT1-2-7 जीन को एच मोनिलिफॉर्मिस21में देखे गए ट्रंकेशन की नकल करने के लिए काट दिया गया था।

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के प्रोटीन आधारित संस्करण का उपयोग करके एच ओमानेंसिस के परिवर्तन और MAT1-2-7 जीन के ट्रंकेशन का विवरण दिया गया है । यह प्रोटोकॉल समरूप पुनर्संयोजन आधारित जीन प्रतिस्थापन और प्लाज्मिड आधारित CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन के दृष्टिकोण असफल होने के बाद विकसित किया गया था।

Protocol

1. SgRNA के डिजाइन और संश्लेषण

  1. संभावित प्रोटोस्पेसर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए जो एसजीआरएनए का हिस्सा बनेंगे, 5 'एनजीजी 3' तीन के लिए जीन-ऑफ-इंटरेस्ट के माध्यम से मैन्युअल रूप से खोज करें, जो भी कार्यक्रम का उपयोग किया जा रहा है, खोज फ़ंक्शन का उपयोग करें। इन तीनों को पाम दृश्यों के रूप में एनोटेट करें।
    नोट: विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं जो संभावित पाम और प्रोटोस्पेसर दृश्यों की खोज और एनोटेट करते हैं।
    1. पहचाने गए पाम दृश्यों में से प्रत्येक के 20 बीपी अपस्ट्रीम का चयन करें और इन दृश्यों को संभावित प्रोटोस्पेपर्स के रूप में एनोटेट करें।
  2. एकल प्रोटोस्पेसर पर निर्णय लेने के लिए, निम्न गुणवत्ता वाले दृश्यों को त्यागने के लिए निम्नलिखित फ़िल्टरिंग चरण करें।
    1. संभावित प्रोटोस्पेपर्स की विशिष्टता के लिए परीक्षण करने के लिए, पाम अनुक्रम और प्रोटोस्पेज़र को एक ही अनुक्रम में मिलाएं और इसे पूरे जीनोम के खिलाफ ब्लेस्टेन क्वेरी के रूप में उपयोग करें। लक्ष्य क्षेत्र(चित्रा 1 ए)के अलावा जीनोम में किसी भी क्षेत्र में समानता दिखाने वाले किसी भी प्रोटोपेपर को त्यागें।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरएनए अणु Cas9 एंजाइम के लिए बाध्यकारी के लिए सही 3 डी संरचना में गुना होगा, प्रोटोस्पेसर और Cas9 एंजाइम के लिए विशिष्ट पाड़ अनुक्रम सहित एक संयुक्त अनुक्रम बनाएगा।
      1. प्रत्येक संयुक्त प्रोटोस्पेसर-पाड़ दृश्यों को आरएनए माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी उपकरण(सामग्री की तालिका)में अपलोड करें।
      2. न्यूनतम मुक्त ऊर्जा और सेंट्रोइड माध्यमिक संरचनाओं की तुलना करके परिणामों का विश्लेषण करें।
        नोट: आदर्श प्रोटोस्पेसर उम्मीदवारों के पास समान न्यूनतम मुक्त ऊर्जा और सेंट्रोइड माध्यमिक संरचनाएं होंगी। दोनों माध्यमिक संरचनाओं में तीन स्टेम लूप शामिल होने चाहिए, जो पांच रिंग संरचनाओं द्वारा बाधित होते हैं। संरचनाओं को प्रोटोस्पेसर(चित्रा 1 B)का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र को छोड़कर, पूरी संरचना में उच्च बाध्यकारी संभावनाओं (लाल रंग में इंगित) का भी प्रदर्शन करना चाहिए। वास्तविक ऊर्जा मूल्य प्रासंगिक नहीं हैं ।
    3. उन लोगों में से अंतिम उम्मीदवार चुनें जिन्होंने लक्षित किए जा रहे विशिष्ट क्षेत्र के निकटतम उम्मीदवार का चयन करके उपरोक्त फ़िल्टरिंग चरणों को पारित किया था।
  3. एक एकल आरएनए अणु के रूप में SgRNA संश्लेषण के लिए, विशेष Cas9 एंजाइम के साथ संगत एक sgRNA संश्लेषण किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें जिसका उपयोग किया जाएगा (उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीनसे Cas9)।
    नोट: निम्नलिखित चरण इस्तेमाल किए गए sgRNA संश्लेषण किट पर निर्भर हो सकते हैं। इस घटना में कि एक अलग किट का उपयोग किया जाता है, निर्माता के निर्देशों का पालन करें। वैकल्पिक रूप से, SgRNA पूर्व संश्लेषित आदेश दिया जा सकता है । आरएनए के साथ काम करते समय, नाभिक मुक्त अभिकर् ता और डिस्पोजेबल का उपयोग करें।
    1. यदि ऊपर चरण 1.3 में चुना गया 20 बीपी प्रोटोस्पेसर 5 के अंत में जी को बंदरगाह नहीं करता है, तो इस क्षेत्र में एक जी जोड़ें।
    2. लक्ष्य अनुक्रम के 5 ' अंत में T7 प्रमोटर अनुक्रम जोड़ें । यह अनुक्रम मानक है और 5 'TTCATACGACTCACTATAG 3'।
    3. लक्ष्य अनुक्रम के 3 'अंत में 14 एनटी ओवरलैप अनुक्रम जोड़ें। यह अनुक्रम किट-विशिष्ट है और यहां उपयोग की जाने वाली किट के लिए 5 'जीटीटीग्गाक्टागा 3' है।
    4. परिणामस्वरूप खंड 5 ' TTCTAATACGACTCACTATAG (एन)20 GTTTTAGAGCTAGA, के साथ (एन)20 चयनित प्रोटोपेसर presynthesized(सामग्री की तालिका) काप्रतिनिधित्व करने का आदेश ।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल(सामग्री की तालिका) केअनुसार, कमरे के तापमान पर निम्नलिखित अभिकर्षकों को जोड़ते हैं: 2 माइक्रोन पानी, प्रतिक्रिया बफर का 10μL, संश्लेषित प्रोटोस्पेसर अनुक्रम का 5 माइक्रोन, 0.1 एम डीटीटी का 1 माइक्रोन और ट्रांसक्रिप्टेस एंजाइम का 2 माइक्रोन।
    6. इस समाधान को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और बर्फ में स्थानांतरित करें।
    7. पानी के 30 माइक्रोन और DNase मैं के 2 माइक्रोन जोड़ें, मिश्रण और एक और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    8. 2% एगर उठे जेल पर परिणामी एसजीआरएनए की कल्पना करें।

2. SgRNA की इन विट्रो क्लीवेज क्षमता का परीक्षण

नोट: यह कदम वैकल्पिक है, लेकिन सिफारिश की है।

  1. डिजाइन प्राइमर जो साइट के अनुक्रम को शरण देने वाले एक टुकड़े को बढ़ाएंगे जो चुने हुए SgRNA एक मानक डीएनए बहुलक का उपयोग करके क्षेत्र को लक्षित और बढ़ा देगा।
    नोट: यदि संभव हो, तो प्राइमर को इस तरह से डिजाइन करें कि लक्ष्य स्थल पर दरार बहुत अलग आकारों के दो टुकड़े पैदा करेगी जिन्हें आसानी से एक मानक एगर उठे जेल पर एक दूसरे से अलग किया जा सकता है।
  2. संयुक्त sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) को इकट्ठा करके एक समाधान को शामिल किया गया है जिसमें 30 एनएम एसजीआरएनए शामिल है, जिसमें ऊपर संश्लेषित, 30 एनएम कैस 9 प्रोटीन, 10x रिएक्शन बफर और 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर पानी का 10 माइक्रोल शामिल है।
  3. 3 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए RNP समाधान में लक्ष्य क्षेत्र के पीसीआर उत्पाद को जोड़कर SgRNA की दरार क्षमता का परीक्षण करें।
    1. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान इनक्यूबेट करें।
    2. दरार प्रतिक्रिया को रोकने और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए समाधान के लिए प्रोटीन के 3 माइक्रोन और 2 माइक्रोन आरनैस जोड़ें।
    3. 2% एगर उठे जेल पर परिणामस्वरूप डीएनए के टुकड़ों की कल्पना करें। यदि जेल पर अपेक्षित आकार के दो बैंड देखे जाते हैं तो एसजीआरएनए वीवो प्रयोग में उपयुक्त है।

3. DDNA के डिजाइन और संश्लेषण

  1. डीडीएनए को तीन क्षेत्रों-5 और 3 क्षेत्रों के शामिल होने के लिए डिजाइन करें, जिसमें जीनोमिक क्षेत्र को लक्षित किया जा रहा है और एक मध्य क्षेत्र एक चुनिंदा मार्कर(सामग्री की तालिका, चित्र 2)को शरण देता है ।
    नोट: अन्य विशिष्ट दृश्यों को भी इस चुनिंदा मार्कर में जोड़ा जा सकता है। इस विशेष प्रयोग के लिए, चयन योग्य मार्कर से ठीक पहले एक स्टॉप कॉडन अनुक्रम (5'टीजीए 3') जोड़ा गया था, जिससे जीन में एक इन-फ्रेम स्टॉप कोडन शुरू किया गया था। DDNA को प्रेसिनथेसाइज्ड ऑर्डर किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, DDNA को नीचे विस्तृत रूप में पीसीआर दृष्टिकोण को ओवरलैप करते हुए, स्टेपवाइज, ओवरलैप पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग करके परिलक्षित और इकट्ठा किया जा सकता है।
    1. 5' और 3 ' फ्लैंकिंग क्षेत्रों के लगभग 800 बीपी को बढ़ाने के लिए प्राइमर डिजाइन करें। 5 ' क्षेत्र के रिवर्स प्राइमर और 3 ' क्षेत्र के फॉरवर्ड प्राइमर के लिए चयन योग्य मार्कर के अनुक्रम के पूरक अनुक्रम के 20 एनटी जोड़ें ।
    2. डिजाइन प्राइमर जो चुनिंदा मार्कर को बढ़ाते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रवर्धित उत्पाद प्रतिरोध जीन के साथ-साथ एक प्रमोटर को ब्याज की प्रजातियों में काम करने के लिए जाना जाता है।
  2. एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक(सामग्री की तालिका) काउपयोग करना, तीन DDNA क्षेत्रों बढ़ाना । जीव के जीडीएनए से 5 ' और 3 ' क्षेत्रों को संपादित किया जा रहा है । एक प्रासंगिक स्रोत से चयनित मार्कर बढ़ाना।
    1. एक ही प्रतिक्रिया में, प्रवरीय मार्कर के साथ प्रवर्धित 5 ' क्षेत्र को मिलाएं और लंबी दूरी, उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक का उपयोग करके, पूरे क्षेत्र को बढ़ाता है।
    2. एक दूसरी एकल प्रतिक्रिया में, प्रवर्धित 3 ' क्षेत्र को चुनिंदा मार्कर के साथ मिलाएं और लंबी दूरी के उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करके, पूरे क्षेत्र को बढ़ाता है।
    3. अंत में, दो पूर्ववर्ती पीसीआर उत्पादों को एक ही प्रतिक्रिया में मिलाएं और पूरे DDNA अनुक्रम को लंबी दूरी, उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक के साथ बढ़ाएं।
    4. डीएनए के टुकड़े को 1% एगर उठे हुए जेल पर कल्पना करें। इस घटना में कि दो या अधिक टुकड़े उत्पादित होते हैं, जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके जेल से सही आकार के टुकड़े को शुद्ध करें।

4. प्रोटोप्लास्ट की निकासी

  1. कोनिडिया का उत्पादन करने के लिए, 1 सेमी x 1 सेमी माइसेलिया-कवर एगर ब्लॉक के साथ 500 एमएल फ्लास्क में ताजा 2% माल्ट एक्सट्रैक्ट शोरबा (एमईबी) के 200 एमएल टीका लगाते हैं।
    नोट: सभी कवक कोनिडिया का उत्पादन करने में सक्षम नहीं हैं। उस स्थिति में, माइसेलिया का भी उपयोग किया जा सकता है। यह आम तौर पर प्रोटोकॉल में आगे lysing एंजाइम की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होगी ।
    1. 24 - 48 घंटे के लिए 120 आरपीएम पर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में तरल संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस इनक्यूबेशन समय और तापमान एच omanensisके लिए अनुकूलित किया गया है । इसे अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    2. कोनिडिया की फसल के लिए; बाँझ प्रयोगशाला कपड़े (जैसे, मिराक्लोथ) की एक परत के माध्यम से तरल संस्कृति को फ़िल्टर करें, शंकुधारी निलंबन को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,220 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    3. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोनिडिया समाधान के 5 एमएल और पिपेट 10 माइक्रोन में कोनिडिया को फिर से र्इंसल करें और कवरस्लिप के साथ कवर करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 40x आवर्धन के तहत एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना करें कि केवल शंकुया बरामद किया गया है(चित्रा 3A)।
    4. 500 एमएल फ्लास्क में, पुनर्निरीब कोनिडिया की कुल मात्रा के साथ ताजा 1% एमईबी के 200 एमएल का टीका करें।
    5. 12 घंटे तक 120 आरपीएम पर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में तरल संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस इनक्यूबेशन समय एच ओमानेन्सिसके लिए अनुकूलित किया गया है । इसे अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    6. जर्मलिंग को फसल करने के लिए, तरल संस्कृति को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और सेंट्रलाइज में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,220 x ग्राम पर स्थानांतरित करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    7. 1 एम सोर्बिटोल के 10 एमएल तक में जर्मलिंग को फिर से रीसुस्ट करें।
    8. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर अंकुरित समाधान के पिपेट 10 माइक्रोन और एक कवरस्लिप के साथ कवर। यह सुनिश्चित करने के लिए 40x आवर्धन के तहत एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना करें कि केवल जर्मलिंग बरामद किए गए हैं(चित्रा 3 B)।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम सोर्बिटोल में जर्मलिंग स्टोर करें।
  2. युवा जर्मलिंग की कोशिका दीवारों को lyse करने और प्रोटोप्लास्ट जारी करने के लिए, एक बाँझ 50 एमएल फ्लास्क में विभिन्न सांद्रता पर 9 एमएल लिंगिंग एंजाइम में 1 एमएल का जर्मलिंग सस्पेंशन जोड़ें।
    नोट: विभिन्न एंजाइम सांद्रता और इनक्यूबेशन समय का उपयोग किया जाता है और तालिका 1में पाया जा सकता है । एंजाइमों और सांद्रता भी कवक के आधार पर भिन्न होने की संभावना है और प्रत्येक प्रजाति के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    1. 2 से 3 घंटे के लिए 80 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में बीजाणु-एंजाइम समाधान को इनक्यूबेट करें।
    2. बाँझ प्रयोगशाला कपड़े की एक परत के माध्यम से प्रोटोप्लास्ट समाधान को फ़िल्टर करें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,810 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा प्रोटोप्लास्ट एकत्र करें। सुपरनेट को त्याग दें।
      नोट: प्रोटोप्लास्ट सेल दीवारों के बिना कोशिकाएं हैं और इस प्रकार यांत्रिक व्यवधान के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। उन्हें ध्यान से संभालना सुनिश्चित करें, खासकर जब पाइपिंग करें।
    3. एसटीसी बफर (सामग्री की तालिका) के 200 माइक्रोन में प्रोटोप्लास्ट गोली को सावधानीपूर्वक फिरसे रीसस्ट करें।
    4. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रोटोप्लास्ट समाधान के पिपेट 10 माइक्रोन और एक कवरस्लिप के साथ कवर करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 40x आवर्धन के तहत एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना करें कि केवल प्रोटोप्लास्ट बरामद किए गए हैं(चित्रा 3 सी)।
    5. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना, उपरोक्त चरणों में उत्पन्न प्रोटोप्लास्ट की संख्या की गणना और गणना करें। प्रोटोप्लास्ट समाधान को लगभग 5 x 106 प्रोटोप्लास्ट वाले एलिकोट्स में पतला करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । एसटीसी बफर में -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटोप्लास्ट स्टोर करें।

5. प्रोटोप्लास्ट और खूंटी-सहायता परिवर्तन और ट्रांसफॉर्मेंट रिकवरी

  1. परिवर्तन शुरू करने के लिए, आरएनपी समाधान की एक मात्रा और DDNA टुकड़े के लगभग 6 माइक्रोग्राम के साथ लगभग 5 x 106 प्रोटोप्लास्ट गठबंधन करें।
    नोट: प्रोटोप्लास्ट यांत्रिक व्यवधान के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं। उन्हें ध्यान से संभालना सुनिश्चित करें, खासकर जब पाइपिंग करें।
    1. एक पिपेट का उपयोग करके, प्रोटोप्लास्ट समाधान पर एक ताजा तैयार 30% पीटीसी समाधान के 1 मिलीएल को धीरे-धीरे ड्रिप करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम एक संवेदनशील और बहुत महत्वपूर्ण कदम है। ताजा तैयार पीटीसी समाधान का उपयोग करना सुनिश्चित करें और कोशिका की सतह पर एक हाइड्रोफोबिक परत बनाने, धीरे-धीरे और समान रूप से कोशिकाओं पर समाधान छोड़ दें।
    2. प्रोटोप्लास्ट समाधान में ऑस्मोटिक कंट्रोल मीडियम (ओसीएम) के 5 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे और धीरे-धीरे यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान अच्छी तरह से मिलाया गया है।
    3. रात भर 80 आरपीएम पर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में प्रोटोप्लास्ट समाधान इनक्यूबेट।
  2. रूपांतरित आइसोले का चयन करने के लिए, समाधान को 5 खाली 60 मिमी संस्कृति प्लेटों में विभाजित करें।
    1. प्रत्येक संस्कृति प्लेट में 30 माइक्रोन/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी के साथ पूरक ओसीएम एगर के 10 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे प्रत्येक प्लेट को अच्छी तरह से मिलाने के लिए घुमाएं।
    2. आगर की पहली परत को 40 माइक्रोग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी के साथ पूरक ऑस्मोटिक कंट्रोल मीडियम एगर के 10 एमएल जोड़ने से पहले सेट करने की अनुमति दें ।
    3. आगर की दूसरी परत को 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को सेट और इनक्यूबेट करने की अनुमति दें जब तक कि एकल आइसोलेट को आगर की दोनों परतों के माध्यम से बढ़ते हुए देखा जा सकता है।
  3. सफलतापूर्वक रूपांतरित आइसोले को ठीक करने के लिए, 40 माइक्रोग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी के साथ पूरक आगर परत के माध्यम से विकास में सक्षम व्यक्तिगत आइसोले को स्थानांतरित करें ताजा माल्ट निकालने एगर (एमईए) प्लेटों को 50 माइक्रोग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी (एमईए-50) के साथ पूरक किया गया।
    1. 5 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ताजा संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें, विकास के लिए दैनिक जांच करें। इस मीडिया पर निरंतर विकास करने में सक्षम संस्कृतियों को सफलतापूर्वक बदल दिया गया है और आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

6. DDNA के एकीकरण और स्थिरता की पुष्टि

  1. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि DDNA को लक्षित क्षेत्र में जीनोम में एकीकृत किया गया है, डिजाइन प्राइमर जो भविष्यवाणी किए गए 5 ' और 3 ' डालने वाली साइटों(चित्रा 2)को फ्लैंक करते हैं।
    1. इन दो प्राइमर सेट और एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक का उपयोग कर दो पीसीआर प्रदर्शन करें। यदि पीसीआर अपेक्षित आकार और अनुक्रम के एम्प्लिकोन उपजते हैं, तो DDNA को सफलतापूर्वक लक्ष्य क्षेत्र में एकीकृत किया गया था। फिर, DDNA के स्थिर एकीकरण के लिए उत्परिवर्ती दाग का आकलन करें।
  2. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि DDNA को जीनोम में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया है और वनस्पति विकास के दौरान बनाए रखा जाएगा, एक मीडिया हस्तांतरण परीक्षण करें।
    1. विदेश मंत्रालय-50 माध्यम पर सक्रिय रूप से बढ़ते उत्परिवर्ती आइसोलेट से माईसेलियल-कवर एगर के एक ब्लॉक को लागू करने के लिए विदेश मंत्रालय माध्यम स्थानांतरित करें। 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. विदेश मंत्रालय माध्यम पर बढ़ रही आइसेलिया-कवर एगर के एक ब्लॉक को विदेश मंत्रालय-50 माध्यम में स्थानांतरित करें। 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. इस प्रक्रिया को दोहराएं, कम से कम चार राउंड के लिए पूरक से बिना लागू माध्यम तक सक्रिय रूप से बढ़ते मायसेलिया को स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि अलग विदेश मंत्रालय-५० माध्यम पर कई स्थानान्तरण के बाद निरंतर विकास करने में सक्षम है, dDNA स्थिर जीनोम में एकीकृत किया गया है और वनस्पति विकास के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है । उत्परिवर्ती दाग एकीकृत DDNA की केवल एक ही प्रति की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है।
  3. आदेश में पुष्टि करने के लिए कि dDNA एक ही स्थान पर जीनोम में एकीकृत किया गया है, एक दक्षिणी दाग विश्लेषण करते हैं ।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार हिनडीआईआई और इकोआरआई प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके प्रत्येक उत्परिवर्ती तनाव से जीडीएनए के कुल 30 माइक्रोन को पचाएं।
      नोट: जबकि प्रतिबंध एंजाइम का चुनाव शोधकर्ता पर निर्भर है, यह सुनिश्चित करें कि प्रतिबंध एंजाइम की मान्यता साइट DDNA अनुक्रम में मौजूद नहीं है।
    2. पचाने वाले जीडीएनए को 0.75% एगर उठे हुए जेल पर अलग करें और मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके डीएनए को नायलॉन झिल्ली पर स्थानांतरित करें32.
    3. DDNA अनुक्रम को लक्षित करने वाली जांच का उपयोग करके संकरण के लिए झिल्ली के अधीन।
      1. डीडीएनए के एक छोटे (300 बीपी) क्षेत्र को बढ़ाने के लिए प्राइमर डिजाइन करें।
      2. इन प्राइमर का उपयोग करके, पीसीआर डीआईजी लेबलिंग मिश्रण का उपयोग करके जांच का संश्लेषण करें।
      3. मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके झिल्ली संकरण, उपचार और दृश्यीकरण के लिए नए संश्लेषित जांच का उपयोग करें32। यदि प्रत्येक लेन में केवल एक ही बैंड देखा जाता है, तो डीडीएनए जीनोम में केवल एक ही स्थान पर मौजूद है। उत्परिवर्ती तनाव अब आगे फेनोटाइपिक विश्लेषण और कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

7. उत्परिवर्ती उपभेदों का फेनोटाइपिक विश्लेषण

  1. यह निर्धारित करने के लिए संभोग प्रयोगों का संचालन करें कि क्या मैट जीन के व्यवधान का अध्ययन किए जा रहे कवक की यौन क्षमताओं पर प्रभाव पड़ा है।
    नोट: यह कदम विशेष जीन और प्रजातियों का अध्ययन किया जा रहा है पर निर्भर है । इस मामले में, जीन को लक्षित किया जा रहा है यौन प्रजनन में शामिल माना जाता है और इस तरह संभोग परीक्षण आयोजित किए गए । यदि जीन सोचा था, उदाहरण के लिए, अलैंगिक प्रजनन में शामिल होने के लिए, तो शंकु उत्पादन की तरह कुछ मापा जा सकता है ।
    1. उत्परिवर्ती तनाव की विषमता क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए, एक उत्परिवर्ती तनाव के साथ-साथ विपरीत संभोग प्रकार के तनाव के साथ ताजा विदेश मंत्रालय माध्यम को सह-टीका करें। एच ओमानेंसिसके मामले में, प्लेटों के ढक्कन बंद रखें, लेकिन 7 दिनों तक कमरे के तापमान पर सील और इनक्यूबेट न करें। यौन संरचनाओं के उत्पादन के लिए नेत्रहीन आकलन।
    2. उत्परिवर्ती तनाव की होमोथैलिक क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए, एक उत्परिवर्ती तनाव के साथ ताजा विदेश मंत्रालय माध्यम टीका। एच ओमानेंसिसके मामले में, प्लेटों के ढक्कन बंद रखें, लेकिन 7 दिनों तक कमरे के तापमान पर सील और इनक्यूबेट न करें। यौन संरचनाओं के उत्पादन के लिए नेत्रहीन आकलन।
  2. यह निर्धारित करने के लिए विकास दर प्रयोगों का संचालन करें कि क्या मैट जीन के व्यवधान का अध्ययन किए जा रहे कवक की विकास दर पर प्रभाव पड़ा है ।
    1. एगर में एक बड़े, बाँझ पिपेट टिप के पीछे की ओर डालने के द्वारा उत्परिवर्ती और वाइल्डटाइप उपभेदों की संस्कृतियों की सक्रिय रूप से बढ़ती बढ़त से mycelial कवर एगर प्लग बनाएं।
    2. इन आगर प्लग के साथ ताजा विदेश मंत्रालय माध्यम टीका। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक संस्कृति प्रकार के अनुसार कम से कम तीन प्रतिकृति बनाई जाती है।
    3. 20 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 3 दिनों के बाद, दो लंबवत व्यास पर वृद्धि को मापने।
    4. वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती उपभेदों से डेटा की तुलना करें।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल ने गैर-मॉडल अकोमीसेस्ट, एच ओमानेंसिससे संभोग जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन की शुरुआत की सुविधा प्रदान की । इस प्रक्रिया में CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के एक संस्करण का उपयोग किया गया और इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक उच्च गुणवत्ता वाले sgRNA का डिजाइन और संश्लेषण है। चित्रा 1 से पता चलता है कि कैसे इस अणु को इस तरह से डिजाइन किया गया था कि यह ए) विशेष रूप से ब्याज के जीन को लक्षित करता है और जीनोम और बी में अन्य क्षेत्रों में थोड़ी समानता दिखाता है) Cas9 प्रोटीन के साथ बांधने के लिए सही ढंग से सिलवटों । SgRNA भी प्रभावी ढंग से लक्ष्य क्षेत्र cleaving करने में सक्षम होना चाहिए । लक्ष्य क्षेत्र के दरार को लक्षित करने और अनुमति देने के लिए SgRNA की क्षमता विट्रो मेंआयोजित की गई थी, जो अपेक्षित आकार के दो उत्पादों को जन्म दे रही थी।

एक बार सफल परिवर्तन हो जाने के बाद, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि DDNA केवल एक बार और अपेक्षित स्थान पर जीनोम में एकीकृत हो गया है। चित्रा 2 पीसीआर प्राइमर के डिजाइन को दिखाता है जो प्रविष्टि साइटों को लक्षित करता है, जिसका उपयोग सही एकीकरण साइट के लिए संभावित ट्रांसफॉर्मेंट को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। 5' और 3 ' प्रविष्टि साइटों को पार्श्व करने वाले प्राइमर डिजाइन करके, प्रवर्धन तभी संभव है जब DDNA सही क्षेत्र में डाला जाता है। चित्रा 4 दिखाता है कि समय से पहले बंद codon MAT1-2-7 जीन में सही पढ़ने के फ्रेम में पेश किया गया था, यह सुनिश्चित करना है कि जीन एच मोनोलीफॉर्मिसके समान तरीके से काट दिया जाएगा । इसके अलावा, दक्षिणी दाग विश्लेषण से पता चला है कि DDNA निर्माण केवल जीनोम में एक ही साइट पर एकीकृत किया गया था ।

उत्परिवर्ती उपभेदों के फेनोटाइपिक विश्लेषण पर प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि की गई थी। MAT1-2-7 व्यवधान प्रयोग के मामले में, दो स्वतंत्र उत्परिवर्ती उपभेदों विकसित किए गए थे। दोनों आइसोलेट्स में, वनस्पति रेडियल विकास दर काफी कम हो गई थी, जो उपन्यास संभोग जीन(चित्र 5)के pleiotropic प्रभाव का सुझाव देती है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती आइसोले एक यौन चक्र को पूरा करने में असमर्थ थे, केवल अपरिपक्व यौन संरचनाओं का उत्पादन करते थे जो यौन बीजाणुओं(चित्र 5)का उत्पादन नहीं करते थे। यह वाइल्डटाइप आइसोले के विपरीत था, जिसने इनक्यूबेशन(चित्रा 5)के कुछ दिनों के भीतर पूरे यौन चक्र को पूरा किया।

Figure 1
चित्रा 1: एक उपयुक्त sgRNA उम्मीदवार का चयन।
(क)एक उपयुक्त एसजीआरएनए में केवल जीनोम के लक्षित क्षेत्र में समानता होगी (मैट लोकस अनुक्रम द्वारा इंगित इस मामले में)। (ख)एक उपयुक्त एसजीआरएनए में समान न्यूनतम मुक्त ऊर्जा और सेंट्रोइड माध्यमिक संरचनाएं होंगी, जिसमें प्राथमिक चरण लूप में तीन स्टेम लूप और पांच छल्ले होंगे । इसके अलावा, संरचना के बहुमत में उच्च बाध्यकारी संभावनाएं होंगी (गहरे नारंगी और लाल रंग में इंगित) जबकि प्रोटोस्पेसर क्षेत्र (काले त्रिकोण द्वारा इंगित) में कम बाध्यकारी संभावनाओं को देखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डिजाइन, प्रवर्धन और DDNA की विधानसभा।
पहले और दूसरे प्राइमर जोड़े (पीपी 1 और पीपी 2) का उपयोग ब्याज के जीन के लगभग 800 बीपी अपस्ट्रीम (5') और 800 बीपी डाउनस्ट्रीम (3') को बढ़ाना है। PP1 के रिवर्स प्राइमर और PP2 के फॉरवर्ड प्राइमर में होमोलॉजी के क्षेत्र हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट शामिल हैं। तीसरी प्राइमर जोड़ी पूरे हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट को बढ़ाती है। एक स्टेपवाइज तरीके से, विभिन्न एम्प्लिकॉन को तब तक इकट्ठा किया जाता है जब तक कि पूरे डीडीएनए, जिसमें 5'क्षेत्र, हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट और 3' क्षेत्र शामिल नहीं होते, तब तक इकट्ठा होते हैं। जब सेल में तब्दील हो जाता है, तो DDNA को उस क्षेत्र में फिर से संयोजन करना चाहिए जहां Cas9 एंजाइम को काटने का निर्देश दिया गया होगा, जिससे ब्याज के जीन को हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट के साथ प्रतिस्थापित किया जा सके । PP4 और PP5 का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि DDNA को उचित स्थान पर जीनोम में सही ढंग से डाला गया है या नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: प्रोटोप्लास्ट निष्कर्षण प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न सेल प्रकार महत्वपूर्ण हैं।
(क)कोनिडिया का उपयोग प्रोटोकॉल के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में किया जाता है। इन कोनिडिया को अंकुरित होने और बढ़ने की अनुमति है जब तक कि वे(बी)युवा अंकुरित न हों। युवा जर्मलिंग के आदर्श विकास चरण को दो काले तीरों द्वारा इंगित किया जाता है। अन्य माइसेलियल किस्में(बी)पर देखा गिरावट के लिए भी परिपक्व हैं और इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल का अंतिम चरण(सी)गोल प्रोटोप्लास्ट की रिहाई है, जो काले, बिंदीदार हलकों द्वारा इंगित किया गया है। इन कोशिकाओं में अब सेल की दीवारें नहीं हैं और इस प्रकार यांत्रिक व्यवधान के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एच ओमानेंसिसके MAT1-2-7 जीन में टीजीए स्टॉप कोडन का सफल एकीकरण ।
(क)पूर्ण लंबाई एच ओमानेन्सिस MAT1-2-7 जीन, sgRNA लक्ष्य साइट के साथ हरे तीर द्वारा संकेत दिया । (ख) एच ओमानेंसिस MAT1-2-7 जीन के भीतर sgRNA लक्ष्य स्थल की एक बढ़ाया योजनाबद्ध । (ग)डीडीएनए के एक क्षेत्र की एक आवर्धन योजनाबद्ध एच ओमानेंसिसके MAT1-2-7 जीन के मुताबिक़ हथियारों के अनुरूप कोडन को दिखाता है । (घ) सेंगर अनुक्रम क्रोमाटोग्राम MAT1-2-7 जीन में स्टॉप कोडन के सफल एकीकरण का संकेत देता है । विल्सन एट अल से संशोधित २०२०21। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: (ए) वाइल्डटाइप आइस्टिक्स और (बी) उत्परिवर्ती आइसोलेट के बीच फेनोटाइपिक अंतर।
प्रत्येक पैनल में पहली तीन छवियां दो अलग प्रकार की यौन क्षमताओं में अंतर दिखाती हैं। जबकि वाइल्डटाइप यौन प्रजनन के दौरान परिपक्व अकोमाता को अलग करता है, आस्कोमेटल गर्दन के सुझावों से बीजाणुओं के विसर्जन के साथ पूरा होता है, उत्परिवर्ती आइसोले केवल अपरिपक्व यौन संरचनाएं बनाते हैं जो किसी भी यौन बीजाणुओं का उत्पादन नहीं करते हैं। प्रत्येक पैनल में चौथी छवि विकास दर और दो अलग प्रकार के आकृति विज्ञान में अंतर से पता चलता है । जबकि वाइल्डटाइप आइसोर्ट बहुत तेजी से बढ़ता है और अधिक हवाई माइसेलिया के साथ, उत्परिवर्ती धीमी दिखाता है और आगर के भीतर जलमग्न हो जाता है। विल्सन एट अल से संशोधित २०२०21। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रतिक्रिया एंजाइम एकाग्रता दुर्गति का समय
एक 1.250 मिलीग्राम/एमएल 180 मिनट
बी 1.875 मिलीग्राम/एमएल 180 मिनट
सी 2.500 मिलीग्राम/एमएल 150 मिनट
D 3.750 मिलीग्राम/एमएल 150 मिनट
ई 4.375 मिलीग्राम/एमएल 120 मिनट
F 5.000 मिलीग्राम/एमएल 120 मिनट

तालिका 1: ट्राइकोडर्मा हरज़ियानम से lysing एंजाइमों के साथ अंकुरण/मायसेलिया समाधान का क्षरण। विभिन्न एंजाइम सांद्रता विभिन्न इनक्यूबेशन अवधियों के अनुरूप होती हैं, जिसमें कम सांद्रता के साथ लंबे समय तक ऊष्मायनों की आवश्यकता होती है।

Discussion

एच ओमानेंसिस के सफल परिवर्तन और MAT1-2-7 जीन के संपादन के लिए प्रोटोकॉल हाइग्रोमाइसिन बी21के प्रतिरोध के लिए एक जीन के साथ एक इन-फ्रेम समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करके प्रदर्शित किया गया था । यह CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के प्रोटीन आधारित संस्करण का उपयोग करके हासिल किया गया था । इस प्रयोग में एसडीएनए की एसजीआरएनए, पीसीआर आधारित असेंबली के इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और एच ओमानेन्सिस से निकाले गए प्रोटोप्लास्ट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cas9 एंजाइम के साथ इन दो न्यूक्लिक एसिड के सह-परिवर्तन को आवश्यक किया गया

कई अन्य आणविक उपकरणों की उपलब्धता पर भरोसा करने वाले अन्य प्रोटोकॉलों के विपरीत, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक प्रजातियों में उपयोग किया जा सकता है जिसके लिए आणविक टूलबॉक्स अभी भी काफी सीमित है21। प्रोटोकॉल केवल एक स्थापित परिवर्तन प्रणाली और NGS डेटा की उपलब्धता, अधिमानतः पूरे जीनोम अनुक्रम पर निर्भर करता है । जबकि एक प्रभावी परिवर्तन प्रणाली एक प्रजाति में कुछ अनुकूलन ले सकती है जिसके लिए यह उपलब्ध नहीं है, विभिन्न प्रजातियों के लिए कई अलग-अलग प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। इसके अलावा, जीनोम डेटा प्रजातियों के सबसे अस्पष्ट के लिए भी तेजी से उपलब्ध होता जा रहा है और अगर यह पहले से मौजूद नहीं है तो डी नोवो उत्पन्न करना आसान होता जा रहा है।

प्रोटोकॉल की लंबाई को देखते हुए, ऐसे कई कदम हैं जिन पर संशोधन शुरू किए जा सकते हैं और जहां समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। यह विशेष रूप से उन कदमों के बारे में सच है जिन्हें विशिष्ट प्रजातियां माना जाता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में कई इनक्यूबेशन कदम हैं जिन्हें प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए विशिष्ट तापमान पर और विशिष्ट लंबाई के लिए आयोजित किए जाने की आवश्यकता है। इस प्रकार इन कदमों के लिए प्रजातियों के विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता होगी । जहां संभव हो, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रजातियों (अंजीरमूत्र 1)में स्थानांतरित करने में सहायता करने के लिए विशेष कोशिकाओं या विकास चरणों के माइक्रोग्राफ प्रदान किए गए हैं। प्रोटोप्लास्ट को जारी करने के लिए कवक कोशिकाओं की कोशिका दीवारों को नीचा दिखाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों का प्रकार और एकाग्रता भी कवक की प्रजातियों के अध्ययन के लिए विशिष्ट होगी। इस प्रोटोकॉल में, केवल एक प्रकार का उपयोग एंजाइमों से किया जाता है, जबकि फ्यूसरियम वर्टिकिलिओइड्स33जैसी प्रजातियों में प्रोटोप्लास्ट के निष्कर्षण के लिए विभिन्न एंजाइम संयोजनों की आवश्यकता होती है। यह कदम पूरी तरह से सेल की दीवार के रासायनिक बनाने पर निर्भर करता है और इस प्रकार प्रजातियों के आधार पर एक प्रजाति पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।

यह विधि गैर-मॉडल प्रजातियों का अध्ययन करने वालों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अभिव्यक्ति प्रणाली पर कोई निर्भरता नहीं है। CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली की स्थापना की एक लोकप्रिय विधि Cas9 प्रोटीन, sgRNA के साथ ही एक या दो प्लाज्मिड है कि पसंद की कोशिकाओं में तब्दील हो रहे है से dDNA व्यक्त करने के लिए है । इस मामले में, Cas9 को एक प्रमोटर द्वारा व्यक्त करने की आवश्यकता है जो विशेष जीव में उच्च स्तर की अभिव्यक्ति में सक्षम है जिसका अध्ययन किया जा रहा है। सामान्य प्रमोटरों को फिलामेंटस कवक में उपयोग के लिए विकसित किया गया है और जब वे सभी प्रजातियों में संगत नहीं हैं, तो वे निम्न स्तर की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं और उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को व्यक्त करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, ये प्रमोटर अक्सर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के लिए अनुमति नहीं देते हैं और इस प्रकार Cas9 प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के प्रोटीन आधारित संस्करण का उपयोग करना इस सीमा पर काबू पा जाता है और SgRNA और dDNA को पहले से उत्पादित Cas9 एंजाइम के साथ सेल में सह-रूपांतरित करने की अनुमति देता है।

एच ओमानेंसिस में उपयोग के लिए इस प्रोटीन आधारित प्रणाली का विकास शास्त्रीय स्प्लिट मार्कर दृष्टिकोण के साथ-साथ प्लाज्मिड-आधारित CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करके जीनोम संपादन में कई असफल प्रयासों के बाद आया। जबकि क्षमता प्रजातियों से प्रजातियों में भिन्न होती है, विभाजन मार्कर दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग अल्टरनेरिया अल्टरनाटा34, 35,35और सी निकोटियाना36जैसी प्रजातियों में 100% दक्षता के साथ किया गया है। इसके विपरीत, 80 से अधिक स्वतंत्र परिवर्तन और एकीकरण की घटनाओं के बावजूद एच ओमानेंसिस में इस प्रणाली की दक्षता शून्य थी। इसी तरह, प्लाज्मिड आधारित CRISPR-Cas9 प्रणाली का सफलतापूर्वक ट्राइकोडर्मा रीज़ी (>93%)17 और पेनिसिलियम क्रायोजेनम (100%)37में उच्च क्षमता के साथ उपयोग किया गया है। यह फिर से एच ओमानेंसिसमें इस प्रणाली की उपयोगिता के विपरीत है । हाउसकीपिंग जीन से भविष्यवाणी की गई दो प्रजातियों-विशिष्ट प्रमोटरों सहित कई संभावित प्रमोटरों की कोशिश करने के बावजूद एच ओमानेंसिस में Cas9 प्रोटीन की पर्याप्त अभिव्यक्ति प्राप्य नहीं थी । इस प्रकार, इस प्रणाली का उपयोग बिल्कुल नहीं किया जा सकता है। CRISPR-Cas9 प्रणाली के प्रोटीन आधारित संस्करण का उपयोग करना, हालांकि, कई स्वतंत्र ट्रांसफॉर्मेंट मिले, जिनमें से दो सही स्थान में एकीकृत dDNA बंदरगाह । इसके अलावा, इस प्रयोग को केवल एक बार प्रयास किया गया था और सफल रहा- आगे इस प्रणाली का उपयोग करने में आसानी को दर्शाते हुए।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में इसका अनुकूलन और सेराटोसिस्टिडेसी की अन्य प्रजातियों में उपयोग शामिल है। इन प्रजातियों के लिए पहले से ही एनजीएस डेटा उपलब्ध है30,,38,,39 और उनकी मेजबान विशिष्टता40,विकास दर और उग्रता41 के संबंध में अध्ययन किए गए हैं। इन अध्ययनों को जीन है कि इन प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए सोचा जाता है के कार्यात्मक लक्षण वर्णन से मजबूत किया जा सकता है, अनुसंधान जो अब एक परिवर्तन और जीनोम संपादन प्रोटोकॉल की उपलब्धता के कारण संभव हो जाएगा ।

अंत में, गैर मॉडल प्रजातियों में महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं अंतर्निहित जीन में पूरी तरह से जांच आसान करने के लिए उपयोग जीनोम संपादन प्रोटोकॉल है कि व्यापक जैविक संसाधनों और आणविक टूलकिट के अस्तित्व पर भरोसा नहीं करते की उपलब्धता के लिए और अधिक सुलभ धंयवाद होता जा रहा है । गैर मॉडल प्रजातियों का अध्ययन आसान होता जा रहा है और मॉडल प्रजातियों में स्पष्ट किया गया है कि मानक जैविक प्रक्रियाओं से उपन्यास रास्तों और दिलचस्प विचलन की खोज के लिए अनुमति देगा ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को प्रिटोरिया विश्वविद्यालय, विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (डीएसटी)/नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) सेंटर ऑफ एक्सीलेंस इन ट्री हेल्थ बायोटेक्नोलॉजी (सीटीएचबी) द्वारा समर्थित किया गया था । इस परियोजना को प्रो बीडी विंगफील्ड के डीएसटी/एनआरएफ सरची चेयर द्वारा फंगल जीनोमिक्स (ग्रांट नंबर: ९८३५३) के साथ-साथ डॉ एएम विल्सन के एनआरएफ पीएचडी बर्सरी (१०८५४८) में अतिरिक्त समर्थन दिया गया था । अनुदान धारकों स्वीकार करते है कि राय, निष्कर्षों और निष्कर्ष या काम के इस टुकड़े में व्यक्त की सिफारिशों शोधकर्ताओं की है कि शोधकर्ताओं की है और यह कि धन निकायों इस संबंध में कोई भी दायित्व स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany

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References

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जेनेटिक्स अंक 160 जीनोम संपादन CRISPR-Cas9 आरएनपी परिवर्तनों यौन प्रजनन कवक व्यंटिएला ओमानेंसिस
CRISPR-Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन में फिलामेंटस Ascomycete <em>व्याईला ओमानेन्सिस</em>
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Wilson, A. M., Wingfield, B. D.… More

Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).

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