단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화
Summary
이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.
Abstract
다편성 지역 사회는 본질적으로 유비쿼터스, 그러나 단 세포 수준에서 그들의 상호 작용을 공부하는 것은 어렵습니다. 따라서, 현미경-시경법-두 세균성 병원체 간의 종 간 상호 작용을 관찰하기 위한 개발되었다. 이 방법의 사용은 운동성 그램 음성 병원체, 슈도모나스 아에루기노사 및 비 운동성 그램 양성 병원체, 황색포도상구균 사이의 상호 작용을 심문하는 것으로 여기에서 입증된다. 이 프로토콜은 단일 평면에서 세포를 유지하고 공간과 시간 모두에서 세균 성 행동을 시각화 할 수있는 커버 슬립과 아가로즈 패드 사이의 각 종을 공동 접종으로 구성됩니다.
더욱이, 여기에서 입증된 시간 경과 현미경 검사는 단배와 다른 종과의 공존에 있는 세균성 종 운동성의 변경을 포함하여 2개 이상의 세균성 종 사이에서 일어나는 초기 상호 작용을 시각화하는 데 이상적입니다. 현미경 설정에 있는 제한된 견본 공간의 특성 때문에, 이 프로토콜은 세포 인구가 너무 높으면 세균성 종 사이 나중에 상호 작용을 공부하기 위하여 보다 적게 적용됩니다. 그러나, 살아있는 세균세포를 화상 진찰하기 위한 염색의 사용, 형광 기자를 통한 유전자 또는 단백질 발현의 정량화, 단일 종 및 다종 실험 모두에서 세균세포 움직임을 추적하는 프로토콜의 몇몇 다른 응용이 있다.
Introduction
다편균 공동체는 자연에서 흔히 볼 수 있으며, 다양한 환경1,,2,,3 및 인간틈새4,5에걸쳐 있습니다. 인간 질환에서 가장 악명 높은 폴리균 감염 중 일부는 만성 폐쇄성 폐질환9,환기기 관련폐렴(10),및,유전질환 낭포성 섬유증(CF)11,12를가진 개인의 치과용 생물막6,만성 상처7,8,호흡기 감염등을포함한다. 이 감염은 수시로 다양한 미생물 종으로 이루어질 것입니다; 그러나, 그람 양성 박테리아 황색포도상구균과 그람 음성 박테리아 슈도모나스 aeruginosa 사이 상호 작용에 최근 초점이 나타났습니다. 이러한 유기체와 시험관 내 분석에 감염된 환자를 포함한 연구는 질병 진행, 미생물 생존, 독성, 신진 대사 및 항생제 감수성에 심오하고 예기치 않은 영향을 미칠 수있는 경쟁적이고 협력적인 상호 작용을 모두 보여줍니다 (Hotterbeekx 외. 201713 및 리몰리와 호프만 20193)에의해 자세히 검토됨).
감염 도중 종 간 상호 작용에 있는 증가하는 관심은 polymicrobial 지역 사회 행동을 공부하기 위한 다양한 방법을 산출했습니다. 전형적으로, 이러한 연구는 단일 문화와 공동 문화 사이의 현상적 차이를 조사하기 위해 플레이트 또는 국물 기반 의 학적 연구를 이용했다. 예를 들어, 고체 표면에 P. aeruginosa 및 S. 아우레우스를 응배하여 식민지 표현형, 안료 또는 다당류 생산14,,15,,16의성장 억제 또는 변화의 시각화를 허용했다. 혼합종 생물막은 생물학적 또는 무생물 표면에 뿐만 아니라 액체 배양에서 세균종을 배분할 뿐만 아니라 유전자 및 단백질발현(17,18)에18더하여 성장, 대사, 항생제 내성, 경쟁 및 생존가능성의 변화를 측정할 수 있게 되었다. 이러한 대량 문화 실험은 P. aeruginosa와 S. 아우레우스가 지역 사회 규모에 서로 영향을 미칠 수있는 방법에 대한 통찰력을 공개했지만, 그들은 단일 세포 수준에서 일어나는 상호 작용에 대한 중요한 질문에 대답 할 수 없습니다. 여기에서 제시된 방법은 시간이 지남에 따라 공동 문화 지역 사회 내의 단일 세포의 이동, 세포 생존 가능성 및 유전자 발현의 변화에 초점을 맞추어 종 간 상호 작용을 연구하기위한 접근 방식에 추가됩니다.
단일 세포 상호 작용은 세포의 대량 커뮤니티에서 일어나는 상호 작용과 크게 다를 수 있습니다. 단일 세포 분석을 통해, 지역 사회 내의 이질성은 세포의 공간 배치가 지역 사회 역학에 어떻게 영향을 미치는지 또는 유전자 및 단백질 발현 수준이 그룹의 개별 구성원 내에서 어떻게 변화하는지 연구하기 위하여 정량화될 수 있습니다. 추적 셀은 또한 여러 세대를 통해 시간이 지남에 따라 단일 세포가 이동하고 동작하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 세포 이동및 유전자 발현의 변화를 동시에 추적함으로써 유전자 변동과 해당 표현형 사이에 상관관계가 있을 수 있습니다. 단세포 수준에서 개별 세균성 종을 연구하기 위한 이전 프로토콜이 기술되었습니다. 이러한 연구는 한 평면에서 시간이 지남에 따라 살아있는 이미징 세포를 활용하고 세포 분열 및 항생제 감수성19,,20과같은 표현형을 관찰하는 데 유용하다. 추가 적인 살아있는 화상 진찰 현미경 검사는 단일 세균성,종21,22,,23의성장, 운동성, 표면 식민지 화 및 생물막 형성을 감시하기 위하여 이용되고 있습니다. 그러나, 이러한 연구는 단일 문화에서 박테리아의 생리학을 이해에 대 한 통찰력 이었지만, 공동 문화에서 시간이 지남에 따라 여러 박테리아 종의 단일 세포 행동을 관찰 하기 위한 실험은 제한.
여기서, 단일 종 화상 진찰에 사용된 이전 프로토콜은 P. aeruginosa와 S. 아우레우스사이 상호 작용을 공부하기 위하여 적응되었습니다. 이러한 유기체는 세포 형태에 기초하여 위상 대조하에서 분화될 수있다(P. aeruginosa는 바실리이고 S. 아우레우스는 cocci). 이 방법의 개발은 최근 S. 아우레우스(24)의 존재에서 P. aeruginosa의 이전에 설명되지 않은 운동성 행동의 시각화를가능하게했다. P. aeruginosa는 멀리서 S. 아우레우스를 감지하고 S. 아우레우스 세포의 클러스터를 향한 증가및 방향단 한세포 운동으로 반응할 수 있는 것으로 나타났습니다. P. aeruginosa 운동은 S. 아우레우스를 향한 운동형 IV pili(TFP)를 요구하는 것으로 나타났으며, 모발과 같은 프로젝션은 확장및 후퇴를 조정하여 경련 운동성(25)이라고 불리는 움직임을 생성한다.25
이 연구 결과는 종 사이 초기 상호 작용을 심문하기 위한 이 방법의 유용성을 보여줍니다. 그러나, 나중에 상호 작용 시간 점에 높은 세포 밀도에서 화상 진찰은 세포의 단 하나 층이 더 이상 확인할 수 없다는 것을 감안할 때 어렵습니다, 이는 주로 화상 진찰 후 분석 도중 문제점을 제기합니다. 이러한 제한을 감안할 때 이 방법은 나중에 상호 작용을 대표하는 더 높은 세포 밀도에서 기존의 거시적 분석 분석으로 후속 조치를 따를 수 있는 이전 상호 작용에 가장 적합합니다. 이 방법의 추가 제한은 저처리량 특성을 포함, 하나의 샘플은 한 번에 하나의 샘플과 현미경의 비용 때문에, 카메라, 및 환경 챔버. 더욱이, 형광 현미경 검사는 광독성 및 광표백 같이 세균성 세포에 리스크를 제기합니다, 그러므로 형광 심을 취득할 수 있는 주파수를 제한합니다. 마지막으로, 이 방법에 사용되는 아가로즈 패드는 환경의 변화에 매우 취약하여 조건이 올바르지 않으면 패드가 수축하거나 팽창하기 시작할 수 있다는 점을 감안할 때 온도 및 습도와 같은 조건에 대해 제어하는 것이 중요합니다. 마지막으로,이 방법은 호스트 환경을 모방하지 않지만, 그것은 다른 세균성 종이 표면에 반응하는 방법에 대한 단서를 제공합니다, 이는 환경 / 호스트 조건을 모방하도록 설계된 에세이에서 후속 할 수있다.
이 방법은 세포가 커버슬립과 아가로즈 패드 사이에 접종되어 세포를 표면으로 제한하는 단일 세포 움직임을 추적하는 이전 연구와 다릅니다. 이렇게 하면 단일 평면에서 시간이 지남에 따라 셀 추적이 가능합니다. 그러나, 세포가액체(26)에침수될 때 관찰된 일시적인 표면 참여의 주기를 제한한다. 아가로즈 패드 하에서 이미징 박테리아의 추가 이점은 P. aeruginosa 경련운동성을검사하는 데 고전적으로 사용되는 거시적 플레이트 기반 의 하위 표면 접종 분석은 모방한다는 것입니다. 이 분석에서 세균 세포는 페트리 접시의 바닥과 천 사이에 접종되어 이 현미경 프로토콜과 마찬가지로 접종 지점에서 바깥쪽으로 이동하는 동안 세포를 단일 평면에 보관합니다.
여기에 제시된 종간 상호 작용을 시각화하기 위한 시간 경과 현미경 프로토콜은 1) 세균성 시료 및 아가로즈 패드를 준비하는 것으로 구성되며, 2) 이미징 수집을 위한 현미경 설정을 선택하고 3) 이미징 후 분석. 세포 이동 및 추적의 상세한 시각화는 위상 대비에 의해 짧은 시간 간격으로 이미지를 수집하여 수행 할 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 또한 시간이 지남에 따라 세포 생존성 또는 유전자 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 아가로즈 패드에 생존 성염료를 첨가하여 형광 현미경 검사법을 용색하는 한 가지 예를 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 방법은 세포 추적 및 감시 세포 생존가능성을 포함하여 그밖 응용을 위한 수정을 가진 단세포 수준에서 세균성 종 상호 작용의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 다른 종과 공존하는 미생물의 단일 세포 행동을 연구하기위한 새로운 길을 열어줍니다. 특히, 이 프로토콜은 특히 운동성 표면 및 액체 관련 부속물을 모두 갖는 유?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 낭포성 섬유증 재단 포스트독 -교부 전환 상 LIMOLI18F5 (DHL), 낭포성 섬유증 재단 주니어 교수 모집 상 LIMOLI19R3 (DHL), NIH T32 교육 보조금 5T32HL007638-34 (ASP)의 자금 지원을 받았습니다. 제프리 마이스너, 김민수, 에단 가너에게 영상과 패드 제작에 대한 초기 프로토콜과 조언을 공유해 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
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