Kinetisk visualisering av Encellsinterspecies bakterieinteraktioner
Summary
Detta live-bakteriell cell imaging protokoll möjliggör visualisering av interaktioner mellan flera bakteriearter på encellsnivå över tiden. Time-lapse imaging möjliggör observation av varje bakterieart i monokultur eller kokultur att förhöra interspecies interaktioner i multispecies bakteriella samhällen, inklusive enskilda cell motilitet och livskraft.
Abstract
Polymikrobiella samhällen är allestädes närvarande i naturen, men att studera deras interaktioner på encellig nivå är svårt. Således har en mikroskopibaserad metod utvecklats för att observera interspecies interaktioner mellan två bakteriella patogener. Användningen av denna metod för att förhöra interaktioner mellan en motil Gram-negativa patogen, Pseudomonas aeruginosa och en icke-motila Gram-positiva patogen, Staphylococcus aureus påvisas här. Detta protokoll består av co-inoculating varje art mellan en coverslip och en agaros pad, som upprätthåller cellerna i ett enda plan och möjliggör visualisering av bakteriella beteenden i både tid och rum.
Dessutom är den timelapskopia som demonstreras här idealisk för att visualisera de tidiga interaktioner som sker mellan två eller flera bakteriearter, inklusive förändringar i bakteriearters motilitet i monokultur och i kokultur med andra arter. På grund av arten av det begränsade provutrymmet i mikroskopiupplägget är detta protokoll mindre tillämpligt för att studera senare interaktioner mellan bakteriearter när cellpopulationerna är för höga. Det finns dock flera olika tillämpningar av protokollet som inkluderar användning av färgning för avbildning levande och döda bakterieceller, kvantifiering av gen eller protein uttryck genom fluorescerande reportrar, och spåra bakteriell cellrörelse i både enstaka arter och multiarter experiment.
Introduction
Polymikrobiella samhällen är vanliga i naturen, som spänner över en mängdolika miljömässiga 1,2,3 och mänskliga nischer4,5. Några av de mest ökända polymikrobiella infektioner i mänskliga sjukdomar inkluderar dentala biofilmer6, kroniska sår7,8, och luftvägsinfektioner hos individer med kronisk obstruktiv lungsjukdom9, ventilator-associeradelunginflammation 10, och den genetiska sjukdomen cystisk fibros (CF)11,12. Dessa infektioner är ofta består av olika mikrobiella arter; men en nyligen inriktad på samspelet mellan den Grampositiva bakterien Staphylococcus aureus och den Gramnegativa bakterien Pseudomonas aeruginosa har uppstått. Studier som inkluderar patienter som är myntade med dessa organismer och in vitro-analyser avslöjar både konkurrensmässiga och kooperativa interaktioner som kan ha djupgående och oväntade påverkan på sjukdomsprogression, mikrobiell överlevnad, virulens, metabolism, och antibiotikas mottaglighet (granskas i detalj av Hotterbeekx et al. 201713 och Limoli och Hoffman 20193).
Det växande intresset för interspecies interaktioner under infektion har gett en mängd olika metoder för att studera polymikrobiella samhället beteenden. Typiskt, dessa studier har utnyttjat platta eller buljong-baserade analyser för att undersöka de fenotypiska skillnaderna mellan monokultur och kokultur. Till exempel, kokulturering P. aeruginosa och S. aureus på fasta ytor har möjligit för visualisering av tillväxthämning eller förändringar i koloni fenotyp, pigment, eller polysackarid produktion14,15,16. Blandade arter biofilmer, på biotiska eller abiotiska ytor, samt koculturing bakteriearter i flytande kultur har också möjliggjort mätning av förändringar i tillväxt, metabolism, antibiotisk tolerans, konkurrens och livskraft, förutom gen och protein uttryck17,18. Medan dessa bulkkultur experiment har avslöjat insikt i hur P. aeruginosa och S. aureus kan påverka varandra på samhällsskala, de kan inte svara på viktiga frågor om de interaktioner som sker på encellig nivå. Den metod som presenteras här bidrar till de metoder för att studera interspecies interaktioner genom att fokusera på förändringar i rörelse, cell livskraft, och genuttryck av enstaka celler inom en cocultured gemenskap över tiden.
Encelliga interaktioner kan i stor utsträckning skilja sig från de interaktioner som sker i en bulk gemenskap av celler. Genom encellig analys kan heterogeniteten inom en gemenskap kvantifieras för att studera hur rumslig placering av celler påverkar samhällsdynamiken eller hur gen- och proteinuttrycksnivåer förändras inom enskilda medlemmar i en grupp. Spårningsceller kan också ge insikt i hur enstaka celler rör sig och beter sig över tiden, genom flera generationer. Genom att spåra cellrörelse och förändringar i genuttryck samtidigt kan korrelationer göras mellan genfluktuationer och motsvarande fenotyper. Tidigare protokoll för att studera enskilda bakteriearter på encellsnivå har beskrivits. Dessa studier dra nytta av live-imaging celler över tiden i ett enda plan, och har varit användbara för att observera fenotyper som celldelning och antibiotika mottaglighet19,20. Ytterligare live-imaging mikroskopi har utnyttjats för att övervaka tillväxt, motilitet, ytkolonisering och biofilm bildning av enda bakteriearter21,22,23. Men medan dessa studier har varit insiktsfulla för att förstå fysiologi bakterier i monokultur, experiment för att observera encelliga beteende av flera bakteriearter över tiden i kokultur är begränsade.
Här har tidigare protokoll som används för avbildning av en art anpassats till att studera interaktioner mellan P. aeruginosa och S. aureus. Dessa organismer kan differentieras under faskontrast baserat på deras cellmorfologier (P. aeruginosa är bacilli och S. aureus är cocci). Utveckling av denna metod nyligen möjliggjort visualisering av tidigare obeskriven motility beteenden av P. aeruginosa i närvaro av S. aureus24. P. aeruginosa konstaterades vara kapabel att känna av S. aureus från ett avstånd och svara med ökad och riktad single-cell rörelser mot kluster av S. aureus celler. P. aeruginosa rörelse mot S. aureus befanns kräva typ IV pili (TFP), hår-liknande projektioner vars samordnade förlängning och upprullning generera en rörelse som kallas ryckningar motility25.
Dessa studier visar nyttan av denna metod för att förhöra tidigare interaktioner mellan arter. Bildbehandling vid höga celltätheter vid senare interaktionstidspunkter är dock svårt med tanke på att enstaka lager av celler inte längre kan identifieras, vilket oftast innebär problem under post-imaging analys. Med tanke på denna begränsning är metoden bäst lämpad för tidigare interaktioner som sedan kunde följas upp med traditionella makroskopiska analyser vid högre celltätheter som är representativa för senare interaktioner. Ytterligare begränsningar av denna metod inkluderar låg genomströmning karaktär, eftersom endast ett prov kan avbildas i taget och kostnaden för mikroskop, kamera och miljökammare. Dessutom innebär fluorescensmikroskopi risker för bakteriecellerna som fototoxicitet och fotobleaching, vilket begränsar frekvensen som fluorescensbilder kan förvärvas. Slutligen, de agaros kuddar som används i denna metod är mycket mottagliga för förändringar i miljön, vilket gör det viktigt att kontrollera för förhållanden som temperatur och luftfuktighet, med tanke på att kuddar kan börja krympa eller expandera om villkoren inte är korrekta. Slutligen, medan denna metod inte efterliknar värdmiljön, ger det ledtrådar för hur olika bakteriearter svarar på ytor, som kan följas upp i analyser som utformats för att efterlikna miljö / värd förhållanden.
Denna metod skiljer sig från tidigare studier spåra encellig rörelse, i att celler är inokulerade mellan en täckplatta och agarose pad, begränsa celler till ytan. Detta möjliggör cellspårning över tid i ett enda plan; begränsar dock cykler av övergående ytangagemang som observerats när celler är nedsänkta i vätska26. En ytterligare fördel av bildframställning bakterier under en agaros pad är att den härmar makroskopisk platta-baserade sub-ytan inokulering assays klassiskt används för att undersöka P. aeruginosa ryckningar motility25. I denna analys, bakterieceller inokuleras mellan botten av en Petri skålen och agar, hålla cellerna i ett enda plan som de rör sig över botten av skålen utåt från punkten för inokulering, ungefär som denna mikroskopi protokoll.
Protokollet för mikroskopi för tidsfördröjning för visualisering av interaktioner mellan arter som presenteras här består av 1) förbereda bakterieprovet och agarospaden, 2) välja mikroskopinställningar för bildframställning förvärv och 3) post-imaging analys. Detaljerad visualisering av cellrörelse och spårning kan utföras genom förvärv av bilder med korta tidsintervaller efter faskontrast. Fluorescensmikroskopi kan också utnyttjas för att bestämma cellernas livskraft eller genuttryck över tiden. Här visar vi ett exempel på anpassning för fluorescensmikroskopi genom tillsats av livsdugliga färgämnen till agaroskuddarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som presenteras här beskriver ett protokoll för live-cell imaging av bakteriella arter interaktioner på encellsnivå med ändringar för andra tillämpningar inklusive cell spårning och övervakning cell livskraft. Denna metod öppnar nya vägar för att studera encelliga beteenden av mikroorganismer i kokultur med andra arter över tiden. Specifikt visar protokollet nyttan av denna kokultur metod för att observera bakteriella ytbeteenden, särskilt när man studerar organismer som har både yta och väts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från Cystisk Fibros Stiftelsen Postdoc-till-fakulteten Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystisk Fibros Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), och NIH T32 Utbildning Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi tackar Jeffrey Meisner, Minsu Kim och Ethan Garner för att dela inledande protokoll och råd för bildbehandling och göra kuddar.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
