Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula
Summary
Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.
Abstract
Las comunidades polimicrobianas son omnipresentes en la naturaleza, pero estudiar sus interacciones a nivel de una sola célula es difícil. Por lo tanto, se ha desarrollado un método basado en microscopía para observar las interacciones entre especies entre dos patógenos bacterianos. El uso de este método para interrogar las interacciones entre un patógeno Gram-negativo móvil, Pseudomonas aeruginosa y un patógeno Gram-positivo no móvil, Staphylococcus aureus se muestra aquí. Este protocolo consiste en co-inocular cada especie entre un cubreobjetos y una almohadilla de agarosa, que mantiene las células en un solo plano y permite la visualización de comportamientos bacterianos tanto en el espacio como en el tiempo.
Además, la microscopía de lapso de tiempo que se ha demostrado aquí es ideal para visualizar las interacciones tempranas que tienen lugar entre dos o más especies bacterianas, incluidos los cambios en la motilidad de las especies bacterianas en el monocultivo y en el cocultivo con otras especies. Debido a la naturaleza del espacio limitado de la muestra en la configuración de la microscopía, este protocolo es menos aplicable para estudiar las interacciones posteriores entre las especies bacterianas una vez que las poblaciones celulares son demasiado altas. Sin embargo, hay varias aplicaciones diferentes del protocolo que incluyen el uso de tinción para imágenes de células bacterianas vivas y muertas, la cuantificación de la expresión génica o proteica a través de reporteros fluorescentes, y el seguimiento del movimiento celular bacteriano en experimentos de una sola especie y multiespecie.
Introduction
Las comunidades polimicrobianas son de naturaleza común, abarcando una variedad de ambientales1,,2,3 y nichos humanos4,5. Algunas de las infecciones polimicrobianas más notorias en enfermedades humanas incluyen biopelículas dentales6, heridas crónicas7,8, e infecciones respiratorias en individuos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica9, neumonía asociada al respirador10, y la enfermedad genética fibrosis quística (CF)11,12. Estas infecciones a menudo se componen de diversas especies microbianas; sin embargo, ha surgido un enfoque reciente en las interacciones entre la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus y la bacteria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa. Los estudios que incluyen pacientes coinfectados con estos organismos y análisis in vitro revelan interacciones competitivas y cooperativas que pueden tener influencias profundas e inesperadas en la progresión de la enfermedad, la supervivencia microbiana, la virulencia, el metabolismo y la susceptibilidad a los antibióticos (revisados en detalle por Hotterbeekx et al. 201713 y Limoli y Hoffman 20193).
El creciente interés en las interacciones entre especies durante la infección ha dado lugar a una variedad de métodos para estudiar los comportamientos de la comunidad polimicrobiana. Típicamente, estos estudios han utilizado ensayos a base de placas o caldos para investigar las diferencias fenotípicas entre el monocultivo y la cocultura. Por ejemplo, el coculturing P. aeruginosa y S. aureus en superficies sólidas ha permitido la visualización de la inhibición del crecimiento o cambios en la producción de fenotipo de colonia, pigmento o polisacárido14,,15,,16. Las biopelículas de especies mixtas, en superficies bióticas o abióticas, así como la coculturización de especies bacterianas en cultivo líquido también han permitido la medición de los cambios en el crecimiento, el metabolismo, la tolerancia a los antibióticos, la competencia y la viabilidad, además de la expresión génica y proteica17,18. Si bien estos experimentos de cultivo a granel han revelado una visión de cómo P. aeruginosa y S. aureus podrían influir mutuamente a escala comunitaria, son incapaces de responder preguntas importantes sobre las interacciones que tienen lugar a nivel de una sola célula. El método presentado aquí se suma a los enfoques para estudiar las interacciones entre especies centrándose en los cambios en el movimiento, la viabilidad celular y la expresión génica de células individuales dentro de una comunidad cocultivo a lo largo del tiempo.
Las interacciones de una sola célula pueden diferir ampliamente de las interacciones que tienen lugar en una comunidad masiva de células. A través del análisis de una sola célula, la heterogeneidad dentro de una comunidad se puede cuantificar para estudiar cómo la colocación espacial de las células influye en la dinámica de la comunidad o cómo los niveles de expresión de genes y proteínas cambian dentro de los miembros individuales de un grupo. Las celdas de seguimiento también pueden proporcionar información sobre cómo las células individuales se mueven y se comportan a lo largo del tiempo, a través de varias generaciones. Mediante el seguimiento simultáneo del movimiento celular y los cambios en la expresión génica, se pueden hacer correlaciones entre las fluctuaciones genéticas y los fenotipos correspondientes. Se han descrito protocolos previos para el estudio de especies bacterianas individuales a nivel de una sola célula. Estos estudios aprovechan las células de imagen en vivo a lo largo del tiempo en un solo plano, y han sido útiles para observar fenotipos como la división celular y la susceptibilidad a los antibióticos19,,20. Se ha utilizado una microscopía adicional de imágenes en vivo para monitorear el crecimiento, la motilidad, la colonización superficial y la formación de biopelículas de especies bacterianas únicas21,22,,23. Sin embargo, si bien estos estudios han sido perspicaces para entender la fisiología de las bacterias en el monocultivo, los experimentos para observar el comportamiento de una sola célula de múltiples especies bacterianas a lo largo del tiempo en la cocultura son limitados.
Aquí, los protocolos anteriores utilizados para la imagen de una sola especie se han adaptado para estudiar las interacciones entre P. aeruginosa y S. aureus. Estos organismos se pueden diferenciar bajo contraste de fase basado en sus morfologías celulares(P. aeruginosa son bacilos y S. aureus son cocci). El desarrollo de este método ha permitido recientemente la visualización de comportamientos de motilidad previamente no descritos de P. aeruginosa en presencia de S. aureus24. Se encontró que P. aeruginosa era capaz de detectar S. aureus desde la distancia y responder con movimientos de una sola célula crecientes y direccionales hacia grupos de células de S. aureus. Se encontró que el movimiento P. aeruginosa hacia S. aureus requería el pili tipo IV (TFP), proyecciones similares al cabello cuya extensión coordinada y retracción generan un movimiento llamado motilidad tembloroso25.
Estos estudios demuestran la utilidad de este método para interrogar interacciones anteriores entre especies. Sin embargo, las imágenes con densidades celulares altas en puntos de tiempo de interacción posteriores son difíciles dado que ya no se pueden identificar capas individuales de células, lo que principalmente plantea problemas durante el análisis posterior a la imagen. Dada esta limitación, el método es el más adecuado para interacciones anteriores que luego podrían ser seguidas con ensayos macroscópicos tradicionales a densidades celulares más altas representativas de interacciones posteriores. Las limitaciones adicionales de este método incluyen la naturaleza de bajo rendimiento, ya que solo se puede tomar una imagen de una muestra a la vez y el costo del microscopio, la cámara y la cámara ambiental. Además, la microscopía de fluorescencia plantea riesgos para las células bacterianas como la fototoxicidad y el fotoblancaring, limitando así la frecuencia con la que se pueden adquirir imágenes de fluorescencia. Por último, las almohadillas de agarosa utilizadas en este método son altamente susceptibles a cambios en el entorno, por lo que es crítico controlar para condiciones como la temperatura y la humedad, dado que las almohadillas pueden comenzar a encogerse o expandirse si las condiciones no son correctas. Por último, aunque este método no imita el entorno anfitrión, proporciona pistas sobre cómo las diferentes especies bacterianas responden en las superficies, que se pueden hacer un seguimiento en ensayos diseñados para imitar las condiciones ambientales/de acogida.
Este método difiere de estudios anteriores que rastrean el movimiento de una sola célula, en que las células se inoculan entre un cubreobjetos y una almohadilla de agarosa, restringiendo las células a la superficie. Esto permite el seguimiento de celdas a lo largo del tiempo en un solo plano; sin embargo, limita los ciclos de compromiso de superficie transitoria observados cuando las células se sumergen en líquido26. Un beneficio adicional de las bacterias de la imagen bajo una almohadilla de agarosa es que imita los ensayos macroscópicos de inoculación de subsuelo basados en placas clásicamente utilizados para examinar la motilidad temblorosa de P. aeruginosa 25. En este ensayo, las células bacterianas se inoculan entre la parte inferior de un plato de Petri y el agar, manteniendo las células en un solo plano a medida que se mueven a través de la parte inferior del plato hacia afuera desde el punto de inoculación, al igual que este protocolo de microscopía.
El protocolo de microscopía de lapso de tiempo para visualizar las interacciones entre especies presentadas aquí consiste en 1) preparar la muestra bacteriana y la almohadilla de agarosa, 2) seleccionar la configuración del microscopio para la adquisición de imágenes y 3) el análisis post-imagen. La visualización detallada del movimiento y seguimiento celular se puede realizar mediante la adquisición de imágenes a intervalos de tiempo cortos por contraste de fase. La microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para determinar la viabilidad celular o la expresión génica con el tiempo. Aquí, mostramos un ejemplo de adaptación para la microscopía de fluorescencia a través de la adición de tintes de viabilidad a las almohadillas de agarosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados aquí describen un protocolo para la toma de imágenes de células vivas de interacciones de especies bacterianas a nivel de una sola célula con modificaciones para otras aplicaciones, incluido el seguimiento celular y la supervisión de la viabilidad celular. Este método abre nuevas vías para estudiar los comportamientos unicelulares de los microorganismos en la cocultura con otras especies a lo largo del tiempo. Específicamente, el protocolo demuestra la utilidad de este método de cocultur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la financiación del Premio de Transición Postdoc-to-Faculty de la Fundación De la Cis fibrosis LIMOLI18F5 (DHL), el Premio de Reclutamiento de la Facultad Juvenil de la Fundación de Fibrosis Quística LIMOLI19R3 (DHL), y la Beca de Formación NIH T32 5T32HL007638-34 (ASP). Agradecemos a Jeffrey Meisner, Minsu Kim y Ethan Garner por compartir los protocolos iniciales y consejos para la creación de imágenes y la fabricación de almohadillas.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
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