Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies
Summary
Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.
Abstract
As comunidades polimicrobianas são de natureza onipresente, mas estudar suas interações no nível de célula única é difícil. Assim, um método baseado em microscopia foi desenvolvido para observar interações entre duas espécies bacterianas. O uso deste método para interrogar interações entre um patógeno Gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa e um patógeno gram-positivo não-motile, Staphylococcus aureus é demonstrado aqui. Este protocolo consiste em co-vacinar cada espécie entre um deslizamento de cobertura e uma almofada de agarose, que mantém as células em um único plano e permite a visualização de comportamentos bacterianos tanto no espaço quanto no tempo.
Além disso, a microscopia de lapso de tempo demonstrada aqui é ideal para visualizar as interações precoces que ocorrem entre duas ou mais espécies bacterianas, incluindo alterações na motilidade das espécies bacterianas na monocultura e na cocultura com outras espécies. Devido à natureza do espaço amostral limitado na configuração da microscopia, este protocolo é menos aplicável para estudar interações posteriores entre espécies bacterianas, uma vez que as populações de células são muito altas. No entanto, existem várias aplicações diferentes do protocolo que incluem o uso de coloração para imagens de células bacterianas vivas e mortas, quantificação da expressão genética ou proteica através de repórteres fluorescentes, e rastreamento do movimento celular bacteriano em experimentos de espécies únicas e multiespécies.
Introduction
Comunidades polimicrobianas são comuns na natureza, abrangendo uma variedade de nichos ambientais1,,2,,3 e humanos4,,5. Algumas das infecções polimicrobianas mais notórias na doença humana incluem biofilmes dentários6, feridas crônicas7,,8, e infecções respiratórias em indivíduos com doença pulmonar obstrutiva crônica9,pneumonia associada ao ventilador10e fibrose cística da doença genética (CF)11,12. Essas infecções são frequentemente compostas de diversas espécies microbianas; no entanto, surgiu um foco recente nas interações entre a bactéria Gram-positive Staphylococcus aureus e a bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa. Estudos que incluem pacientes coinfectados com esses organismos e análises in vitro revelam interações competitivas e cooperativas que podem ter influências profundas e inesperadas na progressão da doença, sobrevivência microbiana, virulência, metabolismo e suscetibilidade a antibióticos (revisados em detalhes por Hotterbeekx et al. 201713 e Limoli e Hoffman 20193).
O crescente interesse pelas interações entre espécies durante a infecção tem gerado uma variedade de métodos para estudar comportamentos da comunidade polimicrobiana. Tipicamente, esses estudos têm utilizado ensaios à base de chapas ou caldos para investigar as diferenças fenotípicas entre monocultura e cocultura. Por exemplo, coculto P. aeruginosa e S. aureus em superfícies sólidas permitiu a visualização da inibição do crescimento ou alterações na produção de fenótipo, pigmento ou polissacarídeo da colônia14,,15,,16. Biofilmes de espécies mistas, em superfícies bióticas ou abióticas, bem como coculpando espécies bacterianas na cultura líquida também permitiram a medição de mudanças no crescimento, metabolismo, tolerância a antibióticos, competição e viabilidade, além da expressão genética e proteica17,18. Embora esses experimentos de cultura em massa tenham revelado uma visão de como P. aeruginosa e S. aureus podem influenciar uns aos outros na escala da comunidade, eles são incapazes de responder a perguntas importantes sobre as interações que ocorrem no nível de célula única. O método aqui apresentado se soma às abordagens para estudar interações entre espécies, focando nas mudanças de movimento, viabilidade celular e expressão genética de células únicas dentro de uma comunidade coculturada ao longo do tempo.
As interações unicelulares podem diferir amplamente das interações que ocorrem em uma comunidade em massa de células. Através da análise unicelular, a heterogeneidade dentro de uma comunidade pode ser quantificada para estudar como a colocação espacial das células influencia a dinâmica da comunidade ou como os níveis de expressão genética e proteica mudam dentro de membros individuais de um grupo. O rastreamento de células também pode fornecer informações sobre como células únicas se movem e se comportam ao longo do tempo, através de várias gerações. Ao rastrear o movimento celular e as alterações na expressão genética simultaneamente, correlações podem ser feitas entre flutuações genéticas e fenótipos correspondentes. Foram descritos protocolos anteriores para o estudo de espécies bacterianas individuais no nível de células únicas. Esses estudos aproveitam as células de imagem ao vivo ao longo do tempo em um único plano, e têm sido úteis para observar fenótipos como divisão celular e suscetibilidade a antibióticos19,,20. Foram utilizadas microscopia suplementar de imagem viva para monitorar o crescimento, a motilidade, a colonização superficial e a formação de biofilmes de espécies bacterianas únicas21,,22,,23. No entanto, embora esses estudos tenham sido perspicazes para entender a fisiologia das bactérias na monocultura, os experimentos para observar o comportamento unicelular de múltiplas espécies bacterianas ao longo do tempo na cocultura são limitados.
Aqui, protocolos anteriores usados para imagens uni espécies foram adaptados para estudar interações entre P. aeruginosa e S. aureus. Esses organismos podem ser diferenciados sob contraste de fase com base em suas morfologias celulares(P. aeruginosa são bacilos e S. aureus são cocci). O desenvolvimento deste método recentemente possibilitou a visualização de comportamentos de motilidade não atribuídos anteriormente não atribuídos de P. aeruginosa na presença de S. aureus24. P. aeruginosa foi encontrado capaz de sentir S. aureus à distância e responder com movimentos de célula única aumentada e direcional em direção a aglomerados de células S. aureus. O movimento P. aeruginosa em direção a S. aureus foi encontrado para exigir o tipo IV pili (TFP), projeções semelhantes ao cabelo cuja extensão coordenada e retração geram um movimento chamado motilidade contração25.
Esses estudos demonstram a utilidade deste método para interrogar interações anteriores entre espécies. No entanto, a imagem em altas densidades celulares em pontos de tempo de interação posteriores é difícil, dado que camadas únicas de células não podem mais ser identificadas, o que coloca principalmente problemas durante a análise pós-imagem. Dada essa limitação, o método é mais adequado para interações anteriores que poderiam ser seguidas com ensaios macroscópicos tradicionais em densidades celulares mais altas representativas de interações posteriores. Limitações adicionais deste método incluem a natureza de baixo rendimento, uma vez que apenas uma amostra pode ser imageda de cada vez e o custo do microscópio, câmera e câmara ambiental. Além disso, a microscopia de fluorescência representa riscos para as células bacterianas como fototoxicidade e fotobleaching, limitando assim a frequência que as imagens de fluorescência podem ser adquiridas. Por fim, as almofadas de agarose utilizadas neste método são altamente suscetíveis a mudanças no ambiente, tornando-se crítico controlar condições como temperatura e umidade, dado que as almofadas podem começar a encolher ou expandir se as condições não estiverem corretas. Finalmente, embora este método não imite o ambiente hospedeiro, ele fornece pistas de como diferentes espécies bacterianas respondem em superfícies, que podem ser acompanhadas em ensaios projetados para imitar condições ambientais/hospedeiras.
Este método difere de estudos anteriores que rastreiam o movimento unicelular, na parte em que as células são inoculadas entre um deslizamento de tampa e uma almofada de agarose, restringindo as células à superfície. Isso permite o rastreamento de células ao longo do tempo em um único plano; no entanto, limita ciclos de engajamento transitório da superfície observados quando as células estão submersas no líquido26. Um benefício adicional das bactérias de imagem sob uma almofada de agarose é que ela imita ensaios de inoculação sub-superfície macroscópicas à base de placas usadas para examinar a motilidade de contração de P. aeruginosa 25. Neste ensaio, as células bacterianas são inoculadas entre o fundo de uma placa de Petri e o ágar, mantendo as células em um único plano enquanto se movem através do fundo do prato para fora do ponto de inoculação, assim como este protocolo de microscopia.
O protocolo de microscopia de lapso de tempo para visualização de interespécies interespécies aqui apresentadas consiste em 1) preparar a amostra bacteriana e a almofada de agarose, 2) selecionar configurações de microscópio para aquisição de imagens e 3) análise pós-imagem. A visualização detalhada do movimento e rastreamento do celular pode ser realizada por aquisição de imagens em intervalos curtos de tempo por contraste de fase. A microscopia de fluorescência também pode ser utilizada para determinar a viabilidade celular ou a expressão genética ao longo do tempo. Aqui, mostramos um exemplo de adaptação para microscopia de fluorescência através da adição de corantes de viabilidade às almofadas agarose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui apresentados descrevem um protocolo para imagens de células vivas de interações de espécies bacterianas no nível unicelular com modificações para outras aplicações, incluindo rastreamento celular e viabilidade celular de monitoramento. Este método abre novos caminhos para o estudo de comportamentos unicelulares de microrganismos na cocultura com outras espécies ao longo do tempo. Especificamente, o protocolo demonstra a utilidade deste método de cocultura na observação de comportamentos de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Prêmio de Transição Pós-Doutor-Faculdade da Fundação Cystic Pós-Docente LIMOLI18F5 (DHL), Prêmio de Recrutamento de Faculdades Juniores da Fundação Cística Júnior LIMOLI19R3 (DHL) e Bolsa de Treinamento NIH T32 5T32HL007638-34 (ASP). Agradecemos a Jeffrey Meisner, Minsu Kim e Ethan Garner por compartilharem protocolos iniciais e conselhos para imagens e fazer almofadas.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
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