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Immunology and Infection

单细胞物种间细菌相互作用的动力学可视化

doi: 10.3791/61376 Published: August 5, 2020
* These authors contributed equally

Summary

这种活细菌细胞成像协议允许可视化多个细菌物种之间在一段时间的单细胞水平相互作用。延时成像允许在单一培养或联合培养中观察每个细菌物种,以询问多物种细菌群落中的外来物种相互作用,包括单个细胞的动性与生存能力。

Abstract

多微生物群落在自然界中无处不在,但研究它们在单细胞层面的相互作用是困难的。因此,已经开发出一种基于显微镜的方法,用于观察两种细菌病原体之间的物种间相互作用。使用这种方法来询问莫蒂克阴性病原体、 伪多多 尼亚和非莫蒂克呈阳性病原体 黄色葡萄球菌之间的相互作用。该协议包括在每个物种之间共同接种盖玻片和一个阿加罗斯垫,它维护细胞在一个平面,并允许在空间和时间细菌行为的可视化。

此外,这里演示的延时显微镜非常适合可视化两个或两个或更多细菌物种之间发生的早期相互作用,包括细菌物种在单一培养和与其他物种共培养中活动的变化。由于显微镜设置中样本空间有限,一旦细胞数量过高,此协议不太适用于研究细菌物种之间的后期相互作用。然而,该协议有许多不同的应用,包括使用染色成像活体和死细菌细胞,通过荧光报告器量化基因或蛋白质表达,以及跟踪细菌细胞在单一物种和多物种实验中的运动。

Introduction

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多微生物群落在自然界中很常见,涵盖各种环境1、2、3,2,3和人类利基4、5。,5人类疾病中最臭名昭著的多微生物感染包括牙科生物膜,6、慢性伤口,7、8、慢性阻塞性肺79、呼吸机相关肺炎10、遗传性疾病囊性纤维化(CF)11、12。101112这些感染通常由不同的微生物物种组成;然而,最近出现了一个焦点,在革兰血球菌金黄色Staphylococcus aureus葡萄球菌和革兰阴性细菌伪多多莫尼亚之间的相互作用已经出现。包括与这些生物体合并的患者和体外分析在内的研究揭示了竞争和合作相互作用,这些相互作用对疾病进展、微生物生存、毒性、代谢和抗生素易感性有深刻和意想不到的影响(由 Hotterbeekx等人详细审查,2017年13和利莫利和霍夫曼20193)。

感染期间对物种间相互作用的兴趣日益增长,产生了研究多微生物社区行为的各种方法。通常,这些研究利用基于板材或肉汤的测定来研究单一栽培和共培养之间的表型差异。例如,在固体表面上的Coureing P. aeruginosa和S.金黄色金黄色,可以可视化生长抑制或菌落表型、色素或多糖生产的变化 14、15、16 。14,15,16混合物种生物膜,在生物或非生物表面,以及在液体培养中培养细菌物种,也能够测量生长变化,新陈代谢,抗生素耐受性,竞争和生存能力的变化,除了基因和蛋白质表达17,18。,18虽然这些大宗培养实验揭示了P.aeruginosaS.aureus在社区尺度上可能如何影响彼此,但它们无法回答有关单细胞水平相互作用的重要问题。此处介绍的方法通过关注联合培养社区中单个细胞的运动、细胞活力和基因表达的变化,为研究物种间相互作用的方法提供了补充。

单细胞相互作用可能与在细胞大社区中发生的相互作用大相径庭。通过单细胞分析,可以量化社区内的异质性,以研究细胞的空间放置如何影响社区动力学,或基因和蛋白质表达水平如何改变群体中个别成员。跟踪单元格还可以深入了解单个单元格在一段时间内如何移动和行为,通过多代。通过同时跟踪细胞运动和基因表达的变化,可以与基因波动和相应的表型进行关联。以前在单细胞水平上研究单个细菌物种的协议已经描述。这些研究利用活成像细胞在一个平面上的时间,并一直可用于观察表型,如细胞分裂和抗生素易感性19,20。19,额外的活成像显微镜已被用于监测生长,运动,表面殖民化和生物膜形成的单一细菌物种21,22,23。21,22,23然而,虽然这些研究对单一培养中的细菌生理学有见地,但观察多种细菌在联合培养中单细胞行为的实验是有限的。

在这里,以前用于单物种成像的协议已被改编为研究 P.aeruginosaS.aureus之间的相互作用。这些生物体可以根据细胞形态在相位对比下分化(P.aeruginosa 是杆菌 ,S.金合是 球菌)。此方法的发展最近使 P.aeruginosa在S.aureus24 存在的情况下, 能够可视化以前未描述的动能行为P. aeruginosa 被发现能够从远处感应 到 S. aureus, 并且对 S. aureus 细胞群的增强和定向运动作出反应。 P. aeruginosa 运动对 S. aureus 被发现需要类型 IV 皮利 (TFP), 头发一样的预测, 其协调的延伸和缩回产生一个运动称为抽搐运动25.

这些研究证明了这种方法对于询问物种之间早期相互作用的效用。然而,由于无法再识别单个细胞层的高细胞密度在后期相互作用时间点进行成像是很困难的,这主要在成像后分析期间造成问题。鉴于这一限制,该方法最适合早期相互作用,然后可以跟进传统的宏观测定,在代表后期相互作用的较高细胞密度。此方法的其他限制包括低通量性质,因为一次只能成像一个样品,以及显微镜、相机和环境室的成本。此外,荧光显微镜对细菌细胞(如光毒性和光漂白)构成风险,因此限制了荧光图像获取的频率。最后,此方法中使用的气糖垫极易受到环境变化的影响,因此,由于如果条件不正确,垫片可以开始收缩或膨胀,因此控制温度和湿度等条件至关重要。最后,虽然这种方法不模仿宿主环境,但它为不同细菌物种在表面上的反应提供了线索,这些线索可以在旨在模拟环境/宿主条件的测定中跟进。

这种方法不同于先前跟踪单细胞运动的研究,因为细胞在盖玻片和红糖垫之间接种,将细胞限制在表面。这允许在单个平面中随着时间的推移进行细胞跟踪;然而,当细胞浸入液体26中时,观察到的瞬态表面接触周期有限。在气糖垫下成像细菌的一个好处是,它模仿了基于大微量板的地下接种测定,经典地用于检查 P.aeruginosa 抽搐运动25。在这项检测中,细菌细胞在培养皿底部和阿加之间接种,使细胞在从接种点向外穿过培养皿底部时保持单个平面,就像这种显微镜协议一样。

此处介绍的用于可视化物种间相互作用的延时显微镜方案包括 1) 制备细菌样本和 agarose 垫,2) 选择显微镜设置进行成像采集,3) 成像后分析。可以通过以相位对比度在短时间内采集图像来执行细胞移动和跟踪的详细可视化。荧光显微镜也可用于确定细胞的生存能力或基因表达随着时间的推移。在这里,我们展示一个通过向气量染料添加到气垫中来适应荧光显微镜的例子。

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Protocol

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注:此协议中所有耗材的完整说明和目录号见材料表。

1. M8T 最小介质的制备

  1. 通过溶解 64 g Na 2 HPO4 +7H 2O、15g KH2PO42和 2.5 g NaCl 在 800 mL 的超纯水 (UPW,电阻率 18 MΩ/cm) 中,准备 1 L 的 M8 最小盐基 (5 倍)。pH 到 7.6。使用 UPW 将音量完全达到 1 L。自动挡 45 分钟
  2. 通过将 1 L 400 mL UPW 中的 100 g 葡萄糖溶解,准备 500 mL 的葡萄糖溶液(20% w/v)。使用 UPW 将解决方案完全解至 500 mL。自动挡 45 分钟
  3. 通过溶解 400 mL UPW 中的 100 g tryptone 溶液(20% w/v),准备 500 mL 的 trypton 溶液。使用 UPW 完成至 500 mL。自动挡 45 分钟
  4. 通过添加 200 mL 的 5x M8 最小盐 (1 倍最终), 10 mL 的 20% 葡萄糖 (+ 0.2% 决赛), 1 mL 的 1 M MgSO4 (1 mM 决赛), 50 mL 的 20% trypton (1% 最终) 到 600 mL 的 Upw。使用 UPW 完成至 1 L。通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌 500 mL 介质存储瓶中。

第1天:

2. 细菌过夜培养的准备

  1. 接种5 mL的M8T最小介质 ,用单一的P.aeruginosaS.aureus( 酌情包括抗生素),在37°C孵育过夜,通气不超过16小时。
    注:细菌病原体P.aeruginosa和S.aureus用于这种方法,因为它们通常与慢性感染共体,研究它们的相互作用对于了解它们在多微生物感染期间如何对患者结果做出贡献非常重要。根据研究的重点,可以使用其他细菌物种。

第2天:

3. 细菌菌株的亚栽培

  1. 亚栽 培 P. aeruginosa 1:500 和 S. aureus 1:1000 在 5 mL 的新鲜 M8T (包括抗生素,如果适当)。在37°C下用加分孵育,直到培养物达到中原位(OD600 = ±0.3 - 0.5)。

4. 垫模材料的制备

  1. 使用 Bunsen 燃烧器加热扁平圆形实验室铲的端,直到平端的一半可以弯曲到 90° 角,以准备金属铲。加热另一个平面的圆圆实验室铲的端,稍微弯曲最后10毫米到45°C角。
  2. 切断硅胶模具的四个角落,使模具适合在 35 mm 的培养皿内。
  3. 通过加入70%乙醇,并通过邦森燃烧器的火焰将铲子和一对钳子消毒。
  4. 用 70% 乙醇清洁盘子和硅胶模具,然后用无绒湿巾干燥。

5. 制备加糖垫

注:垫片采用 M8T 最小介质作为本协议中使用的细菌的营养源。然而,垫中使用的营养物质可以修改为不同的生物体。

  1. 在 10 mL 的 M8T 中,在干净的 50 mL Erlenmeyer 烧瓶中熔化 2% 的低熔糖。微波在很短的时间间隔(2-5秒),直到阿加罗斯在溶液中,以防止烧瓶的内容沸腾。一旦融化,让冷却在50°C的水浴中至少15分钟。
  2. 通过将硅胶切口与 35 mm 盘中的开口对齐,用铲子轻轻敲击以将硅胶固定到盘中,并清除模具和盘之间的所有气泡,来准备模具。
  3. 冷却后,移液器915μL的熔融气液进入模具中。将盖子保持开箱,让垫在室温下干燥 30 分钟。
  4. 用盖子盖住盘子,在室温下再离开2小时。
  5. 通过紧密卷起无绒湿巾来准备湿度湿巾。将卷拭子放在无菌培养皿内,并在湿巾上均匀地加入 500 μL 的无菌水。加热至37°C 1小时。
  6. 将垫和无菌 35 mm 盘加热至 37 °C 1 小时。

6. 制备细菌细胞和接种垫

  1. 测量每个亚栽培的 OD600,P. aeruginosa 稀释到 OD600 = 0.03,将 S. aureus稀释到 OD600 = 0.10,在 M8T 中预警告至 37 °C。 混合P.aeruginosa和S.奥雷乌斯在1:1的比例和漩涡。
    注:如果菌株需要抗生素,抗生素可以添加到过夜和亚栽培中,但如果它影响到联合培养中的其他物种,则不应在混合物种进行成像时添加抗生素。需要确定每种生物体/质粒的稳定性和抗生素对联合栽培中所有物种的影响。
  2. 在预加热的无菌 35 mm 玻璃盖板盘底部均匀地使用 1 μL 的共培养。
  3. 使用无菌钳子从模具中取出硅胶切口。
  4. 用无菌铲子从盘子中取下垫子。
    1. 将稍微弯曲的铲子滑到垫边缘下,同时将模具倒置,然后掉落到无菌的培养板盖上。
      注意:注意不要把垫子强迫出去,否则它会撕裂。跟踪垫的哪一侧是底部。
  5. 将垫与细菌细胞一起,底部向下,将 90° 角铲滑到垫下,并放在接种的盖玻片顶部。使用 90° 角铲使垫齐平,然后轻轻压出任何气泡。
  6. 去除湿巾中的多余的水分,然后放在盘子的边缘,确保它不会接触垫子。该示例现已准备好进行成像。

7. 为实时成像设置显微镜

  1. 在实验设置前将温度温度加热至37°C,至少2小时。
  2. 打开所有组件,包括显微镜、计算机和光源,用于亮场和荧光成像。
  3. 打开成像软件,确保光源已连接并运行。
  4. 执行 Köhler 照明27 以对齐所有图像平面。
    1. 首先,使用"虚拟"菜,以 20 倍的目标将标记的盖玻片集中到焦点上。确保冷凝器转塔设置为"打开"位置。
      注:应对每个独特的目标/样本执行 Köhler 照明,以正确对齐图像平面。但是,在低放大倍率上与"虚拟"盘进行聚焦和对齐可加快在较高放大倍率下对实时样品进行设置,以限制设置和实验开始时间之间的时间。
    2. 聚焦冷凝器。
      1. 关闭字段隔膜。
        注:应出现八角形光圈。如果冷凝器完全不聚焦,则整个视场 (FOV) 将显示为暗。
      2. 旋转冷凝器对焦旋钮,直到八角形边缘变脆。
        注:当图像平面接近正确的对齐时,光强将增加。
    3. 对齐冷凝器。
      1. 通过调整对齐旋钮居中现场冷凝器。
        注:八角形应居中至 FOV 的中间。对齐旋钮因显微镜而异。例如,有些显微镜冷凝器有旋钮,而另一些则有需要螺丝刀的螺钉。
    4. 聚焦灯丝并调整冷凝器孔径。
      1. 将相位望远镜或贝特朗透镜放入光路径中,以观察目标的后焦平面。
        注:应该有两个同心圆。
      2. 转动贝特朗镜头对焦旋钮,直到戒指看起来清晰。
      3. 从光路上拆下贝特朗镜头。
    5. 打开字段隔膜,直到八角形就在 FOV 的外面。
    6. 更改为 100 倍目标,在添加一滴浸入油之前将匹配的相环滑入到位,然后将准备好的样品盘放在顶部。
    7. 使用细菌样品盘在 100 倍目标上执行 Kühler 照明。
  5. 只关注使用微调的细菌。一旦 FOV 中的细菌通过目镜聚焦,通过按下显微镜上的相机按钮将光路切换到相机。
  6. 单击 映像软件 中的相位选项。
  7. 通过选择软件中的光源并手动输入要使用的所需光百分比或在光百分比刻度上滑动条形,调整发出的 DIA LED 光的百分比。
  8. 通过单击光源并手动输入所需的曝光时间或从提供的下拉菜单中选择曝光时间,调整 DIA LED 光照射时间。
    注:曝光时间因使用的相机而异。
  9. 如果使用荧光,通过单击感兴趣的荧光通道来调整每个相应通道(即 TxRed、GFP)中的摄像机设置。
    1. 设置发出的荧光光百分比,然后调整曝光时间(如 DIA LED 灯的步骤 7.7 和 7.8 所示)。
    2. 或者,通过选择可视化控件下拉菜单中的其他位深度选项之一,更改位深度以调整动态范围。
  10. 单击采集控制菜单中的 XY 选项,选择感兴趣的 XY 位置。
    1. 使用欢乐棒移动舞台位置,或者通过单击并拖动屏幕上的 FOV,然后单击空框以保存特定位置的 X 和 Y 坐标。
      注:建议选择不超过三个不同的 XY 位置,尽可能接近,用于延时采集。
  11. 单击采集控制菜单的 XY 选项卡上的 PFS 框或按下欢乐棒控制面板上的 PFS 按钮,打开完美的对焦系统 (PFS)。
  12. 旋转微调旋钮以聚焦细菌细胞。
  13. 单击每个 XY 位置的 PFS 按钮,一旦单元格处于所需的焦点平面。
    注:PFS 在延时实验中补偿 Z 轴中的漂移。这是保持细菌细胞在一段时间内的焦点所必需的。不同的制造商有不同的补偿制度。
  14. 通过从采集控制菜单中的选项中进行选择,选择图像采集条件,包括每个通道的采集间隔和频率(例如相位对比度和每个荧光波)。
    注:对于此处介绍的实验,相位对比度图像每 5-10 秒以间隔获取一次,而 GFP 和 TxRed 通道中的荧光图像每 20 分钟获取一次。
  15. 设置显微镜和采集设置后,开始成像。

8. 可选:活/死成像的修改

  1. 在 M8T 的 10 mL 中熔化 2% 的阿加罗斯,在 50°C 水浴中冷却至少 15 分钟。
  2. 在熔融的加糖中加入1 mM的碘化丙烯。
  3. 冷却后,在制备的模具中移液器 915 μL 的气糖。
  4. 将盖子放在开箱,让垫在室温下干燥30分钟。防止光线。
  5. 用盖子盖住盘子,在室温下再离开2小时。
  6. 准备湿度湿巾。
    1. 卷一个无绒纸擦拭。
    2. 将湿巾放在无菌培养皿中,并在湿巾中加入 500 μL 的无菌水。
    3. 在37°C下孵育1小时。
  7. 在37°C下孵育垫和无菌35毫米盘,1小时。
  8. 继续接种菜,如第6节所示:准备细菌细胞和接种垫。

9. 数据分析

  1. 细胞的标识
    1. 在映像软件中打开图像文件并裁剪该文件,以包括用于跟踪、放大到感兴趣的单元格以及仅在相位对比度通道中的帧。
      注意:裁剪的文件可以保存为一个新的文件,其中跟踪数据可以存储,而不会干扰原始文件。
    2. 选择在分析控制菜单中选择感兴趣区域 (ROI) 的选项,通过跟踪要用于分析的第一帧中的单个细菌细胞或细胞簇来定义 RBI。
      注意:可以手动定义 2 个 RBI 或作为二进制文件定义 2。
      1. 手动定义 ROI
        1. 跟踪每个细菌细胞或细胞群的周长,以手动定义 RO。
          注:在分析软件中 ,P.aeruginosa或其他棒状细胞,可以通过选择 椭圆ROI 并绘制一个调整为细菌细胞大小的椭圆来手动追踪。或者,可以选择 多边 形 ROI 选项来跟踪非传统形状的 ROI,如单元格群集。
      2. 识别二进制 RBI
        1. 单击二 进制 ROI 选项以定义二进制 ROI。
          注:对象在二元图层中定义,基于从相位对比度通道中较浅像素化背景分离的较暗像素化细菌细胞。
        2. 要对单元格进行阈值,请在 分析 控件菜单中选择"阈值"选项。选择感兴趣的通道并滑动荧光直方图中的条形图以调整阈值间隔值。
          注:通过对细菌细胞进行阈值,也可以在荧光图像中定义 2 元对象识别。阈值确定哪些荧光强度被视为对象,以及荧光强度构成背景。
  2. 单元格跟踪
    1. 要手动跟踪 ROI,请选择成像序列中的下一帧,然后通过单击并拖动每个 ROI 来调整 ROI 的位置,以与原始细菌细胞的新位置保持一致。
      注:如果细菌细胞没有改变位置,则不需要移动ROIS。
    2. 在要跟踪单元格的所有顺序帧中重复。
    3. 当细胞分裂时,将子细胞定义为新的 PI,如步骤 9.1 中所述,并开始跟踪新分裂的细胞。
      注:如果单元格标识为二进制文件,请使用 "跟踪二进制 文件"功能自动跟踪选定帧中的 2。
    4. 一旦通过所有选定的帧跟踪单元格,导出要分析的数据。
    5. 打开数据电子表格并识别分析所需的测量值(即对象速度、加速度或路径长度)。
      注:在测量定向性的情况下,需要路径长度和线长度测量。线长度是计算欧克利迪亚距离,或从轨道原点到 金海雷菌群边缘的直线距离 。路径长度是累积距离的度量,或所有帧的轨道段之和。定向度可以计算为欧克利迪亚距离、D(E) 、(线长度)在累积距离、D(A) 、(路径长度)上的比率。
  3. 荧光量化
    1. 定义荧光细菌细胞的 PI,如步骤 9.1 中所述。
    2. 对剩余荧光帧中的细菌细胞或聚类重复跟踪或移动 ROIS。
    3. 将生成的表导出到电子表格文件中以分析荧光强度。
    4. 在数据电子表格中,查找具有"平均强度"的列,该列表示跟踪细菌细胞 ROI 的平均荧光强度。
    5. 绘制平均强度值,查看荧光随时间的变化。
      注:荧光随时间的变化代表了荧光标记的感兴趣的基因的基因表达的波动。

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Representative Results

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成功使用所述方法将产生一系列帧,这些帧生成一个视频,其中可以随着时间的推移观察到物种间的交互。图1 中的示意图提供了一个可视化图,用于突出显示准备成像材料所涉及的关键步骤。这种方法的使用使得P.aeruginosa细胞在单一培养中表现出与S.aureus共同培养的不同行为。与单培养中仍分组在木筏中的P.aeruginosa细胞相比,当与金合子联合培养时,P.aeruginosa增加了单细胞对金合群的动性(图2A-2B)。-2B S. aureus荧光标记的细菌菌株也允许可视化细菌物种的混合种群。使用GP标签P.aeruginosa允许观察后,P.aeruginosa单细胞增加的活力,他们将包围并最终入侵S.金红菌落(图2C)。利用荧光标记细胞还允许首次对金红素菌群的P.aeruginosa细胞S. aureus入侵进行可视化(图2C,底部)。

虽然该协议生成用于观察物种间相互作用的高质量图像,但有几个常见问题可能导致帧序列质量差。实验期间湿度不一致,且焊盘干燥不正确是导致垫移和将细胞拖出 FOV(图3A)导致漂移的两个常见问题。湿度的变化会影响加糖垫的干燥性。湿度增加会使垫片太湿,使湿气在垫和玻璃底盘底部之间沉淀。水分留下一层足够厚的液体,使动体细胞蜂拥而至或游过,并且不会将细菌细胞保持在单个平面中。同时,湿度降低使垫干得更快,从而导致细胞在早期漂移。使用荧光这种方法的另一个常见错误是过于频繁地获取荧光图像或将细菌细胞暴露在荧光灯下的时间过长。荧光图像的短采集间隔会反复激发特定波长的高强度光的荧光。兴奋的荧光团然后与氧气发生反应,导致荧光团降解。由此产生的光漂白会消耗荧光,直到更多的荧光团可以表达和折叠,但不会伤害细菌细胞本身(图3B)。然而,荧光的丧失确实干扰了基因/蛋白质表达的测量,使细胞无标记,直到荧光团能够完全合成并再次兴奋。此外,与兴奋的荧光团相互作用的氧气可以形成活性氧物种(ROS)。这些ROS基然后损害细菌细胞,最终变得有毒,导致细胞死亡在几个细胞分裂内(图3C)。光漂白和光毒性的过程可以很容易地看到,因为细胞将首先完全失去荧光,并在随后的帧中,细胞将停止分裂,最终可能死亡(图3B-3C)。-3C设置实验时,最后一个常见问题是每个 FOV 的细胞太多,或者细胞彼此太近,通常相距小于 20 μm。第一帧中拥挤的单元格将产生分裂细胞的聚类,这些细胞在生长时只是相互合并,而不是相互作用。此外,距离距离太近的细胞可能没有足够的时间建立其他物种可以响应的分泌信号梯度(图3D),而遥远的细菌细胞可能没有机会在实验期间相遇。

图 4显示了如何通过向 agarose 垫添加碘化丙二的碘化物来可视化细菌细胞活力的示例。碘化丙二酸对活细胞不渗透,但可以进入膜受损的细胞,并结合到核酸。在这里,中日志GP标签WT S.金雷us治疗单独用介质或无细胞上继从P.aeruginosa衍生,并在治疗后立即成像。图像了三个不同的通道:相位、TxRed 和 GFP。明亮的绿色细胞表示活细胞积极表达GP,使用介质治疗的金黄色光病(图4A),红细胞表示死碘化物染色的金黄色细胞,经P.aeruginosa上上经治疗后(图4B)。 S. aureus虽然只显示一个时间点,但此方法可以调整,以确定延时实时成像期间的细胞生存能力。

可以执行几种成像后分析,以量化物种间相互作用的各个方面。例如,细胞跟踪可以提供P.aeruginosa单细胞运动对一组S.aureus的定向测量。单个P.aeruginosa细胞的运动从帧中跟踪,细胞离开木筏穿过细胞到达金红树簇的框架(图5A)。P. aeruginosa 筏S. 金雷乌斯星团之间的距离提供欧克利迪亚距离,D(E),而总轨道长度提供累积距离,D(A)(图 5B)。每个单元格的定向度计算为 D(E)/D(A) 的比率。在联合培养实验中,WT P. aeruginosa向 WT S. 金合二为一的定向度明显高于 S.agrBDCA,这是一种缺乏 Agr 调节分泌因子的突变体,先前被确定为向S. aureus24定向运动所必需的(图5C)。 S. aureus

Figure 1
图 1:映像设置协议的示意图。
细菌培养物和红糖垫制备关键步骤概述。使用BioRender.com创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:延时、活成像显微镜显示与S.aureus合作时P.aeruginosa行为的差异。
代表捕捉 P.aeruginosa( 杆菌,绿色)在单一栽培(A)和与 S.奥雷 乌斯(球菌,无标记)(B)联合栽培的镜头。(C) 荧光标记的细菌允许 可视化P.aeruginosa 单细胞入侵 S.奥雷乌斯 集群。相位对比度和 GFP 通道叠加(顶部)和 GFP 通道单独(底部)。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:常见成像问题的代表性快照,导致图像采集不良。
A) 不当干燥的垫子和不一致的湿度导致细胞在成像期间在FOV上漂移。每个框架(绿棒)中标记起立单元格的位置。(B) 光漂白从暴露在光下太久会消耗一段时间的可检测荧光水平,但不会杀死细胞。(C) 光毒性导致频繁暴露在光线下,导致细胞死亡。当细胞停止荧光并且不能分裂时,就可以看到光毒性的第一个迹象。(D) 高初始孵化组细胞在FOV和防止观察物种间相互作用。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:活体与死亡 S.红球细胞 的比较。
具有GFP标签的WT S. 金雷乌斯的代表性捕捉镜头单独使用介质(A) 或无细胞 P. aeruginosa 上一 液 ( B )治疗。治疗后,细胞立即被成像。活细胞(绿色)积极表达GP并排除碘化丙二,而死细胞(红色)失去GP荧光和膜渗透允许碘化丙二钠进入细胞并结合核酸。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:与古雷乌斯合作培养的P.aeruginosa细胞跟踪分析
此前,该方法用于与WT或+agrBDCA S.奥雷乌斯联合培养的WT P.aeruginosa进行细胞跟踪。(A) 与 S. aureus _ agrBDCA 合作培养的P. aeruginosa 单细胞轨道的表示S. aureusB) 用于确定定向度 (D(E) / D (A)的欧克利迪亚距离 (D (E) 和累积距离(D (A)测量的示意图(E)C) 与WT和+agrBDCA S.奥雷乌斯联合培养的单WTP. aeruginosa细胞的定向测量P. aeruginosa这个数字已经修改了从利莫利等人2019年24。请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件。 请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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此处介绍的方法描述了在单细胞水平上对细菌物种相互作用进行活细胞成像的协议,并修改其他应用,包括细胞跟踪和监测细胞生存能力。该方法为研究微生物与其他物种在联合培养中的单细胞行为开辟了新的途径。具体来说,该协议证明了这种共培养方法在观察细菌表面行为方面,特别是在研究具有表面和液体相关附体的活力的生物体时。例如,通过将细菌运动限制在单个焦点平面的表面,可以可视化 P. aeruginosa 对 S. aeruginosa 的增强和定向基 调节运动。

如前所述,使用这种成像方法获得最佳结果需要考虑多种条件,包括样品和成像仪器的温度和湿度(即目标和阶段)。有关更多提示和故障排除,请参阅补充文件 1。成功使用协议的一个关键步骤是制备加糖垫,因为干燥垫不足是最常见的问题之一。如图3A所示,如果焊盘干燥时间不够长,漂移出现在延时成像的开始,而干燥时间过长的焊盘开始收缩,细胞从FOV漂移出,进入成像几个小时。通过使用舞台顶培养箱和无绒湿湿巾,确保所有材料在实验期间以均匀的温度和湿度预热并保持,有助于减少漂移。还建议,在从模具转移到样品盘时,始终使用备用垫,以防第一个垫未正确干燥或撕裂。此外,重要的是使用低自荧光介质,既用于生长细菌培养和制作垫片,为了尽量减少背景荧光从介质时成像细胞。建议使用最小的介质进行显微镜检查,因为富媒体通常具有高自荧光。从低密度的 inoulum 开始,在 FOV 中细胞的空间分布均匀也是此方法的关键因素。具体来说,在评估P.aeruginosa和S.aureus相互作用的先前研究中,这允许细菌产生足够的分泌因子梯度,然后由在场的其他物种检测到(图2B)。

尽管这种方法具有优点,但也存在一些限制,包括其价格、低通量性质、荧光限制以及高度依赖控制环境条件。3B-3C显示了使用荧光显微镜的主要局限性。如结果部分所述,如果以较短的间隔捕获荧光图像,则可能发生光漂白和光毒性。为了避免这两种结果,荧光图像间隔应足够远,荧光灯照射时间尽可能低,以充分可视化荧光。此外,在确定荧光成像的间隔时,必须考虑每个荧光团的成熟时间。例如,图2、图3和图4所示的P.aeruginosaS.金雷us菌株中使用的荧Figure 3光团的成熟时间约为20分钟,因此每20分钟可以兴奋一次,而不关心潜在的光漂白效应。同时,这种方法的另一个缺点是,一旦细胞达到高细胞密度,就不允许观察晚期物种间相互作用。为了可视化单个细菌细胞,它们必须保持在一个焦点平面中。然而,一旦种群达到高细胞密度,细胞开始在多个平面中生长。

此方法可以修改,以研究不同的表型,如细胞活力(图4)和感兴趣的基因表达(数据未显示)。 图 4 显示了如何通过向 agarose 垫添加碘化丙二来调整该方法以可视化细菌生存能力的示例。该方法的另一个应用是通过荧光记者测量细菌基因/蛋白质表达在共同培养中。例如,多个荧光团可以并入质粒载体或细菌染色体,同时研究不同基因或蛋白质的表达。在这里,选择没有重叠的激发和发射光谱的荧光团非常重要。最后,在成像后分析中使用细菌细胞跟踪,可以计算方向性(图5)、速度和加速度等测量结果。

总体而言,这种根据前面描述的单一栽培协议改编的共培养成像方法增强了在共培养中可视化多种细菌物种行为的能力。这种方法提供了从混合培养的角度研究微生物的机会,这将增进对每个物种如何以单细胞方式改变其行为的理解,最终为细菌物种在多微生物环境中如何相互作用提供新的见解。

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Disclosures

提交人声明,他们没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了囊性纤维化基金会博士后过渡奖LIMOLI18F5(DHL)、囊性纤维化基金会初级教师招聘奖LIMOLI19R3(DHL)和NIH T32培训补助金5T32HL007638-34(ASP)的资助。我们感谢杰弗里·梅斯纳、明苏·金和伊森·加纳分享了成像和制作垫的初始协议和建议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass Cellvis D35-20-1.5-N One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes Kimberly-Clark Professional 06-666A
Low-Melt Agarose Nu-Sieve GTG/Lonza 50081 For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas VWR 82027-492
Round-Tapered Spatulas VWR 82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive Sigma-Aldrich S6685-25EA For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm Kord-Valmark /sold by RPI 2900
Tweezers VWR 89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose RPI G32045
KH2PO4 RPI P250500
MgSO4 Sigma-Aldrich 208094
NaCl RPI S23025
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
Tryptone BD Biosciences DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11 Andor 77026135 Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP Nikon 96372 Filter cube
Filter Cube TxRed Nikon 96375 Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER Okolab 77057447 Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking Nikon 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse Nikon Model Ti2-E Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) Nikon MRD00205 Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) Nikon MRD31905 Objective
ThermoBox with built-in fan heaters Tokai Hit TI2TB-E-BK Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) PMID: 7604262 Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) PMID: 23404398 USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide Invitrogen L7012 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit

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References

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单细胞物种间细菌相互作用的动力学可视化
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Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).More

Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).

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