Summary

单细胞物种间细菌相互作用的动力学可视化

Published: August 05, 2020
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Summary

这种活细菌细胞成像协议允许可视化多个细菌物种之间在一段时间的单细胞水平相互作用。延时成像允许在单一培养或联合培养中观察每个细菌物种,以询问多物种细菌群落中的外来物种相互作用,包括单个细胞的动性与生存能力。

Abstract

多微生物群落在自然界中无处不在,但研究它们在单细胞层面的相互作用是困难的。因此,已经开发出一种基于显微镜的方法,用于观察两种细菌病原体之间的物种间相互作用。使用这种方法来询问莫蒂克阴性病原体、 伪多多 尼亚和非莫蒂克呈阳性病原体 黄色葡萄球菌之间的相互作用。该协议包括在每个物种之间共同接种盖玻片和一个阿加罗斯垫,它维护细胞在一个平面,并允许在空间和时间细菌行为的可视化。

此外,这里演示的延时显微镜非常适合可视化两个或两个或更多细菌物种之间发生的早期相互作用,包括细菌物种在单一培养和与其他物种共培养中活动的变化。由于显微镜设置中样本空间有限,一旦细胞数量过高,此协议不太适用于研究细菌物种之间的后期相互作用。然而,该协议有许多不同的应用,包括使用染色成像活体和死细菌细胞,通过荧光报告器量化基因或蛋白质表达,以及跟踪细菌细胞在单一物种和多物种实验中的运动。

Introduction

多微生物群落在自然界中很常见,涵盖各种环境1、2、3,2,3和人类利基4、5。,5人类疾病中最臭名昭著的多微生物感染包括牙科生物膜,6、慢性伤口,7、8、慢性阻塞性肺79、呼吸机相关肺炎10、遗传性疾病囊性纤维化(CF)11、12。101112这些感染通常由不同的微生物物种组成;然而,最近出现了一个焦点,在革兰血球菌金黄色Staphylococcus aureus葡萄球菌和革兰阴性细菌伪多多莫尼亚之间的相互作用已经出现。包括与这些生物体合并的患者和体外分析在内的研究揭示了竞争和合作相互作用,这些相互作用对疾病进展、微生物生存、毒性、代谢和抗生素易感性有深刻和意想不到的影响(由 Hotterbeekx等人详细审查,2017年13和利莫利和霍夫曼20193)。

感染期间对物种间相互作用的兴趣日益增长,产生了研究多微生物社区行为的各种方法。通常,这些研究利用基于板材或肉汤的测定来研究单一栽培和共培养之间的表型差异。例如,在固体表面上的Coureing P. aeruginosa和S.金黄色金黄色,可以可视化生长抑制或菌落表型、色素或多糖生产的变化 14、15、16 。14,15,16混合物种生物膜,在生物或非生物表面,以及在液体培养中培养细菌物种,也能够测量生长变化,新陈代谢,抗生素耐受性,竞争和生存能力的变化,除了基因和蛋白质表达17,18。,18虽然这些大宗培养实验揭示了P.aeruginosaS.aureus在社区尺度上可能如何影响彼此,但它们无法回答有关单细胞水平相互作用的重要问题。此处介绍的方法通过关注联合培养社区中单个细胞的运动、细胞活力和基因表达的变化,为研究物种间相互作用的方法提供了补充。

单细胞相互作用可能与在细胞大社区中发生的相互作用大相径庭。通过单细胞分析,可以量化社区内的异质性,以研究细胞的空间放置如何影响社区动力学,或基因和蛋白质表达水平如何改变群体中个别成员。跟踪单元格还可以深入了解单个单元格在一段时间内如何移动和行为,通过多代。通过同时跟踪细胞运动和基因表达的变化,可以与基因波动和相应的表型进行关联。以前在单细胞水平上研究单个细菌物种的协议已经描述。这些研究利用活成像细胞在一个平面上的时间,并一直可用于观察表型,如细胞分裂和抗生素易感性19,20。19,额外的活成像显微镜已被用于监测生长,运动,表面殖民化和生物膜形成的单一细菌物种21,22,23。21,22,23然而,虽然这些研究对单一培养中的细菌生理学有见地,但观察多种细菌在联合培养中单细胞行为的实验是有限的。

在这里,以前用于单物种成像的协议已被改编为研究 P.aeruginosaS.aureus之间的相互作用。这些生物体可以根据细胞形态在相位对比下分化(P.aeruginosa 是杆菌 ,S.金合是 球菌)。此方法的发展最近使 P.aeruginosa在S.aureus24 存在的情况下, 能够可视化以前未描述的动能行为P. aeruginosa 被发现能够从远处感应 到 S. aureus, 并且对 S. aureus 细胞群的增强和定向运动作出反应。 P. aeruginosa 运动对 S. aureus 被发现需要类型 IV 皮利 (TFP), 头发一样的预测, 其协调的延伸和缩回产生一个运动称为抽搐运动25.

这些研究证明了这种方法对于询问物种之间早期相互作用的效用。然而,由于无法再识别单个细胞层的高细胞密度在后期相互作用时间点进行成像是很困难的,这主要在成像后分析期间造成问题。鉴于这一限制,该方法最适合早期相互作用,然后可以跟进传统的宏观测定,在代表后期相互作用的较高细胞密度。此方法的其他限制包括低通量性质,因为一次只能成像一个样品,以及显微镜、相机和环境室的成本。此外,荧光显微镜对细菌细胞(如光毒性和光漂白)构成风险,因此限制了荧光图像获取的频率。最后,此方法中使用的气糖垫极易受到环境变化的影响,因此,由于如果条件不正确,垫片可以开始收缩或膨胀,因此控制温度和湿度等条件至关重要。最后,虽然这种方法不模仿宿主环境,但它为不同细菌物种在表面上的反应提供了线索,这些线索可以在旨在模拟环境/宿主条件的测定中跟进。

这种方法不同于先前跟踪单细胞运动的研究,因为细胞在盖玻片和红糖垫之间接种,将细胞限制在表面。这允许在单个平面中随着时间的推移进行细胞跟踪;然而,当细胞浸入液体26中时,观察到的瞬态表面接触周期有限。在气糖垫下成像细菌的一个好处是,它模仿了基于大微量板的地下接种测定,经典地用于检查 P.aeruginosa 抽搐运动25。在这项检测中,细菌细胞在培养皿底部和阿加之间接种,使细胞在从接种点向外穿过培养皿底部时保持单个平面,就像这种显微镜协议一样。

此处介绍的用于可视化物种间相互作用的延时显微镜方案包括 1) 制备细菌样本和 agarose 垫,2) 选择显微镜设置进行成像采集,3) 成像后分析。可以通过以相位对比度在短时间内采集图像来执行细胞移动和跟踪的详细可视化。荧光显微镜也可用于确定细胞的生存能力或基因表达随着时间的推移。在这里,我们展示一个通过向气量染料添加到气垫中来适应荧光显微镜的例子。

Protocol

注:此协议中所有耗材的完整说明和目录号见材料表。 1. M8T 最小介质的制备 通过溶解 64 g Na 2 HPO4 +7H 2O、15g KH2PO42和 2.5 g NaCl 在 800 mL 的超纯水 (UPW,电阻率 18 MΩ/cm) 中,准备 1 L 的 M8 最小盐基 (5 倍)。pH 到 7.6。使用 UPW 将音量完全达到 1 L。自动挡 45 分钟 通过将 1 L 400 mL UPW 中的 100 g 葡萄糖溶解,准备 500 mL 的葡萄…

Representative Results

成功使用所述方法将产生一系列帧,这些帧生成一个视频,其中可以随着时间的推移观察到物种间的交互。图1 中的示意图提供了一个可视化图,用于突出显示准备成像材料所涉及的关键步骤。这种方法的使用使得P.aeruginosa细胞在单一培养中表现出与S.aureus共同培养的不同行为。与单培养中仍分组在木筏中的P.aeruginosa细胞相比,当与金合子联合培养…

Discussion

此处介绍的方法描述了在单细胞水平上对细菌物种相互作用进行活细胞成像的协议,并修改其他应用,包括细胞跟踪和监测细胞生存能力。该方法为研究微生物与其他物种在联合培养中的单细胞行为开辟了新的途径。具体来说,该协议证明了这种共培养方法在观察细菌表面行为方面,特别是在研究具有表面和液体相关附体的活力的生物体时。例如,通过将细菌运动限制在单个焦点平面的表面,可?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了囊性纤维化基金会博士后过渡奖LIMOLI18F5(DHL)、囊性纤维化基金会初级教师招聘奖LIMOLI19R3(DHL)和NIH T32培训补助金5T32HL007638-34(ASP)的资助。我们感谢杰弗里·梅斯纳、明苏·金和伊森·加纳分享了成像和制作垫的初始协议和建议。

Materials

Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass Cellvis D35-20-1.5-N One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes Kimberly-Clark Professional 06-666A
Low-Melt Agarose Nu-Sieve GTG/Lonza 50081 For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas VWR 82027-492
Round-Tapered Spatulas VWR 82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive Sigma-Aldrich S6685-25EA For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm Kord-Valmark /sold by RPI 2900
Tweezers VWR 89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose RPI G32045
KH2PO4 RPI P250500
MgSO4 Sigma-Aldrich 208094
NaCl RPI S23025
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
Tryptone BD Biosciences DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11 Andor 77026135 Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP Nikon 96372 Filter cube
Filter Cube TxRed Nikon 96375 Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER Okolab 77057447 Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking Nikon 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse Nikon Model Ti2-E Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) Nikon MRD00205 Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) Nikon MRD31905 Objective
ThermoBox with built-in fan heaters Tokai Hit TI2TB-E-BK Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) PMID: 7604262 Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) PMID: 23404398 USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide Invitrogen L7012 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit

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Cite This Article
Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).

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