Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

doi: 10.3791/61376 Published: August 5, 2020
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

Abstract

קהילות פולימיקרוביאליות נמצאות בכל מקום בטבע, אך לימוד האינטראקציות שלהן ברמת התא הבודד קשה. לכן, שיטה מבוססת מיקרוסקופ פותחה להתבוננות אינטראקציות בין מינים בין שני פתוגנים חיידקיים. השימוש בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות בין פתוגן גראם שלילי תו לא, פסאודומונס aeruginosa ופתוגן גראם-חיובי שאינו מוטיב, Staphylococcus aureus מדגים כאן. פרוטוקול זה מורכב מאחסון משותף של כל מין בין כיסוי לבין משטח agarose, אשר שומר על התאים במטוס אחד ומאפשר הדמיה של התנהגויות חיידקים הן במרחב והן בזמן.

יתר על כן, המיקרוסקופ הזמן לשגות הפגינו כאן הוא אידיאלי עבור הדמיית אינטראקציות מוקדמות המתקיימות בין שני מינים חיידקיים או יותר, כולל שינויים בתנועבת מינים חיידקיים במונוקולטורה ובcoculture עם מינים אחרים. בשל אופיו של שטח המדגם המוגבל בהגדרת המיקרוסקופ, פרוטוקול זה פחות ישים ללימוד אינטראקציות מאוחרות יותר בין מינים חיידקיים ברגע שאוכלוסיות התאים גבוהות מדי. עם זאת, ישנם מספר יישומים שונים של הפרוטוקול הכוללים את השימוש בכתמים עבור הדמיה תאים חיידקיים חיים ומתים, כימות של ביטוי גנים או חלבון באמצעות כתבים פלורסנט, ומעקב אחר תנועת תאים חיידקיים בשני מינים בודדים וניסויים מרובי מינים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קהילות פולימיקרוביאליות נפוצות בטבע, המשתרעות על פני מגוון רחב שלאיכות הסביבה 1,,2,,3 ונישות אנושיות 4,,5. חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הידועים לשמצה ביותר במחלה האנושית כוללים ביופילםדנטלי 6,פצעים כרוניים 7,8 ,וזיהומיםבדרכי הנשימה באנשים עם מחלתריאות חסימתית כרונית 9, דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה10, ואת המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF)11,12. זיהומים אלה מורכבים לעתים קרובות של מינים מיקרוביאליים מגוונים; עם זאת, לאחרונה להתמקד באינטראקציות בין החיידק גראם חיובי Staphylococcus aureus ואת החיידק גראם שלילי פסאודומונס aeruginosa הגיח. מחקרים הכוללים חולים הנגועים באורגניזמים אלה וניתוחים במבחנה חושפים הן אינטראקציות תחרותיות והן אינטראקציות שיתופיות שיכולות להיות השפעות עמוקות ובלתי צפויות על התקדמות המחלה, הישרדות מיקרוביאלית, ויריות, חילוף חומרים, ורגישותלאנטיביוטיקה (נבדקבפירוט על ידי Hotterbeekx ואח '. 201713 ו לימולי והופמן 2019 3 ).

העניין הגובר באינטראקציות בין מינים במהלך הזיהום הניב מגוון שיטות לחקר התנהגויות קהילתיות פולמיקרוביאליות. בדרך כלל, מחקרים אלה השתמשו צלחת או מבוסס מרק ים כדי לחקור את ההבדלים פנוטיפיים בין monoculture וcoculture. לדוגמה, coculturing P. aeruginosa ו S. aureus על משטחים מוצקים אפשרה הדמיה של עיכוב צמיחה או שינויים בפנוטיפ המושבה, פיגמנט, או פוליסכרידייצור 14,15,16. מינים מעורבים biofilms, על משטחים ביוטיים או abiotic, כמו גם coculturing מינים חיידקיים בתרבות נוזלית גם אפשר מדידה של שינויים בצמיחה, חילוף החומרים, סובלנות לאנטיביוטיקה, תחרות וכדאיות, בנוסףלביטוי גנים וחלבון 17,18. בעוד ניסויי תרבות בתפזורת אלה חשפו תובנה כיצד P. aeruginosa ו S. aureus עשויים להשפיע אחד על השני בקנה מידה קהילתי, הם אינם מסוגלים לענות על שאלות חשובות על האינטראקציות המתקיימות ברמה של תא יחיד. השיטה המוצגת כאן מוסיפה לגישות לחקר אינטראקציות בין-מינים על ידי התמקדות בשינויים בתנועה, בכדאיות התא ובביטוי הגנים של תאים בודדים בתוך קהילה מקוטפת לאורך זמן.

אינטראקציות של תאים בודדים עשויות להיות שונות באופן נרחב מהאינטראקציות המתקיימות בקהילה בתפזורת של תאים. באמצעות ניתוח של תאים בודדים, ניתן לכמת הטרוגניות בתוך קהילה כדי ללמוד כיצד מיקום מרחבי של תאים משפיע על הדינמיקה הקהילתית או כיצד רמות ביטוי גנים וחלבונים משתנות בתוך חברים בודדים בקבוצה. תאי מעקב יכולים גם לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים בודדים נעים ומתנהגים לאורך זמן, דרך דורות מרובים. על ידי מעקב אחר תנועת תאים ושינויים בביטוי גנים בו זמנית, ניתן לבצע מתאם בין תנודות גנים ופנוטיפים מתאימים. פרוטוקולים קודמים לחקר מינים חיידקיים בודדים ברמת תא אחד תוארו. מחקרים אלה לנצל את תאי הדמיה חיים לאורך זמן במטוס אחד, היו שימושיים להתבוננות פנוטיפים כמו חלוקת תאיםורגישות אנטיביוטית 19,20. מיקרוסקופ הדמיה חיה נוספת נוצלה כדי לפקח על צמיחה, תנועה, קולוניזציה פני השטח היווצרות biofilm של מינים חיידקיים יחיד21,22,23. עם זאת, בעוד מחקרים אלה היו תובנה להבנת הפיזיולוגיה של חיידקים במונוקולטורה, ניסויים להתבוננות בהתנהגות חד-תאית של מינים חיידקיים מרובים לאורך זמן coculture מוגבלים.

כאן, פרוטוקולים קודמים המשמשים להדמיה חד-מינית הותאמו לאינטראקציות מחקר בין P. aeruginosa ו S. aureus. אורגניזמים אלה ניתן להבדיל תחת ניגודיות שלב בהתבסס על מורפולוגיות התא שלהם(P. aeruginosa הם bacilli ו S. aureus הם cocci). פיתוח שיטה זו אפשר לאחרונה את ההדמיה של התנהגויות תנועתיות שלא ייחסנו בעבר של P. aeruginosa בנוכחות S. aureus24. P. aeruginosa נמצא מסוגל לחוש S. aureus ממרחק ולהגיב עם תנועות מוגברות וכיוון תא יחיד כלפי אשכולות של S. aureus תאים. P. aeruginosa תנועה לכיוון S. aureus נמצא לדרוש את הסוג IV pili (TFP), תחזיות כמו שיער אשר הארכה מתואמת ונסיגה ליצור תנועה הנקראת תנועתיות עוויתות25.

מחקרים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו לחקר אינטראקציות קודמות בין מינים. עם זאת, הדמיה בצפיפות תאים גבוהה בנקודות זמן אינטראקציה מאוחרת יותר קשה בהתחשב בכך ששכבות בודדות של תאים כבר לא ניתן לזהות, אשר בעיקר מציב בעיות במהלך ניתוח שלאחר הדמיה. בהינתן מגבלה זו, השיטה מתאימה ביותר לאינטראקציות קודמות שניתן היה לעקוב אחריהן עם בדיקות מאקרו-סקופיות מסורתיות בצפיפות תאים גבוהה יותר המייצגות אינטראקציות מאוחרות יותר. מגבלות נוספות של שיטה זו כוללות את אופי התפוקה הנמוכה, שכן רק מדגם אחד ניתן למצוא בכל פעם ואת העלות של מיקרוסקופ, מצלמה, ותא סביבתי. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהווה סיכונים לתאים חיידקיים כמו פוטוטוקסיסיטי ופוטו-בליבקינג, ולכן מגביל את התדירות שניתן לרכוש תמונות פלואורסצנטיות. לבסוף, רפידות agarose בשימוש בשיטה זו רגישים מאוד לשינויים בסביבה, מה שהופך אותו קריטי כדי לשלוט בתנאים כמו טמפרטורה ולחות, בהתחשב בכך רפידות יכול להתחיל להתכווץ או להרחיב אם התנאים אינם נכונים. לבסוף, בעוד שיטה זו אינה מחקה את הסביבה המארחת, היא מספקת רמזים כיצד מינים חיידקיים שונים מגיבים על משטחים, אשר ניתן לעקוב אחר בהם בתרופות שנועדו לחקות תנאים סביבתיים/מארחים.

שיטה זו שונה ממחקרים קודמים מעקב אחר תנועת תא יחיד, כי תאים מחוסנים בין כיסוי כרית agarose, הגבלת תאים אל פני השטח. הדבר מאפשר מעקב אחר תאים לאורך זמן במטוס יחיד; עם זאת, מגביל מחזורים של מעורבות משטח ארעי שנצפו כאשר תאים שקועים בנוזל26. יתרון נוסף של חיידקים הדמיה תחת כרית agarose הוא כי הוא מחקה את החיסון מבוסס צלחת מאקרוסקופית תת משטח אומר קלאסי משמש כדי לבחון P. aeruginosa עוויתותתנוענות 25. בהסכם זה, תאים חיידקיים מחוסנים בין החלק התחתון של צלחת פטרי ואת agar, שמירה על התאים במטוס אחד כפי שהם נעים על פני החלק התחתון של הצלחת כלפי חוץ מנקודת של חיסונים, ממש כמו פרוטוקול מיקרוסקופי זה.

פרוטוקול מיקרוסקופ זמן לשגות להדמיה אינטראקציות בין מינים המוצגים כאן מורכב 1) הכנת מדגם חיידקים וpad agarose, 2) בחירת הגדרות מיקרוסקופ עבור רכישת הדמיה 3) ניתוח שלאחר הדמיה. הדמיה מפורטת של תנועת תאים ומעקב יכולה להתבצע על ידי רכישת תמונות במרווחי זמן קצרים לפי ניגודיות שלב. מיקרוסקופ פלואורסץ יכול גם להיות מנוצל כדי לקבוע את הכדאיות של תאים או ביטוי גנים לאורך זמן. כאן, אנו מציגים דוגמה אחת של הסתגלות למיקרוסקופ פלואורסנצטי באמצעות תוספת של צבעי כדאיות רפידות agarose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: ניתן למצוא תיאור מלא ומספרי קטלוג עבור כל החומרים ההספקיים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה מינימלית M8T

  1. הכן 1 L של בסיס מלחים מינימלי M8 (5x) על ידי המסת 64 גרם של Na2HPO4·7H2O, 15 גרם של KH2PO4, ו 2.5 גרם NaCl ב 800 מ"ל של מים אולטרה פוריים (UPW, התנגדות 18 MΩ / ס"מ) בבקבוק 2 L. pH to 7.6. השלם את אמצעי האחסון ל- 1 L עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
  2. הכן 500 מ"ל של תמיסת גלוקוז (20% עם רוחב) על ידי המסת 100 גרם גלוקוז ב-400 מ"ל של UPW בבקבוק 1 L. פתרון מלא ל-500 מ"ל עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
  3. הכן 500 מ"ל של פתרון טריפטון (20% עם רוחב) על-ידי המסת 100 גרם של טריפטון ב-400 מ"ל של UPW. השלם עד 500 מ"ל עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
  4. הכן 1 L של M8 + 10% טריפטון (M8T) מדיה מינימלית על ידי הוספת 200 מ"ל של 5x M8 מלחים מינימליים (1x סופי), 10 מ"ל של 20% גלוקוז (0.2% סופי), 1 מ"ל של 1 M MgSO4 (1 mM הסופי), ו 50 מ"ל של 20% טריפטון (1% סופי) כדי 600 מ"ל של UPW. השלם ל- 1 L עם UPW. סנן דרך מסנן סטרילי 0.2 μm לתוך בקבוק אחסון מדיה סטרילי 500 מ"ל.

היום הראשון:

2. הכנת תרביות לילה בקטריאליות

  1. לחסן 5 מ"ל של M8T מדיה מינימלית עם מושבה אחת של P. aeruginosa או S. aureus (כולל אנטיביוטיקה בעת הצורך) דגירה לילה ב 37 ° C עם aeration במשך לא יותר מ 16 שעות.
    הערה: הפתוגנים החיידקיים P. aeruginosa ו S. aureus שימשו לשיטה זו, כי הם בדרך כלל coisolated מזיהומים כרוניים, וללמוד את האינטראקציות שלהם חשוב להבין איך הם תורמים לתוצאות המטופל במהלך זיהומים polymicrobial. מינים חיידקיים אחרים יכולים לשמש בהתאם למיקוד המחקר.

היום השני:

3. תת תרבות של זנים חיידקיים

  1. תת תרבות P. aeruginosa 1:500 ו S. aureus 1:1000 ב 5 מ"ל של M8T טרי (כולל אנטיביוטיקה בעת הצורך). דגירה עם aeration ב 37 °C עד תרבויות להגיע לשלב אמצע יומן (OD600 = ~ 0.3 - 0.5).

4. הכנת חומרים לתבניות פד

  1. הכן את מרית המתכת על ידי חימום קצה של מרית מעבדה שטוחה ומעוגלת עם מבער בונזן עד שניתן יהיה לכופף חצי מהסוף השטוח לזווית של 90 מעלות. מחממים את הקצה של מרית מעבדה שטוחה ומעוגלת ומעט מכופפת את 10 מ"מ האחרונים לזווית של 45 מעלות צלזיוס.
  2. חותכים את ארבע הפינות של תבניות הסיליקון כך שהתבניות יתאימו לצלחת של 35 מ"מ.
  3. לחטא את המריבות וזוג פינצטה על ידי הוספת 70% אתנול והעברתם דרך הלהבה של מבער Bunsen.
  4. נקה את התבניות והסיליקון עם 70% אתנול וייבש אותן במגבונים ללא מוך.

5. הכנת רפידות אגרוז

הערה: הרפידות מוכנות עם M8T מדיה מינימלית כמקור מתזונה עבור החיידקים המשמשים בפרוטוקול זה. עם זאת, החומרים המזינים המשמשים רפידות ניתן לשנות עבור אורגניזמים שונים.

  1. להמיס 2% agarose נמוך להמיס ב 10 מ"ל של M8T בקבוקון נקי 50 מ"ל ארלנומאייר. מיקרוגל במרווחים קצרים (2-5 s) עד agarose הוא בתמיסה על מנת למנוע את התוכן של הבקבוקון רותח מעל. לאחר ההתמוססות, יש להתקרר באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות.
  2. מכינים את התבניות על ידי יישור גזרת הסיליקון עם הפתח בצלחת 35 מ"מ והקש קלות עם מרית כדי לאבטח את הסיליקון לצלחת, ולהסיר את כל בועות האוויר בין התבנית לצלחת.
  3. ברגע קירור, פיפטה 915 μL של agarose מותך לתוך התבנית. השאירו את המכסה פתוח ותנו למשטח להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. מכסים את המנה במכסה ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות נוספות.
  5. מכינים מגבונים לחות על ידי גלגול הדוק של מגבון ללא מוך. מניחים את המגבונים המגולגלים בתוך צלחת פטרי סטרילית ומוסיפים באופן שווה 500 μL של מים סטריליים על פני המגבונים. חם עד 37°C לשעה אחת.
  6. מחממים את המשטח וצלחת סטרילית של 35 מ"מ ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

6. הכנת תאים חיידקיים ותחבושות לחסן

  1. מדוד את מנת ה- OD600 של כל תת-תרבות ודילל P. aeruginosa ל- OD600 = 0.03 ו- S. aureus ל- OD600 = 0.10 ב- M8T שחמם מראש ל- 37°C. מערבבים את פ. ארוגינוזה וס. אאוראוס ביחס של 1:1 ומערבולת.
    הערה: אם זנים דורשים אנטיביוטיקה, ניתן להוסיף את האנטיביוטיקה לבין הלילה ותת-תרבות, אך אין להוסיף בעת ערבוב מינים להדמיה אם זה משפיע על מינים אחרים בcoculture. יציבות Plasmid ואת ההשפעות של אנטיביוטיקה על כל המינים coculture יצטרך להיקבע עבור כל אורגניזם / plasmid בשימוש.
  2. פיפט 1 μL של coculture באופן שווה על פני החלק התחתון של צלחת מחומם מראש, סטרילי 35 ממ כיסוי זכוכית.
  3. מוציאים את גזור הסיליקון מהתבנית בעזרת פינצטה סטרילית.
  4. מוציאים את המשטח מהצלחת באמצעות מירה סטרילית.
    1. מחליקים את המרית המעופפת מעט מתחת לקצה המשטח, תוך החזקת התבנית הפוכה, כדי להפיל אותה על מכסה צלחת פטרי סטרילי.
      הערה: תקפיד לא לכפות את המשטח החוצה או שהוא יקרע. עקוב אחר איזה צד של המשטח הוא התחתון.
  5. מעבירים את המשטח לצלחת עם התאים החיידקיים, בצד התחתון כלפי מטה, על ידי החלקת המרית בזווית של 90° מתחת למשטח והנחתה מעל כיסוי המחוסס. השתמשו במיתית הזוויתית של 90° כדי לגרום למשטח לשטוף את המכסה וללחוץ בעדינות על בועות אוויר.
  6. מסירים לחות עודפת מגבונים לחים ואז מניחים סביב קצה הצלחת, ומוודאים שהיא לא נוגעת במשטח. הדגימה מוכנה כעת להדמיה.

7. הגדרת המיקרוסקופ להדמיה חיה

  1. תא סביבתי חם ל 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני ההגדרה ניסיונית.
  2. הפעל את כל הרכיבים כולל מיקרוסקופ, מחשב ומקורות אור עבור הדמיית שדה בהיר ופלואורסצינטי.
  3. פתח את תוכנת ההדמיה וודא שמקורות האור מחוברים ופעלים.
  4. בצע תאורה Köhler27 כדי ליישר את כל מישורים תמונה.
    1. ראשית, להביא כיסוי מסומן לפוקוס עם מטרה 20x באמצעות צלחת "דמה". ודא צריח העיך מוגדר למיקום "פתוח".
      הערה: יש לבצע תאורת Köhler עבור כל מטרה/דוגמה ייחודית כדי ליישר כראוי את מיות התמונה. עם זאת, מיקוד ויישור עם צלחת "דמה" על הגדלה נמוכה מזרז את ההגדרה על דגימות חיות בהגדלה גבוהה יותר כדי להגביל את הזמן בין הגדרה וזמן התחלה ניסוי.
    2. תמקד את העיך.
      1. סגור את הסרעפת של השדה.
        הערה: צמצם בצורת מתומן אמור להופיע. אם העיב אינו בפוקוס לחלוטין, שדה התצוגה כולו (FOV) יופיע כהה.
      2. סובבו את ידיות המיקוד של העיב עד שהקצוות המתומן פריכים.
        הערה: עוצמת האור תגדל ככל שמישורים התמונה יתקרבו ליישור הנכון.
    3. יישר את העיך.
      1. מרכז את עיך השדה על-ידי כוונון ידיות היישור.
        הערה: המתומן צריך להיות מרוכז באמצע FOV. ידיות היישור משתנות בהתאם למיקרוסקופ. לדוגמה, לעיבים מסוימים של מיקרוסקופים יש ידיות, בעוד שלאחרים יש ברגים הדורשים מנהל ברגים.
    4. מקד את נימה המנורה והתאם את הצמצם של העיב.
      1. הזמן טלסקופ פאזה או עדשת ברטרנד בנתיב האור כדי לצפות ב מישור המוקד האחורי של המטרה.
        הערה: צריכים להיות שני מעגלים קונצנטריים.
      2. הפעל את ידית המיקוד של עדשת ברטרנד עד שהטבעות ייראו חדות.
      3. הסר את עדשת ברטרנד משביל האור.
    5. פתח את הסרעפת של השדה עד שהתומן נמצא ממש מחוץ ל-FOV.
    6. שנה ליעד 100x והחלק את טבעת השלבים התואמת למקומה לפני הוספת טיפה של שמן טבילה, והכנס את צלחת המדגם המוכנה מעל.
    7. בצע תאורה Köhler על המטרה 100x עם צלחת מדגם חיידקים.
  5. התמקדו בחיידקים באמצעות ההתאמה העדינה בלבד. ברגע שהחיידקים ב-FOV מתמקדים דרך העינית, החלף את נתיב האור למצלמה על ידי לחיצה על לחצן המצלמה במיקרוסקופ.
  6. לחץ על האפשרות שלב בתוכנה להדמיה.
  7. התאם את אחוז אור ה-LED הנפלט על-ידי בחירת מקור האור בתוכנה והזנה ידנית של אחוז האור הרצוי לשימוש או החלקה של הסרבל בסולם אחוזי האור.
  8. התאם את זמן החשיפה לאור LED DIA על-ידי לחיצה על מקור האור והזן ידני של זמן החשיפה הרצוי או בחירת זמן חשיפה מהתפריט הנפתח שסופק.
    הערה: זמן החשיפה ישתנה בהתאם למצלמה בה נעשה שימוש.
  9. אם אתה משתמש בפלואורסצנטי, התאם את הגדרות המצלמה בכל ערוץ מתאים (כלומר, TxRed, GFP), על-ידי לחיצה על ערוץ הפלורסנט של עניין.
    1. הגדר את אחוז אור הפלואורסץ הנפלט ולאחר מכן התאם את זמן החשיפה (כפי שבוצע בשלבים 7.7 ו- 7.8 עבור תאורת LED DIA).
    2. לחלופין, שנה את עומק הסיביות כדי להתאים את הטווח הדינאמי על-ידי בחירת אחת מאפשרויות עומק הסיביות האחרות בתפריט הנפתח פקדי פריטים חזותיים.
  10. בחר את עמדות העניין של XY על-ידי לחיצה על האפשרות XY בתפריט פקדי הרכישה.
    1. הזז את מיקום הבמה עם מקל השמחה, או על-ידי לחיצה וגרירה של ה-FOV על המסך, ולחץ על התיבה הריקה כדי לשמור את קואורדינטות X ו- Y של מיקום ספציפי.
      הערה: בחירה של לא יותר משלוש עמדות XY שונות, קרוב ככל האפשר זה לזה, מומלצת לרכישת זמן-לשגות.
  11. הפעל את מערכת המיקוד המושלמת (PFS) על-ידי לחיצה על התיבה PFS בכרטיסיה XY בתפריט בקרת הרכישה או לחיצה על לחצן PFS בלוח הבקרה של מקל השמחה.
  12. סובב את ידיות ההתאמה העדינות כדי להתמקד בתאים החיידקיים.
  13. לחץ על לחצן PFS עבור כל מיקום XY, לאחר שהתאים נמצאים בכיוון המוקד הרצוי.
    הערה: PFS מפצה על הסחף בציר Z במהלך ניסויי זמן-לשגות. זה הכרחי כדי לשמור על המיקוד של תאים חיידקיים לאורך זמן. לייצורים שונים יש מערכות פיצוי שונות.
  14. בחר את תנאי רכישת התמונה, כולל מרווח רכישה ותדירות עבור כל ערוץ (לדוגמה, ניגודיות פאזה וכל פלואורופור) על-ידי בחירה מתוך האפשרויות בתפריט פקדי הרכישה.
    הערה: עבור הניסויים המוצגים כאן, תמונות ניגודיות שלב נרכשות במרווחי זמן כל 5-10 s בעוד תמונות פלואורסץ בערוצים GFP ו TxRed נרכשים כל 20 דקות.
  15. התחל בהדמיה לאחר הגדרת הגדרות המיקרוסקופ ורכש.

8. אופציונלי: שינויים עבור הדמיה חיה/מתה

  1. להמיס 2% agarose ב 10 מ"ל של M8T ולתת להתקרר 50 מעלות C אמבט מים לפחות 15 דקות.
  2. הוסף 1 מ' של פרודיד פרופידיום לאגרוז המותך.
  3. לאחר התקרר, פיפטה 915 μL של agarose בתבנית מוכנה.
  4. משאירים את המכסה פתוח ותנו למשטח להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הגן מפני אור.
  5. מכסים את המנה במכסה ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות נוספות.
  6. הכן מגבונים לחות.
    1. מגלגלים נייר ללא מוך לנגב בחוזקה.
    2. מניחים את המגבונים בצלחת פטרי סטרילית ומוסיפים 500 μL של מים סטריליים לנגב.
    3. דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
  7. דגירה את המשטח וצלחת סטרילית 35 מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות.
  8. המשיכו לחסן את המנה כפי שצוין בסעיף 6: הכנת תאים חיידקיים ותחבושות מחסן.

9. ניתוח נתונים

  1. זיהוי תאים
    1. פתח קובץ תמונה בתוכנת ההדמיה וחתוך את הקובץ כך שיכלול רק את המסגרות שישמשו למעקב, מוגדל לתאי העניין ורק בערוץ ניגודיות השלבים.
      הערה: ניתן לשמור את הקובץ החתוך כקובץ חדש שבו ניתן לאחסן נתוני מעקב מבלי להפריע לקובץ המקורי.
    2. בחר באפשרות לבחור אזורי עניין (ROI) בתפריט פקדי ניתוח ולהגדיר ROIs על-ידי מעקב אחר תאים חיידקיים בודדים או אשכולות של תאים במסגרת הראשונה שישמש לניתוח.
      הערה: ניתן להגדיר את ROIs באופן ידני או כאריכים בינאריים.
      1. הגדרה ידנית של ROI
        1. עקוב אחר ההיקף של כל תא חיידקי בודד או אשכולות של תאים כדי להגדיר באופן ידני את ROIs.
          הערה: בתוכנה לניתוח, P. aeruginosa, או תאים אחרים בצורת מוט, ניתן לעקוב באופן ידני על ידי בחירת ROI אליפסה וציור אליפסה מותאמת לגודל התא החיידקי. לחלופין, ניתן לבחור באפשרות Polygon ROI כדי לעקוב אחר ROIs שאינם בצורת מסורתית, כגון אשכולות של תאים.
      2. זיהוי ROIs בינארי
        1. לחץ על האפשרות בינארי ל- ROI כדי להגדיר ROIs בינארי.
          הערה: אובייקטים מוגדרים בשכבה בינארית המבוססת על הפרדת תאים חיידקיים כהים יותר מרקע מפוקסל בהיר יותר בערוץ ניגודיות הפאזה.
        2. כדי לסף את התאים, בחר באפשרות סף בתפריט פקדי ניתוח. בחר את ערוץ העניין והחלק את הסורגים בהיסטוגרמה הפלואורסצית כדי להתאים את ערכי מרווח הסף.
          הערה: זיהוי אובייקט בינארי עבור ROIs יכול להיות מוגדר גם בתמונות פלורסנט על-ידי סף התאים החיידקיים. סף קובע אילו עוצמות פלואורסץ נחשבות לאובייקטים ואיזה עוצמות פלואורסץ מהוות את הרקע.
  2. מעקב אחר תאים
    1. כדי לעקוב באופן ידני אחר ROIs, בחר את המסגרת הבאה ברצף ההדמיה והתאם את מיקום ה-ROIs על-ידי לחיצה וגרירה של כל החזר השקעה כדי ליישר קו עם המיקום החדש של התא החיידקי המקורי.
      הערה: אם התאים החיידקיים לא שינו את המיקום, אין צורך להעביר את ה-ROIs.
    2. חזור על הפעולה בכל המסגרות הריצה שעבורן יש לעקוב אחר תאים.
    3. כאשר התאים מתחלקים, הגדר את תאי הבת כ-ROIs חדשים, כמתואר בשלב 9.1, והתחל לעקוב אחר התאים המחולקים החדשים.
      הערה: אם תאים מזוהים כאריך בינארי, השתמש בפונקציה מעקב אחר תאריכים בינאריים כדי לעקוב באופן אוטומטי אחר ROIs במסגרות נבחרות.
    4. לאחר מעקב אחר תאים דרך כל המסגרות שנבחרו, יצא את הנתונים לניתוח.
    5. פתח את הגיליון האלקטרוני של הנתונים וזהה את המידות הדרושות לניתוח (כלומר, מהירות אובייקט, האצה או אורך נתיב).
      הערה: במקרה של מדידת הבימוי, נדרשות המדידות אורך נתיב ואורך קו. אורך הקו הוא מדידה של המרחק האוקלידי, או המרחק הישר ממקור המסלול לקצה מושבת S. aureus. אורך הנתיב הוא מדידה של המרחק המצטבר, או סכום מקטעי הרצועה מכל המסגרות. ניתן לחשב את ההכוונון כייחס של המרחק היוקלידי, D(E)(אורך קו), מעל המרחק המצטבר, D(A)(Path Length).
  3. כימות פלואורסצנטיות
    1. הגדר ROIs עבור תאים חיידקיים פלורסנט כמתואר בשלב 9.1.
    2. חזרה על מעקב או תנועה של ROIs עבור תאים חיידקיים או אשכולות במסגרות פלורסנט הנותרים.
    3. יצא את הטבלה שנוצרה לקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח של עוצמת פלורסנט.
    4. בגיליון האלקטרוני של הנתונים, חפש את העמודה עם "עוצמה ממוצעת" המייצגת את עוצמת הפלואורסץ הממוצעת עבור ההחזר על התאים החיידקיים העקבו.
    5. גרף את ערכי העוצמה ממוצעת כדי להסתכל על השינויים בפלואורסט לאורך זמן.
      הערה: השינויים בפלואורסצנטיות לאורך זמן מייצגים את התנודות של ביטוי גנים עבור הגן המסומן בפלורסנט של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שימוש מוצלח בשיטה המתוארת יגרום לסדרה של מסגרות המייצרות וידאו שבו ניתן לצפות באינטראקציות בין המינים לאורך זמן. השרטוט באות 1 מספק חזותי כדי להדגיש את השלבים המרכזיים הכרוכים בהכנת חומרים להדמיה. השימוש בשיטה זו אפשר הדגמה של P. aeruginosa תאים המציגים התנהגויות שונות במונוקולטורה לעומת coculture עם S. aureus. בהשוואה לתאי P. aeruginosa במונוקולטורה שנותרו מקוברים ברפסודות, כאשר בcoculture עם S. aureus, P. aeruginosa גדל תנוענות חד-תאית כלפי מושבות S. aureus (איור 2A-2B). זנים חיידקיים המסויגים באופן פלורסנטי מאפשרים גם לדמיין אוכלוסיות מעורבות של מינים חיידקיים. באמצעות GFP התווית P. aeruginosa אפשר את התצפית כי לאחר P. aeruginosa תאים בודדים להגדיל את התנוניה, הם יהיו להקיף ובסופו של דבר לפלוש מושבות S. aureus (איור 2C). ניצול של תאים המסומנים בפלורסנט מאפשר גם הדמיה של פלישת תאי P. aeruginosa למושבות S. aureus בפעם הראשונה(איור 2C,למטה).

בעוד הפרוטוקול מניב תמונות באיכות גבוהה להתבוננות אינטראקציות בין מינים, ישנן מספר בעיות נפוצות שיכולות להוביל רצפי מסגרות באיכות ירודה. לחות לא עקבית לאורך כל הניסוי רפידות מיובשות באופן שגוי הן שתי בעיות נפוצות שמובילות להיסחף הנובעות מהסטה של המשטח וגרירה של התאים עם זה מתוך FOV (איור 3A). שינויים בלחות משפיעים על היובש של רפידות agarose. לחות מוגברת הופכת את הרפידות רטובות מדי, ומאפשרת ללחות להתיישב בין המשטח לתחתית המנה עם תחתית הזכוכית. הלחות משאירה שכבה של נוזל עבה מספיק עבור תאים מוטיב לנחיל או לשחות דרך ואינו שומר תאים חיידקיים במטוס אחד. בינתיים, ירידה בלחות לייבש את המשטח מהר יותר, אשר לגרום לתאים להיסחף בשלב מוקדם. טעות נפוצה נוספת בעת שימוש בשיטה זו עם פלואורסצנטי היא רכישת תמונות פלורסנט בתדירות גבוהה מדי או חשיפת תאים חיידקיים לאור פלורסנט במשך זמן רב מדי. מרווחי רכישה קצרים עבור תמונות פלורסנט שוב ושוב לרגש fluorophores עם אור בעוצמה גבוהה של אורך גל מסוים. פלואורופורים נרגשים מגיבים בחמצן וגורמים להשפלה של הפלואורופור. פוטו-בלם שנוצר מרוקן את הפלואורסצנס עד שניתן יהיה בטא ופלואור נוסף, אך אינו פוגע בתאים החיידקייםעצמם (איור 3B). אובדן פלואורסץ, עם זאת, מפריע מדידות של ביטוי גנים / חלבון, עוזב את התאים ללא סמן עד פלואורופור יכול להיות מסונתז באופן מלא ונרגש שוב. יתר על כן, החמצן אינטראקציה עם פלואורופורים נרגשים יכול ליצור מינים חמצן תגובתי (ROS). רדיקלים ROS אלה לאחר מכן נזק לתאים חיידקיים, בסופו של דבר הופך רעיל וכתוצאה מכך מוות תאים בתוך כמה חטיבות תאים(איור 3C). התהליכים של photobleaching ו phototoxicity ניתן לראות בקלות כמו תאים יאבדו תחילה את הפלואורסצסצנה שלהם לחלוטין, ובמסגרות הבאות, התאים יפסיקו לחלק ובסופו של דבר עלול למות(איור 3B-3C). בעיה נפוצה אחת אחרונה בעת הגדרת הניסוי מתחיל עם תאים רבים מדי לכל FOV או עם תאים קרובים מדי זה לזה, שהוא בדרך כלל פחות מ 20 μm זה מזה. תאים צפופים במסגרת הראשונה יניבים אשכולות של תאים מתחלקים שפשוט מתמזגים אחד לתוך השני כשהם גדלים ולא מקיימים אינטראקציה. בנוסף, לתאים שמתחילים קרוב מדי בסמיכות אולי לא יהיה מספיק זמן כדי לבסס מעבר צבע של אותות מופרשים למינים האחריםשיכולים להגיב להם (איור 3D) בעוד שלתאים חיידקייםמרוחקים לא תהיה הזדמנות להיתקל זה בזה במהלך הניסוי.

איור 4 מציג דוגמה לאופן שבו ניתן לדמיין את הכדאיות של תאים חיידקיים בפרוטוקול זה על-ידי הוספת אידיד פרופידיום לתחבושות agarose. פרודיד פרופידיום הוא חסין לתאים חיים, אבל יכול להיכנס לתאים עם קרום פגום ולאגד חומצות גרעין. כאן באמצע יומן GFP תווית WT S. aureus טופלו עם מדיה לבד או עם supernatant ללא תאים נגזר P. aeruginosa ותמונה מיד לאחר הטיפול. שלושה ערוצים שונים תודמיו: שלב, TxRed ו- GFP. תאים ירוקים בהירים מצביעים על תאים חיים המביעים באופן פעיל GFP כפי שניתן לראות עבור S. aureus מטופל רק עם מדיה(איור 4A), ותאיםאדומים מצביעים על תאים מוכתמים ב-S. aureus פרופידיום מת, לאחר שטופלו P. aeruginosa supernatant(איור 4B). בעוד נקודת זמן אחת בלבד מוצגת, ניתן להתאים שיטה זו כדי לקבוע את הכדאיות של התא במהלך הדמיה חיה של זמן-לשגות.

ניתן לבצע מספר ניתוחים שלאחר הדמיה כדי לכמת היבטים של אינטראקציות בין-מינים. לדוגמה, מעקב אחר תאים יכול לספק מדידות עבור הבימוי של P. aeruginosa תנועות תא יחיד לכיוון אשכול של S. aureus. התנועות של תאים P. aeruginosa בודדים נמצאים במעקב מהמסגרת תא משאיר את הרפסודה דרך המסגרת שבה התא מגיע אשכול S. aureus (איור 5A). המרחק בין הרפסודה P. aeruginosa ואשכול S. aureus לספק את המרחק האוקלידי, D(ה), בעוד אורכי המסלול הכולל מספקים את המרחק המצטבר, D(A) (איור 5B). הבימוי של כל תא מחושב כייחס של D(E)/D(A). בניסויי coculture, WT P. aeruginosa עבר לכיוון WT S. aureus עם כיוון גבוה יותר באופן משמעותי מאשר כלפי S. aureus GrBDCA , מוטציה חסר גורמים מופרשים בפיקוח Agr, נקבע בעבר להיות נחוץ לתנוענות כיוונית כלפי S. aureus24 (איור 5C).agrBDCA

Figure 1
איור 1: סכמטי של פרוטוקול הגדרת ההדמיה.
סקירה של צעדים קריטיים להכנת תרבויות חיידקים רפידות agarose. נוצר עם BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זמן לשגות, מיקרוסקופ הדמיה חיה מראה הבדלים בהתנהגות P. aeruginosa כאשר cocultured עם S. aureus.
תמונות הצמד מייצג של P. aeruginosa (bacilli, ירוק) במונוקולטורה (A) ובקולטורה עם S. aureus (cocci, לא מסומן) (B). (ג)חיידקים בעלי תווית פלורסנטית מאפשרים הדמיה של P. aeruginosa תאים בודדים פולשים אשכולות S. aureus. ניגודיות פאזה ותימת-על של ערוץ GFP (למעלה) וערוץ GFP בלבד (למטה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות הצמדה מייצגות של בעיות הדמיה נפוצות שמובילות לרכישת תמונה גרועה.
(א)רפידות מיובשות כראוי ולחות לא עקבית להוביל להיסחף של תאים על פני FOV לאורך משך ההדמיה. מיקום התא המייסד מסומן בכל מסגרת (מוט ירוק). (ב)פוטו-בליכה מחשיפה לאור במשך זמן רב מדי תרוקן את רמות הפלואורסצנס הניתנות לגילוי לפרק זמן מה, אך לא יהרוג את התאים. (ג)פוטוטוקסיות כתוצאה מחשיפה תכופה לאור מובילה למוות של תאים. הסימנים הראשונים של פוטו-אקסיות נראים כאשר תאים מפסיקים לפלואורסציינט ולא מצליחים להתחלק. (ד)תאי המונים אינוקולום ראשוניים גבוהים ב-FOV ומונע תצפית על אינטראקציות בין-מינים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: השוואה של תאי S. aureus חיים לעומת מתים.
תמונות הצמד נציג עבור GFP תווית WT S. aureus מטופל עם בינוני לבד (A) או תא חינם P. aeruginosa supernatant (ב). התאים פורסמו מיד לאחר הטיפול. תאים חיים (ירוק) באופן פעיל לבטא GFP ולא לכלול פרודיד פרופידיום, בעוד תאים מתים (אדום) לאבד פלואורסצנטיות GFP וpermeabilization קרום מאפשר פרודיד propidium להיכנס לתאים ולאגד חומצות גרעין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח מעקב אחר תאים של פ. ארוגינוזה בcoculture עם S. aureus.
בעבר, שיטה זו שימשה שיטה לביצוע מעקב אחר תאים של WT P. aeruginosa ב coculture עם WT או ơgrBDCAS. aureus. (א) ייצוג של P. aeruginosa מסלולים חד-תאיים בתסה עם S. aureus ErBDCA .agrBDCA (ב)סכמטי עבור המרחק היוקלידי(D) ומדידותהמרחק המצטבר (D( A)המשמשות לקביעת הבימוי ((D(E)/D(A)). (ג)מדידות בימוי של תאי WT P. aeruginosa יחיד בcoculture עם WTו GrBDCA S. aureus. נתון זה שונה מ- Limoli et al. 201924. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

תיק משלים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטות המוצגות כאן מתארות פרוטוקול להדמיה של תאים חיים של אינטראקציות מינים חיידקיים ברמת תא יחיד עם שינויים עבור יישומים אחרים כולל מעקב אחר תאים וניטור הכדאיות של תאים. שיטה זו פותחת דרכים חדשות לחקר התנהגויות של תאים בודדים של מיקרואורגניזמים בcoculture עם מינים אחרים לאורך זמן. באופן ספציפי, הפרוטוקול מדגים את התועלת של שיטת coculture זו בהתבוננות התנהגויות פני השטח חיידקים, במיוחד בעת לימוד אורגניזמים שיש להם הן פני השטח ונספחים הקשורים לנוזל עבור תנועתיות. לדוגמה, על ידי הגבלת התנועה החיידקית על פני השטח במטוס אחד של מיקוד, תנועתיות פילי-מתווכת מוגברת וכיווןית של P. aeruginosa בתגובה S. aureus ניתן לדמיין.

כאמור, השגת תוצאות אופטימליות בשיטת הדמיה זו מחייבת התחשבות במספר תנאים, לרבות טמפרטורה ולחות של המדגם ומכשירי ההדמיה (כלומר, יעדים ושלב). לקבלת עצות ופתרון בעיות נוספים, עיין בקובץ משלים 1. צעד קריטי בשימוש מוצלח בפרוטוקול הוא הכנת רפידות agarose, כמו רפידות ייבוש לקוי היא אחת הבעיות הנפוצות ביותר. כפי שמופיע בדמות 3A, אם הרפידות אינן מיובשות מספיק זמן, הסחף מופיע בתחילת ההדמיה של זמן-לשגות, בעוד רפידות מיובשות במשך זמן רב מדי להתחיל להתכווץ ואת התאים להיסחף מתוך FOV כמה שעות לתוך הדמיה. להבטיח כי כל החומרים הם מראש חם ומתוחזק בטמפרטורה אחידה ולחות לאורך כל הניסוי, באמצעות אינקובטור שלב העליון מגבונים ללא מוך לח, יעזור להפחית את הסחף. מומלץ גם כי כרית גיבוי הוא תמיד עשה במקרה כרית הראשונה לא מיובשת כראוי או דמעות במהלך העברה מהתבנית לצלחת המדגם. בנוסף, חשוב להשתמש במדיום בעל השפעה נמוכה, הן לגידול תרביות חיידקים והן להכנת הרפידות כדי למזער את פלואורסץ הרקע מהמדיום בעת הדמיה של התאים. מומלץ להשתמש במדיה מינימלית עבור מיקרוסקופיה, מאז מדיה עשירה לעתים קרובות יש השפעה אוטומטית גבוהה. החל בהתפלגות בצפיפות נמוכה ואפילו מרחבית של תאים ב-FOV הם גם גורמי מפתח בשיטה זו. באופן ספציפי, במחקרים קודמים הערכת P. aeruginosa ו S. aureus אינטראקציות, זה אפשר לחיידקים ליצור הדרגתי מספיק של גורמים מופרשים כי לאחר מכן ניתן לזהות על ידי מינים אחרים הנוכחי(איור 2B).

למרות היתרונות של שיטה זו, יש גם מגבלות כולל המחיר שלה, אופי תפוקה נמוכה, הגבלות פלואורסץ, ותלות גבוהה בשליטה על תנאים סביבתיים. איור 3B-3C מציג את המגבלות העיקריות של שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנס. כפי שנדון בסעיף התוצאות, אם תמונות פלורסנט נתפסות במרווחי זמן קצרים, photobleaching ו- phototoxicity יכול להתרחש. על מנת למנוע שתי תוצאות אלה, מרווחי תמונה פלורסנט צריך להילקח רחוק מספיק זה מזה עם זמן חשיפה לאור פלורסנט נמוך ככל האפשר כדי עדיין לדמיין כראוי את הפלואורופור. בנוסף, בעת קביעת מרווח הזמן להדמיית פלואורסץ, חשוב לשקול את זמן ההתבגרות של כל פלואורופור. הפלואורופורים המשמשים בזנים P. aeruginosa ו- S. aureus המוצגים בדמות 2, איור 3 ואיור 4, לדוגמה, יש זמן התבגרות של כ 20 דקות ולכן יכול להתרגש כל 20 דקות ללא חשש של השפעות photobleaching פוטנציאליות. בינתיים, חיסרון נוסף של שיטה זו הוא שהיא אינה מאפשרת תצפיות של אינטראקציות בין מינים מאוחרים ברגע תאים להגיע לצפיפות תאים גבוהה. על מנת לדמיין תאים חיידקיים בודדים, הם חייבים להישאר ב מישור אחד של מיקוד. עם זאת, ברגע שהאוכלוסייה מגיעה לצפיפות תאים גבוהה, התאים מתחילים לגדול ביותר ממטוס אחד.

ניתן לשנות שיטה זו כדי ללמוד פנוטיפים שונים כגון קתנות תא (איור 4) וביטוי של גנים בעלי עניין (נתונים לא מוצגים). איור 4 מציג דוגמה לאופן שבו השיטה הותאמה כדי לדמיין את הכדאיות החיידקית על ידי הוספת אידיד פרופידיום לתחבושות agarose. יישום נוסף של שיטה זו הוא מדידת ביטוי גנים /חלבון חיידקי coculture עם אורגניזם אחר באמצעות כתבים פלורסנט. לדוגמה, פלואורופורים מרובים ניתן לשלב וקטור פלסמיד או כרומוזום חיידקי כדי ללמוד בו זמנית את הביטוי של גנים או חלבונים שונים. כאן חשוב לבחור fluorophores שאין להם ספקטרום פליטה ופליטה חופפים. לבסוף, השימוש במעקב אחר תאים חיידקיים בניתוח שלאחר הדמיה מאפשר את הכיווניות (איור 5), מהירות והאצה, בין היתר, להיות מחושבגם 24.

בסך הכל, שיטת הדמיה זו של coculture המותאמת לפרוטוקולי monoculture שתוארו קודם לכן משפרת את היכולת לדמיין התנהגויות של מינים חיידקיים מרובים בcoculture. שיטה זו מציעה את ההזדמנות ללמוד חיידקים מנקודת מבט של תרבות מעורבת, אשר תגביר את ההבנה כיצד כל מין משנה את התנהגויותיו באופן חד-תאי, ובסופו של דבר מספק תובנה חדשה כיצד מינים חיידקיים אינטראקציה בסביבות polymicrobial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן סיסטיק פיברוזיס Postdoc-to-Faculty מעבר פרס LIMOLI18F5 (DHL), סיסטיק פיברוזיס קרן גיוס סגל זוטר פרס LIMOLI19R3 (DHL), ו NIH T32 מענק הכשרה 5T32HL007638-34 (ASP). אנו מודים לג'פרי מייסנר, מינסו קים ואיתן גארנר על שיתוף פרוטוקולים ראשוניים וייעוץ להדמיה והכנת רפידות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass Cellvis D35-20-1.5-N One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes Kimberly-Clark Professional 06-666A
Low-Melt Agarose Nu-Sieve GTG/Lonza 50081 For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas VWR 82027-492
Round-Tapered Spatulas VWR 82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive Sigma-Aldrich S6685-25EA For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm Kord-Valmark /sold by RPI 2900
Tweezers VWR 89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose RPI G32045
KH2PO4 RPI P250500
MgSO4 Sigma-Aldrich 208094
NaCl RPI S23025
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
Tryptone BD Biosciences DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11 Andor 77026135 Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP Nikon 96372 Filter cube
Filter Cube TxRed Nikon 96375 Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER Okolab 77057447 Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking Nikon 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse Nikon Model Ti2-E Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) Nikon MRD00205 Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) Nikon MRD31905 Objective
ThermoBox with built-in fan heaters Tokai Hit TI2TB-E-BK Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) PMID: 7604262 Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) PMID: 23404398 USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide Invitrogen L7012 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
  2. Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, (10), 1198-1206 (2011).
  3. Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
  4. Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10, (12), 1997-2015 (2015).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17, (10), 349-353 (2007).
  6. Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
  7. Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
  8. Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47, (12), 4084-4089 (2009).
  9. Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
  10. Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
  11. Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (3), 350-356 (2016).
  12. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35, (6), 947-953 (2016).
  13. Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (106), (2017).
  14. Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
  15. Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196, (22), 3903-3911 (2014).
  16. Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
  17. Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
  18. Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18, (5), 1635-1645 (2016).
  19. Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89, (6), 1069-1083 (2013).
  20. Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
  21. Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
  22. Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174, (17), 5732-5739 (1992).
  23. Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60, (4), 1166-1173 (1994).
  24. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
  25. Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66, (1), 493-520 (2012).
  26. Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115, (17), 4471-4476 (2018).
  27. Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22, (26), 31853-31863 (2014).
הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).More

Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter