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Immunology and Infection

एकल-सेल इंटरप्रीपी बैक्टीरियल इंटरैक्शन का गतिज दृश्य

doi: 10.3791/61376 Published: August 5, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यह लाइव-बैक्टीरियल सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल समय के साथ एकल-कोशिका स्तर पर कई बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच बातचीत के दृश्य के लिए अनुमति देता है। समय-चूक इमेजिंग मोनोकल्चर या कोकल्चर में प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के अवलोकन के लिए व्यक्तिगत कोशिका गतिशीलता और व्यवहार्यता सहित बहुप्रजाति जीवाणु समुदायों में अंतरप्रजातियों की बातचीत से पूछताछ करने की अनुमति देता है।

Abstract

पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय प्रकृति में सर्वव्यापी हैं, फिर भी एकल कोशिका स्तर पर उनकी बातचीत का अध्ययन करना मुश्किल है। इस प्रकार, दो जीवाणु रोगजनकों के बीच अंतरप्रजातियों की बातचीत को देखने के लिए एक माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि विकसित की गई है। एक मोटिवल ग्राम-नकारात्मक रोगजनक, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एक गैर-मोटिवल ग्राम-पॉजिटिव रोगजनक, स्टेफिलोकोकस ऑरियस के बीच बातचीत से पूछताछ करने के लिए इस विधि का उपयोग यहां प्रदर्शित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में एक कवरस्लिप और एक एगर उठे पैड के बीच प्रत्येक प्रजाति को सह-अनुमानित किया जाता है, जो कोशिकाओं को एक ही विमान में बनाए रखता है और अंतरिक्ष और समय दोनों में बैक्टीरियल व्यवहार के दृश्य के लिए अनुमति देता है।

इसके अलावा, यहां प्रदर्शित समय-चूक माइक्रोस्कोपी दो या दो से अधिक जीवाणु प्रजातियों के बीच होने वाली शुरुआती बातचीत की कल्पना करने के लिए आदर्श है, जिसमें मोनोकल्चर में बैक्टीरियल प्रजातियों में परिवर्तन और अन्य प्रजातियों के साथ सहसंस्कृति में परिवर्तन शामिल हैं। माइक्रोस्कोपी सेटअप में सीमित नमूना स्थान की प्रकृति के कारण, यह प्रोटोकॉल कोशिका आबादी बहुत अधिक होने के बाद बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच बाद में बातचीत का अध्ययन करने के लिए कम लागू होता है। हालांकि, प्रोटोकॉल के कई अलग-अलग अनुप्रयोग हैं जिनमें इमेजिंग लाइव और मृत बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए धुंधला का उपयोग, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के माध्यम से जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा, और दोनों एकल प्रजातियों और बहुप्रजातियों के प्रयोगों में बैक्टीरियल सेल आंदोलन पर नज़र ें चढ़ाई शामिल है।

Introduction

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पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय प्रकृति में आम हैं, जो विभिन्न प्रकार के पर्यावरण1,,2,,3 और मानव निकस4,,5 में फैलेहुएहैं। मानव रोग में कुछ सबसे कुख्यात पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमणों में दंत बायोफिल्म्स6,पुराने घाव7,,8,और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज9,वेंटिलेटर से जुड़े निमोनिया10और जेनेटिक डिजीज सिस्टिक फाइब्रोसिस(सीएफ) 11,,12वाले व्यक्तियों में श्वसन संक्रमण शामिल हैं । ये संक्रमण अक्सर विविध माइक्रोबियल प्रजातियों से बने होते हैं; हालांकि, ग्राम-सकारात्मक जीवाणु स्टेफिलोकोकस ऑरियस और ग्राम-नकारात्मक जीवाणु स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के बीच बातचीत पर हाल ही में ध्यान केंद्रित किया गया है। इन जीवों और इन विट्रो विश्लेषणों से संक्रमित रोगियों सहित अध्ययनों से प्रतिस्पर्धी और सहयोगात्मक दोनों तरह की बातचीत का पता चलता है जो रोग प्रगति, माइक्रोबियल अस्तित्व, उग्रता, चयापचय और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता पर गहरा और अप्रत्याशित प्रभाव डाल सकते हैं (Hotterbeekx et al. 201713 और लिमोली और हॉफमैन 20193)द्वारा विस्तार से समीक्षा की गई है।

संक्रमण के दौरान अंतरप्रजाति इंटरैक्शन में बढ़ती रुचि पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों से मिली है। आमतौर पर, इन अध्ययनों ने मोनोकल्चर और कोकल्चर के बीच फेनोटाइपिक मतभेदों की जांच करने के लिए प्लेट या शोरबा-आधारित परख का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, ठोस सतहों पर पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस को कॉलोनी फेनोटाइप, वर्णक, या पॉलीसैकराइड,उत्पादन,14, 15,16में विकास अवरोध या परिवर्तनों के दृश्य के लिए अनुमति दी गई है।16 जैवटिक या अजैविक सतहों पर मिश्रित प्रजातियों बायोफिल्म्स, साथ ही तरल संस्कृति में बैक्टीरियल प्रजातियों को भी जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति17, 18,18के अलावा विकास, चयापचय, एंटीबायोटिक सहिष्णुता, प्रतिस्पर्धा और व्यवहार्यता में परिवर्तन का मापन सक्षम है। हालांकि इन थोक संस्कृति प्रयोगों में अंतर्दृष्टि से पता चला है कि कैसे पी aeruginosa और एस ऑरियस समुदाय पैमाने पर एक दूसरे को प्रभावित कर सकता है, वे बातचीत है कि एकल सेल स्तर पर जगह लेने के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में असमर्थ हैं । यहां प्रस्तुत विधि समय के साथ एक सहसंस्कृत समुदाय के भीतर आंदोलन, कोशिका व्यवहार्यता, और एकल कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करके अंतरप्रजातियों बातचीत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण को जोड़ती है ।

एकल-कोशिका इंटरैक्शन कोशिकाओं के थोक समुदाय में होने वाली बातचीत से व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। एकल कोशिका विश्लेषण के माध्यम से, एक समुदाय के भीतर विषमता का अध्ययन करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है कि कोशिकाओं की स्थानिक नियुक्ति समुदाय की गतिशीलता को कैसे प्रभावित करती है या समूह के व्यक्तिगत सदस्यों के भीतर जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर कैसे बदलता है। ट्रैकिंग कोशिकाएं कई पीढ़ियों के माध्यम से एक कोशिकाओं को समय के साथ कैसे आगे बढ़ाती हैं और व्यवहार करती हैं, इस बारे में भी जानकारी प्रदान कर सकती हैं। सेल आंदोलन और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन समवर्ती ट्रैकिंग द्वारा, सहसंबंध जीन उतार चढ़ाव और इसी फेनोटाइप के बीच किया जा सकता है । एकल कोशिका स्तर पर व्यक्तिगत जीवाणु प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । ये अध्ययन एक ही विमान में समय के साथ लाइव इमेजिंग कोशिकाओं का लाभ उठाते हैं, और सेल डिवीजन और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता19,,20जैसे फेनोटाइप को देखने के लिए उपयोगी रहे हैं। एकल जीवाणु प्रजातियों21, 22, 23,22,23के विकास, गतिशीलता, सतह उपनिवेशीकरण और बायोफिल्म गठन की निगरानी के लिए अतिरिक्त लाइव-इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है। हालांकि, जबकि इन अध्ययनों मोनोकल्चर में बैक्टीरिया के शरीर विज्ञान को समझने के लिए व्यावहारिक किया गया है, coculture में समय के साथ कई जीवाणु प्रजातियों के एकल सेल व्यवहार देखने के लिए प्रयोग सीमित हैं ।

यहां, एकल प्रजातियों इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पिछले प्रोटोकॉल को पी एरुगिनोसा और एस ऑरियसके बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इन जीवों को उनके सेल मॉर्फोलोजी के आधार पर चरण विपरीत के तहत विभेदित किया जासकता है (पी एरुगिनोसा बैसिली हैं और एस ऑरियस कोसीआई हैं)। इस विधि के विकास ने हाल ही में एस ऑरियस24की उपस्थिति में पी एरुगिनोसा के पहले से वर्णित गतिशीलता व्यवहारों के दृश्य को सक्षम किया । पी एरुगिनोसा को दूरी से एस ऑरियस को संवेदन करने और एस ऑरियस कोशिकाओं के समूहों की ओर वृद्धि और दिशात्मक एकल कोशिका आंदोलनों के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम पाया गया था । एस ऑरियस की ओर पी एरुगिनोसा आंदोलन को टाइप IV पिली (टीएफपी), बालों जैसे अनुमानों की आवश्यकता पाई गई, जिनके समन्वित विस्तार और रिऐक्शन एक आंदोलन उत्पन्न करते हैं जिसे हिल मोटिविटी25कहा जाता है।

ये अध्ययन प्रजातियों के बीच पहले की बातचीत से पूछताछ के लिए इस विधि की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, बाद में बातचीत के समय बिंदुओं पर उच्च सेल घनत्व पर इमेजिंग मुश्किल है कि कोशिकाओं की एकल परतों की पहचान नहीं की जा सकती है, जो ज्यादातर पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण के दौरान मुद्दे बन जाती हैं। इस सीमा को देखते हुए, विधि पहले की बातचीत के लिए सबसे उपयुक्त है जिसे बाद में बातचीत के उच्च सेल घनत्व प्रतिनिधि पर पारंपरिक स्थूल परख के साथ पालन किया जा सकता है। इस विधि की अतिरिक्त सीमाओं में कम थ्रूपुट प्रकृति शामिल है, क्योंकि एक समय में केवल एक नमूना इमेज किया जा सकता है और माइक्रोस्कोप, कैमरा और पर्यावरणीय कक्ष की लागत। इसके अलावा, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी फोटोटॉक्सीसिटी और फोटोब्लैचिंग जैसी बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए जोखिम बन गया है, इसलिए आवृत्ति को सीमित किया जा सकता है जो फ्लोरेसेंस छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है। अंत में, इस विधि में उपयोग किए जाने वाले एग्राजिंग पैड पर्यावरण में परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जिससे तापमान और आर्द्रता जैसी स्थितियों के लिए नियंत्रण करना महत्वपूर्ण होता है, यह देखते हुए कि यदि स्थितियां सही नहीं हैं तो पैड हटना या विस्तार करना शुरू कर सकते हैं। अंत में, जबकि इस विधि मेजबान पर्यावरण की नकल नहीं करता है, यह कैसे अलग जीवाणु प्रजातियों सतहों पर प्रतिक्रिया के लिए सुराग प्रदान करता है, जो पर्यावरण की नकल करने के लिए डिज़ाइन की गई परख में पीछा किया जा सकता है/

यह विधि एकल-कोशिका आंदोलन को ट्रैक करने वाले पिछले अध्ययनों से अलग है, जिसमें कोशिकाओं को कवरस्लिप और एगरेज़ पैड के बीच टीका लगाया जाता है, जो कोशिकाओं को सतह पर सीमित करता है। यह एक ही विमान में समय के साथ सेल ट्रैकिंग सक्षम बनाता है; हालांकि, सीमा क्षणिक सतह सगाई के चक्र मनाया जब कोशिकाओं तरल26में डूबे हुए हैं . एक agarose पैड के तहत इमेजिंग बैक्टीरिया का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह स्थूल प्लेट आधारित उप सतह टीका परख की नकल करता है शास्त्रीय पी aeruginosa हिल गतिशीलता25की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया । इस परख में, जीवाणु कोशिकाओं को पेट्री डिश और एगर के नीचे के बीच टीका लगाया जाता है, कोशिकाओं को एक ही विमान में रखते हुए, क्योंकि वे टीका के बिंदु से बाहर की ओर पकवान के नीचे की ओर बढ़ते हैं, इस माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल की तरह।

यहां प्रस्तुत अंतरप्रजाति इंटरैक्शन की कल्पना के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल में 1) बैक्टीरियल नमूना तैयार करना और एगर उठे पैड, 2) इमेजिंग अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का चयन करना और 3) पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण शामिल है। सेल आंदोलन और ट्रैकिंग का विस्तृत दृश्य चरण विपरीत द्वारा कम समय अंतराल पर छवियों के अधिग्रहण द्वारा किया जा सकता है। समय के साथ सेल व्यवहार्यता या जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग किया जा सकता है। यहां, हम एग्राजिंग पैड में व्यवहार्यता रंगों के अलावा फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलन का एक उदाहरण दिखाते हैं।

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Protocol

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नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी आपूर्ति के लिए एक पूर्ण विवरण और सूची संख्या सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

1. M8T न्यूनतम मीडिया की तैयारी

  1. 2 एल बोतल में 800 एमएल अल्ट्रापुरे पानी (यूपीडब्ल्यू, प्रतिरोधकता 18 एमω/सेमी) में एनए2एचपीओ4·7एच2ओ, 15 ग्राम के KH2पीओ4,और 2.5 ग्राम एनएसीएल के 800 एमएल में घुलकर एम8 मिनिमल साल्ट बेस (5x) के 1 एल तैयार करें। पीएच से 7.6। यूपीडब्ल्यू के साथ 1 एल तक पूर्ण मात्रा। 45 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
  2. 1 एल बोतल में यूपीडब्ल्यू के 400 एमएल में 100 ग्राम ग्लूकोज घोलकर ग्लूकोज घोल (20% डब्ल्यू/वी) का 500 एमएल तैयार करें। यूपीडब्ल्यू के साथ 500 एमएल का पूरा समाधान। 45 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
  3. यूपीडब्ल्यू के 400 एमएल में 100 ग्राम ट्राइप्टोन को भंग करके ट्राइप्टोन सॉल्यूशन (20% डब्ल्यू/वी) की 500 एमएल तैयार करें। यूपीडब्ल्यू के साथ 500 एमएल तक पूरा करें। 45 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
  4. 5x M8 न्यूनतम लवण (1x फाइनल), 20% ग्लूकोज के 10 मिलीएल जोड़कर एम8 + 10% ट्राइप्टोन (M8T) न्यूनतम मीडिया के 1 एल तैयार करें (10% ग्लूकोज 0.2% फाइनल), 1 एम एमजीएसओ4 (1 एमएम फाइनल) का 1 एमएल, और 20% ट्राइप्टोन (1% फाइनल) का 50 एमएल यूपीडब्ल्यू का 600 एमएल। यूपीडब्ल्यू के साथ 1 एल को पूरा करें। एक बाँझ 500 एमएल मीडिया भंडारण बोतल में एक 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।

दिन 1:

2. बैक्टीरियल रातोंरात संस्कृतियों की तैयारी

  1. पी एरुगिनोसा या एस ऑरियस (जब उचित हो तो एंटीबायोटिक दवाओं सहित) की एक कॉलोनी के साथ M8T न्यूनतम मीडिया के 5 एमएल टीका और 16 घंटे से अधिक समय के लिए वातारण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
    नोट: जीवाणु रोगजनकों पी aeruginosa और एस ऑरियस इस विधि के लिए इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि वे आमतौर पर पुराने संक्रमण से coisolated हैं, और उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए समझने की कैसे वे पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमण के दौरान रोगी परिणामों के लिए योगदान महत्वपूर्ण है । अध्ययन के ध्यान के आधार पर अन्य जीवाणु प्रजातियों का उपयोग किया जा सकता है।

दूसरा दिन:

3. बैक्टीरियल उपभेदों की उपसंस्कृति

  1. सबकल्चर पी एरुगिनोसा 1:500 और एस ऑरियस 1:1000 ताजा M8T के 5 मिलीएल में (उचित होने पर एंटीबायोटिक्स शामिल करें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर वातारण के साथ इनक्यूबेट जब तक संस्कृतियां मध्य-लॉग चरण तक नहीं पहुंच जातीं (ओडी600 = ~ 0.3 - 0.5)।

4. पैड मोल्ड्स के लिए सामग्री की तैयारी

  1. एक फ्लैट के अंत को गर्म करके धातु के स्पैटुला तैयार करें, एक बुनसेन बर्नर के साथ गोल प्रयोगशाला स्पैटुला जब तक फ्लैट अंत का आधा हिस्सा 90 डिग्री कोण पर आमादा नहीं हो सकता है। एक और फ्लैट, गोल प्रयोगशाला स्पैटुला के अंत को गर्म करें और पिछले 10 मिमी को 45 डिग्री सेल्सियस कोण में थोड़ा मोड़ें।
  2. सिलिकॉन मोल्डों के चारों कोनों को काट लें ताकि मोल्ड 35 मिमी डिश के अंदर फिट हो जाएं।
  3. 70% इथेनॉल जोड़कर और उन्हें बुनसेन बर्नर की लौ से गुजरते हुए स्पैटुला और चिमटी की एक जोड़ी को स्टरलाइज करें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ डिश और सिलिकॉन मोल्ड्स को साफ करें और उन्हें लिंट-फ्री वाइप्स के साथ सुखाएं।

5. एगरेग्डेड पैड की तैयारी

नोट: पैड इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बैक्टीरिया के लिए पोषक तत्व स्रोत के रूप में M8T ंयूनतम मीडिया के साथ तैयार कर रहे हैं । हालांकि, पैड में इस्तेमाल होने वाले पोषक तत्वों को विभिन्न जीवों के लिए संशोधित किया जा सकता है।

  1. पिघल 2% कम पिघल एक साफ 50 मिलीएल Erlenmeyer फ्लास्क में M8T के 10 एमएल में पैदा हुई। फ्लास्क की सामग्री को उबलने से रोकने के लिए अल्प अंतराल (2-5 एस) में माइक्रोवेव जब तक एगर उठे समाधान में नहीं होते हैं। एक बार पिघल जाने के बाद, कम से कम 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ठंडा होने दें।
  2. 35 मिमी डिश में खोलने के साथ सिलिकॉन कटआउट को संरेखित करके मोल्ड तैयार करें और सिलिकॉन को डिश में सुरक्षित करने के लिए स्पैटुला के साथ हल्के से टैप करें, और मोल्ड और डिश के बीच सभी हवा के बुलबुले को हटा दें।
  3. एक बार ठंडा होने के बाद, पिघले हुए एग के पिपेट 915 माइक्रोन मोल्ड में उठे। ढक्कन अजर छोड़ दें और पैड को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें।
  4. ढक्कन के साथ पकवान को कवर करें और अतिरिक्त 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
  5. एक लिंट-फ्री वाइप को कसकर रोलिंग करके आर्द्रता पोंछे तैयार करें। एक बाँझ पेट्री डिश के अंदर लुढ़का हुआ पोंछ रखें और समान रूप से पोंछ भर में बाँझ पानी के ५०० μL जोड़ें । 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  6. पैड और एक बाँझ 35 मिमी पकवान 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गर्म।

6. बैक्टीरियल कोशिकाओं और आँभों की तैयारी

  1. प्रत्येक उपसंस्कृति के ओडी600 को मापने और पतला पी aeruginosa एक आयुध डिपो600 = 0.03 और एस ऑरियस के लिए एक OD600 = 0.10 M8T में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्ववार्म्ड। 1:1 अनुपात और भंवर में पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस मिलाएं।
    नोट: यदि उपभेदों एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता है, एंटीबायोटिक दवाओं रात भर और उपसंस्कृति में जोड़ा जा सकता है, लेकिन जब इमेजिंग के लिए प्रजातियों मिश्रण अगर यह coculture में अंय प्रजातियों को प्रभावित करता है नहीं जोड़ा जाना चाहिए । प्लाज्मिड स्थिरता और कोसंस्कृति में सभी प्रजातियों पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव के लिए प्रत्येक जीव के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी/
  2. एक पूर्व गर्म, बाँझ 35 मिमी ग्लास कवरलिप डिश के नीचे समान रूप से coculture के पिपेट 1 μL।
  3. बाँझ चिमटी का उपयोग कर मोल्ड से सिलिकॉन कटआउट निकालें।
  4. बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके डिश से पैड निकालें।
    1. पैड के किनारे के नीचे थोड़ा तुला स्पैटुला पर्ची, जबकि मोल्ड उल्टा पकड़, यह एक बाँझ पेट्री प्लेट ढक्कन पर बाहर ड्रॉप करने के लिए ।
      नोट: ध्यान रखें कि पैड को बाहर करने के लिए मजबूर न करें या यह चीर देगा। पैड के किस तरफ नीचे है का ट्रैक रखें।
  5. पैड के नीचे 90 डिग्री कोण वाले स्पैटुला को फिसलने और टीका कवर्लिपी के शीर्ष पर रखकर, बैक्टीरियल कोशिकाओं, बॉटम-साइड-डाउन के साथ पैड को डिश में स्थानांतरित करें। कवरस्लिप के खिलाफ पैड फ्लश करने के लिए 90 डिग्री कोण वाले स्पैटुला का उपयोग करें और धीरे-धीरे किसी भी हवा के बुलबुले को दबाएं।
  6. नम पोंछे से अतिरिक्त नमी निकालें तो पकवान के किनारे के आसपास जगह है, यकीन है कि यह पैड को छूने नहीं बना रही है । अब इमेजिंग के लिए सैंपल तैयार है।

7. लाइव इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप की स्थापना

  1. प्रयोगात्मक सेट-अप से पहले कम से कम 2 घंटे तक गर्म पर्यावरण कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप, कंप्यूटर और प्रकाश स्रोतों सहित सभी घटकों को चालू करें।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सुनिश्चित करें कि प्रकाश स्रोत जुड़े हुए हैं और चल रहे हैं।
  4. सभी छवि विमानों को संरेखित करने के लिए कोहलर रोशनी27 प्रदर्शन करें।
    1. सबसे पहले, "डमी" डिश का उपयोग करके 20x उद्देश्य के साथ चिह्नित कवरलिप को ध्यान में लाएं। सुनिश्चित करें कि कंडेनसर बुर्ज "खुली" स्थिति में सेट है।
      नोट: Köhler रोशनी प्रत्येक अद्वितीय उद्देश्य के लिए किया जाना चाहिए/ हालांकि, कम आवर्धन पर "डमी" डिश के साथ फोकस और अलाइनमेंट सेट-अप और प्रयोग स्टार्ट टाइम के बीच समय को सीमित करने के लिए उच्च आवर्धन पर जीवित नमूनों पर सेट-अप में तेजी आती है।
    2. कंडेनसर पर ध्यान दें।
      1. फील्ड डायाफ्राम बंद करें।
        नोट: एक अष्टकोणीय आकार का एपर्चर दिखाई देना चाहिए। यदि कंडेनसर पूरी तरह से ध्यान से बाहर है, तो देखने का पूरा क्षेत्र (FOV) अंधेरा दिखाई देगा।
      2. कंडेनसर ध्यान केंद्रित घुंडी घुमाएं जब तक कि अष्टकोना किनारे कुरकुरे न हों।
        नोट: प्रकाश तीव्रता में वृद्धि के रूप में छवि विमानों सही संरेखण दृष्टिकोण होगा ।
    3. कंडेनसर को संरेखित करें।
      1. संरेखण घुंडी को समायोजित करके फ़ील्ड कंडेनसर को केंद्र करें।
        नोट: अष्टकोना FOV के बीच में केंद्रित होना चाहिए। संरेखण घुंडी माइक्रोस्कोप के आधार पर भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, कुछ माइक्रोस्कोप कंडेनसर में घुंडी होती है, जबकि अन्य में स्क्रू ड्राइवर की आवश्यकता होती है।
    4. लैंप फिलामेंट पर ध्यान दें और कंडेनसर अपर्चर को एडजस्ट करें।
      1. उद्देश्य के पीछे फोकल विमान का निरीक्षण करने के लिए प्रकाश पथ में एक चरण दूरबीन या बर्ट्रेंड लेंस रखें।
        नोट: दो गाढ़ा हलकों होना चाहिए ।
      2. बर्ट्रेंड लेंस फोकस घुंडी बारी जब तक छल्ले कुरकुरा देखो ।
      3. लाइट पाथ से बर्ट्रेंड लेंस निकालें।
    5. फ़ील्ड डायाफ्राम खोलें जब तक कि अष्टकोना एफओवी के ठीक बाहर न हो।
    6. 100x उद्देश्य में बदलें और विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ने से पहले मिलान चरण की अंगूठी को जगह में स्लाइड करें, और तैयार नमूना पकवान को शीर्ष पर रखें।
    7. बैक्टीरियल नमूना पकवान के साथ 100x उद्देश्य पर कोहलर रोशनी करें।
  5. केवल ठीक समायोजन का उपयोग कर बैक्टीरिया पर ध्यान केंद्रित करें। एक बार जब एफओवी में बैक्टीरिया आईपीस के माध्यम से केंद्रित हो जाते हैं, तो माइक्रोस्कोप पर कैमरा बटन दबाकर प्रकाश पथ को कैमरे में स्विच करें।
  6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में फेज ऑप्शन पर क्लिक करें।
  7. सॉफ्टवेयर में प्रकाश स्रोत का चयन करके उत्सर्जित व्यास एलईडी प्रकाश के प्रतिशत को समायोजित करें और या तो प्रकाश प्रतिशत पैमाने पर बार का उपयोग करने या फिसलने के लिए प्रकाश के वांछित प्रतिशत में मैन्युअल रूप से प्रवेश करें।
  8. प्रकाश स्रोत पर क्लिक करके व्यास एलईडी लाइट एक्सपोजर समय को समायोजित करें और या तो मैन्युअल रूप से वांछित एक्सपोजर समय दर्ज करें या प्रदान किए गए ड्रॉप-डाउन मेनू से एक्सपोजर समय का चयन करें।
    नोट: उपयोग किए जा रहे कैमरे के आधार पर एक्सपोजर समय अलग-अलग होगा।
  9. फ्लोरोसेंस का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रत्येक संबंधित चैनल (यानी, TxRed, GFP) में कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करें, ब्याज के फ्लोरोसेंट चैनल पर क्लिक करके।
    1. उत्सर्जित फ्लोरेसेंस प्रकाश का प्रतिशत निर्धारित करें, फिर एक्सपोजर समय को समायोजित करें (जैसा कि व्यास एलईडी लाइट के लिए चरण 7.7 और 7.8 में किया गया है)।
    2. वैकल्पिक रूप से, दृश्य नियंत्रण ड्रॉप-डाउन मेनू में अन्य बिट गहराई विकल्पों में से एक का चयन करके गतिशील सीमा को समायोजित करने के लिए थोड़ी गहराई बदलें।
  10. अधिग्रहण नियंत्रण मेनू में XY विकल्प पर क्लिक करके ब्याज की XY पदों का चयन करें।
    1. जॉय स्टिक के साथ मंच की स्थिति को स्थानांतरित करें, या स्क्रीन पर एफओवी पर क्लिक करके और खींचकर, और एक्स और वाई को बचाने के लिए खाली बॉक्स पर क्लिक करें।
      नोट: तीन से अधिक अलग-अलग XY पदों का चयन, जितना संभव हो उतना बंद नहीं, समय-चूक अधिग्रहण के लिए अनुशंसित है।
  11. अधिग्रहण नियंत्रण मेनू के XY टैब पर पीएफएस बॉक्स पर क्लिक करके या तो सही फोकस सिस्टम (पीएफएस) चालू करें या जॉय स्टिक कंट्रोल पैनल पर पीएफएस बटन दबाएं।
  12. बैक्टीरियल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ठीक समायोजन घुंडी घुमाएं।
  13. प्रत्येक XY स्थिति के लिए पीएफएस बटन पर क्लिक करें, एक बार कोशिकाओं को ध्यान के वांछित विमान में हैं ।
    नोट: पीएफएस समय-चूक प्रयोगों के दौरान जेड-एक्सिस में बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करता है। समय के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं का ध्यान बनाए रखने के लिए यह आवश्यक है। विभिन्न विनिर्माण में अलग-अलग क्षतिपूर्ति प्रणालियां हैं।
  14. अधिग्रहण नियंत्रण मेनू में विकल्पों में से चयन करके प्रत्येक चैनल (जैसे, चरण विपरीत और प्रत्येक फ्लोरोफोर) के लिए अधिग्रहण अंतराल और आवृत्ति सहित छवि अधिग्रहण शर्तों का चयन करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, चरण विपरीत छवियों को हर 5-10 एस अंतराल पर प्राप्त किया जाता है जबकि जीएफपी और TxRed चैनलों में फ्लोरेसेंस छवियों को हर 20 मिनट में प्राप्त किया जाता है।
  15. माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण सेटिंग्स स्थापित होने के बाद इमेजिंग शुरू करें।

8. वैकल्पिक: लाइव के लिए संशोधन/

  1. पिघल 2% M8T के 10 मिलीएल में agarose और कम से कम 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ठंडा करते हैं।
  2. पिघले हुए एगरेज में प्रोपिडियम आयोडाइड का 1 एमएम जोड़ें।
  3. एक बार ठंडा होने के बाद तैयार सांचे में एगर के पिपेट 915 माइक्रोन।
  4. ढक्कन अजार छोड़ दें और पैड को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें। प्रकाश से रक्षा करें।
  5. ढक्कन के साथ पकवान को कवर करें और अतिरिक्त 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
  6. आर्द्रता पोंछे तैयार करें।
    1. एक लिंट-फ्री पेपर को कसकर पोंछ लें।
    2. वाइप को बाँझ पेट्री डिश में रखें और पोंछ में 500 माइक्रोन बाँझ पानी डालें।
    3. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. पैड और एक बाँझ 35 मिमी पकवान 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  8. धारा 6 में दर्शाए गए पकवान को टीका लगाने के लिए आगे बढ़ें: बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी और पैड को टीका लगाना।

9. डेटा विश्लेषण

  1. कोशिकाओं की पहचान
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में छवि फ़ाइल खोलें और फ़ाइल को केवल ट्रैकिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्रेम शामिल करने के लिए क्रॉप करें, ब्याज की कोशिकाओं में तेजी से बढ़ी, और केवल चरण विपरीत चैनल में।
      नोट: फसली फ़ाइल को एक नई फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है जिसमें मूल फ़ाइल के साथ हस्तक्षेप किए बिना ट्रैकिंग डेटा संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. विश्लेषण नियंत्रण मेनू में ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करने के विकल्प का चयन करें और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले पहले फ्रेम में या तो व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों का पता लगाकर आरओआई को परिभाषित करें।
      नोट: आरओआई को या तो मैन्युअल रूप से या बाइनरी के रूप में परिभाषित किया जा सकता है।
      1. मैन्युअल रूप से आरओआई को परिभाषित करें
        1. आरओआई को मैन्युअल रूप से परिभाषित करने के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत बैक्टीरियल सेल या कोशिकाओं के समूहों की परिधि का पता लगाइए।
          नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, पी एरुगिनोसा,या अन्य रॉड के आकार की कोशिकाओं को एलिप्से आरओआई का चयन करके और बैक्टीरियल सेल के आकार में समायोजित एक एलिप्से ड्राइंग द्वारा मैन्युअल रूप से पता लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बहुभुज आरओआई विकल्प को गैर-पारंपरिक आकार के आरओआई का पता लगाने के लिए चुना जा सकता है, जैसे कोशिकाओं के समूह।
      2. बाइनरी आरओआई की पहचान करें
        1. बाइनरी आरओआई को परिभाषित करने के लिए बाइनरी टू आरओआई विकल्प पर क्लिक करें।
          नोट: ऑब्जेक्ट्स को चरण विपरीत चैनल में लाइटर-पिक्सेलेटेड पृष्ठभूमि से गहरे-पिक्सेलयुक्त बैक्टीरियल कोशिकाओं के पृथक्करण के आधार पर बाइनरी लेयर में परिभाषित किया गया है।
        2. कोशिकाओं को थ्रेसहोल्ड करने के लिए, विश्लेषण नियंत्रण मेनू में थ्रेसहोल्ड विकल्प चुनें। ब्याज के चैनल का चयन करें और सीमा अंतराल मूल्यों को समायोजित करने के लिए फ्लोरेसेंस हिस्टोग्राम में सलाखों को स्लाइड करें।
          नोट: आरओआई के लिए बाइनरी ऑब्जेक्ट पहचान को बैक्टीरियल कोशिकाओं को थ्रेसहोल्ड करके फ्लोरोसेंट छवियों में भी परिभाषित किया जा सकता है। थ्रेसिंग स्थापित करता है जो फ्लोरेसेंस तीव्रता को वस्तुओं पर विचार किया जाता है और क्या फ्लोरेसेंस तीव्रता पृष्ठभूमि का गठन करती है।
  2. सेल ट्रैकिंग
    1. आरओआई को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने के लिए, इमेजिंग अनुक्रम में अगले फ्रेम का चयन करें और मूल बैक्टीरियल सेल की नई स्थिति के साथ संरेखित करने के लिए प्रत्येक आरओआई को क्लिक करके और खींचकर आरओआई की स्थिति को समायोजित करें।
      नोट: यदि बैक्टीरियल कोशिकाओं की स्थिति नहीं बदली है, तो आरओआई को स्थानांतरित करने की आवश्यकता नहीं है।
    2. सभी अनुक्रमिक फ्रेम में दोहराएं जिनके लिए कोशिकाओं को ट्रैक किया जाना है।
    3. कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, नए ROIs के रूप में बेटी कोशिकाओं को परिभाषित, के रूप में कदम ९.१ में वर्णित है, और नए विभाजित कोशिकाओं पर नज़र रखने शुरू करते हैं ।
      नोट: यदि कोशिकाओं की पहचान बाइनरी के रूप में की जाती है, तो चयनित फ़्रेम में आरओआई को स्वचालित रूप से ट्रैक करने के लिए ट्रैक बाइनरी फ़ंक्शन का उपयोग करें.
    4. एक बार कोशिकाओं को सभी चयनित फ्रेम के माध्यम से ट्रैक किया गया है, डेटा का विश्लेषण करने के लिए निर्यात ।
    5. डेटा स्प्रेडशीट खोलें और विश्लेषण के लिए आवश्यक मापों (यानी, ऑब्जेक्ट स्पीड, त्वरण या पथ लंबाई) की पहचान करें।
      नोट: निर्देशितता को मापने के मामले में, पथ लंबाई और लाइन लंबाई माप की आवश्यकता होती है। लाइन लंबाई यूक्लिडियन दूरी का एक माप है, या ट्रैक मूल से एस ऑरियस कॉलोनी के किनारे तक सीधी दूरी है। पथ लंबाई संचित दूरी का एक माप है, या सभी फ्रेम से ट्रैक सेगमेंट का योग है। निर्देशितता की गणना यूक्लिडियन दूरी, डी(ई), (लाइनलंबाई), संचित दूरी, डी(ए)(पथ लंबाई) के अनुपात के रूप में की जा सकती है।
  3. फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन
    1. चरण 9.1 में वर्णित फ्लोरोसेंट बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए आरओआई को परिभाषित करें।
    2. शेष फ्लोरोसेंट फ्रेम में बैक्टीरियल कोशिकाओं या समूहों के लिए आरओआई का ट्रेसिंग या मूवमेंट दोहराएं।
    3. फ्लोरोसेंट तीव्रता के विश्लेषण के लिए उत्पन्न तालिका को स्प्रेडशीट फ़ाइल में निर्यात करें।
    4. डेटा स्प्रेडशीट में, "मीन तीव्रता" के साथ कॉलम की तलाश करें जो ट्रेस किए गए बैक्टीरियल सेल (एस) आरओआई के लिए औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है।
    5. समय के साथ फ्लोरेसेंस में परिवर्तन को देखने के लिए मतलब तीव्रता मूल्यों ग्राफ।
      नोट: समय के साथ फ्लोरेसेंस में परिवर्तन फ्लोरोसेंटली लेबल जीन ऑफ इंटरेस्ट के लिए जीन अभिव्यक्ति के उतार-चढ़ाव का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

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Representative Results

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वर्णित विधि के सफल उपयोग के परिणामस्वरूप फ्रेम की एक श्रृंखला होगी जो एक वीडियो उत्पन्न करती है जिसमें समय के साथ अंतरप्रजाति इंटरैक्शन देखा जा सकता है। चित्रा 1 में योजनाबद्ध इमेजिंग के लिए सामग्री तैयार करने में शामिल महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करने के लिए एक दृश्य प्रदान करता है। इस विधि के उपयोग ने एस ऑरियस के साथ सहसंस्कृति बनाम मोनोकल्चर में विभिन्न व्यवहारों का प्रदर्शन करने वाली पी एरुगिनोसा कोशिकाओं के प्रदर्शन की अनुमति दी है। मोनोकल्चर में पी एरुगिनोसा कोशिकाओं की तुलना में जो राफ्ट में समूहित रहते हैं, जब एस ऑरियसके साथ कोकल्चर में, पी एरुगिनोसा ने एस ऑरियस कॉलोनियों(चित्रा 2A-2B)-2Bके प्रति एकल-कोशिका गतिशीलता में वृद्धि की है। फ्लोरोसेंटली लेबल बैक्टीरियल उपभेदों को भी जीवाणु प्रजातियों की मिश्रित आबादी की कल्पना करने की अनुमति देते हैं। जीएफपी-लेबल पी एरुगिनोसा का उपयोग करने से अवलोकन की अनुमति दी गई कि पी एरुगिनोसा एकल कोशिकाओं के गतिशीलता में वृद्धि के बाद, वे एस ऑरियस कॉलोनियों(चित्रा 2C)को घेर लेंगे और अंततः आक्रमण करेंगे। फ्लोरोसेंटली-मार्क की गई कोशिकाओं का उपयोग पहली बार(चित्र 2 सी, नीचे)के लिए एस ऑरियस कॉलोनियों में पी एरुगिनोसा सेल आक्रमण के दृश्य के लिए भी अनुमति देता है।

जबकि प्रोटोकॉल अंतरप्रजातियों की बातचीत को देखने के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की पैदावार करता है, कई सामान्य समस्याएं हैं जो खराब गुणवत्ता वाले फ्रेम दृश्यों का कारण बन सकती हैं। प्रयोग की अवधि में असंगत आर्द्रता और गलत तरीके से सूखे पैड दो आम समस्याएं हैं जो पैड शिफ्टिंग और इसके साथ कोशिकाओं को एफओवी(चित्रा 3 ए)से बाहर खींचने के परिणामस्वरूप बहाव का कारण बनती हैं। आर्द्रता में परिवर्तन एगर उठे पैड के सूखापन को प्रभावित करते हैं। बढ़ी हुई आर्द्रता पैड को बहुत गीला बनाती है, जिससे नमी पैड और ग्लास-बॉटम डिश के नीचे के बीच व्यवस्थित हो जाती है। नमी तरल की एक परत को काफी मोटी छोड़ देती है ताकि मोती कोशिकाओं को झुंड में रखा जा सके या तैरना हो और जीवाणु कोशिकाओं को एक ही विमान में नहीं रखा जाता है । इस बीच, आर्द्रता में कम हो जाती है पैड तेजी से सूखी है, जो कोशिकाओं पर जल्दी बहाव के कारण । फ्लोरेसेंस के साथ इस विधि का उपयोग करते समय एक और आम गलती फ्लोरोसेंट छवियों को भी अक्सर प्राप्त कर रही है या बैक्टीरियल कोशिकाओं को बहुत लंबे समय तक फ्लोरोसेंट प्रकाश में उजागर कर रही है। फ्लोरोसेंट छवियों के लिए लघु अधिग्रहण अंतराल बार-बार एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य की उच्च तीव्रता प्रकाश के साथ फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करते हैं। उत्तेजित फ्लोरोफोरस फिर ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, जिससे फ्लोरोफोर का क्षरण होता है। परिणामस्वरूप फोटोब्लैचिंग फ्लोरेसेंस को तब तक कम करता है जब तक कि फ्लोरोफोर को अधिक व्यक्त और जोड़ नहीं दिया जा सकता है, लेकिन बैक्टीरियल कोशिकाओं को खुद को नुकसान नहीं पहुंचाता है(चित्र 3 बी)। फ्लोरेसेंस की हानि, हालांकि, जीन/प्रोटीन अभिव्यक्ति के माप के साथ हस्तक्षेप करता है, कोशिकाओं को मार्करलेस छोड़ जब तक फ्लोरोफोर पूरी तरह से संश्लेषित और फिर से उत्साहित किया जा सकता है । इसके अलावा, उत्तेजित फ्लोरोफोरस के साथ बातचीत करने वाली ऑक्सीजन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का रूप ले सकती है। ये आरओएस रेडिकल्स तब बैक्टीरियल कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हैं, अंततः विषाक्त होते जा रहे हैं और जिसके परिणामस्वरूप कुछ सेल डिवीजनों(चित्रा 3 सी)के भीतर सेल की मौत होती है। फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सीसिटी की प्रक्रियाओं को आसानी से देखा जा सकता है क्योंकि कोशिकाएं पहले अपनी फ्लोरेसेंस को पूरी तरह से खो देंगी, और बाद के फ्रेम में, कोशिकाएं विभाजित होना बंद कर देंगी और अंततः मर सकती हैं(चित्रा 3 बी-3सी)।-3C प्रयोग की स्थापना करते समय एक अंतिम आम मुद्दा एफओवी प्रति भी कई कोशिकाओं के साथ शुरू हो रहा है या कोशिकाओं के साथ भी एक दूसरे के करीब है, जो आम तौर पर 20 माइक्रोन के अलावा कम है । पहले फ्रेम में भीड़ कोशिकाओं को विभाजित करने के समूहों कि बस एक दूसरे में विलय के रूप में वे बढ़ने के बजाय बातचीत होगी । इसके अतिरिक्त, निकटता में बहुत करीब शुरू होने वाली कोशिकाओं के पास स्रावित संकेतों के ढाल स्थापित करने के लिए पर्याप्त समय नहीं हो सकता है, जिसके लिए अन्य प्रजातियां जवाब दे सकतीहैं (चित्रा 3 डी)जबकि सुदूर जीवाणु कोशिकाओं को प्रयोग की अवधि के भीतर एक-दूसरे का सामना करने का मौका नहीं मिल सकता है।

चित्रा 4 इस बात का उदाहरण दिखाता है कि एगरैज पैड में प्रोपिडियम आयोडाइड जोड़कर इस प्रोटोकॉल के साथ बैक्टीरियल सेल व्यवहार्यता की कल्पना कैसे की जा सकती है। प्रोपिडियम आयोडाइड जीवित कोशिकाओं के लिए अभेद्य है, लेकिन क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है और न्यूक्लिक एसिड से बांध सकता है। यहां मिड-लॉग जीएफपी-लेबल वाले डब्ल्यूटी एस ऑरियस का अकेले मीडिया के साथ या पी एरुगिनोसा से प्राप्त सेल-फ्री सुपरनैंट के साथ इलाज किया गया और उपचार के तुरंत बाद इमेज्ड किया गया। तीन अलग-अलग चैनलों को इमेज किया गया था: चरण, TxRed और GFP। उज्ज्वल हरी कोशिकाओं को सक्रिय रूप से GFP व्यक्त करने का संकेत मिलता है के रूप में एस ऑरियस के लिए देखा केवल मीडिया(चित्रा 4A)के साथ इलाज किया, और लाल कोशिकाओं मृत प्रोसिडियम आयोडाइड दाग एस ऑरियस कोशिकाओं का संकेत है, के बाद पी aeruginosa supernatant(चित्रा 4B)के साथ इलाज किया जा रहा है । जबकि केवल एक बार बिंदु दिखाया गया है, इस विधि को समय-चूक लाइव इमेजिंग के दौरान सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

अंतरप्रजाति इंटरैक्शन के पहलुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, सेल ट्रैकिंग एस ऑरियस के एक क्लस्टर की ओर पी एरुगिनोसा एकल सेल आंदोलनों के निर्देश के लिए माप प्रदान कर सकते हैं । व्यक्तिगत पी एयरोगिनोसा कोशिकाओं के आंदोलनों को फ्रेम से ट्रैक किया जाता है एक सेल फ्रेम के माध्यम से बेड़ा छोड़ देता है जिसमें सेल एस ऑरियस क्लस्टर(चित्रा 5A)तक पहुंचता है। पी एरुगिनोसा बेड़ा और एस ऑरियस क्लस्टर के बीच की दूरी यूक्लिडियन दूरी, डी(ई)प्रदान करती है, जबकि कुल ट्रैक लंबाई संचित दूरी, डी(ए) (चित्रा 5B)प्रदान करती है। प्रत्येक कोशिका की निर्देशीयता की गणना डी(ई)/डी(ए)के अनुपात के रूप में की जाती है । कोकल्चर प्रयोगों में, डब्ल्यूटी पी एरुगिनोसा ने एस ऑरियस एग्रेब्लिक कीतुलना में काफी अधिक निर्देश के साथ डब्ल्यूटी एस ऑरियस की ओर बढ़ गए, जो एजीआर-विनियमित स्रावित कारकों की कमी वाले उत्परिवर्ती थे, जो पहले एस ऑरियस24 (चित्रा 5C)की ओर दिशात्मक गतिशीलता के लिए आवश्यक होना निर्धारित करते थे।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग सेटअप प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध।
बैक्टीरियल संस्कृतियों और एगर उठे पैड की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण चरणों का अवलोकन। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: समय-चूक, लाइव इमेजिंग माइक्रोस्कोपी पी एयरोगिनोसा व्यवहार में अंतर दिखाता है जब एस ऑरियस के साथ cocultured ।
मोनोकल्चर(ए)में पी एरुगिनोसा (बेसिली, ग्रीन) के प्रतिनिधि स्नैप शॉट्स और एस ऑरियस (कोसी, अचिह्नित)(बी)के साथ कोकल्चर में। (ग)फ्लोरोसेंटली-लेबल बैक्टीरिया पी एरुगिनोसा एकल कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं जो एस ऑरियस क्लस्टर पर हमला करते हैं । फेज कंट्रास्ट और जीएफपी चैनल ओवरले (ऊपर) और जीएफपी चैनल अकेले (नीचे) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आम इमेजिंग मुद्दों के प्रतिनिधि स्नैप शॉट्स जो खराब छवि अधिग्रहण का कारण बनते हैं।
(क)अनुचित रूप से सूखे पैड और असंगत आर्द्रता इमेजिंग की अवधि में एफओवी में कोशिकाओं को बहती हुई जन्म देती है। संस्थापक प्रकोष्ठ की स्थिति प्रत्येक फ्रेम (हरी रॉड) में चिह्नित है। (ख)बहुत लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क में आने से फोटोब्लैचिंग से समय की अवधि के लिए फ्लोरेसेंस का पता लगाने योग्य स्तर समाप्त हो जाएगा, लेकिन कोशिकाओं को नहीं मारता है । (ग)प्रकाश के बार-बार संपर्क में आने के परिणामस्वरूप फोटोटोक्सिसिटी से सेल डेथ हो जाती है । फोटोटॉक्सिसिटी के पहले लक्षण तब देखे जाते हैं जब कोशिकाएं फ्लोरेस्किंग बंद कर देती हैं और विभाजित करने में विफल हो जाती हैं। (घ)एफओवी में उच्च प्रारंभिक इनोकुलम भीड़ कोशिकाएं और अंतरप्रजाति इंटरैक्शन के अवलोकन को रोकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जीवित बनाम मृत एस ऑरियस कोशिकाओं की तुलना।
GFP लेबल WT एस ऑरियस के लिए प्रतिनिधि स्नैप शॉट्स या तो मध्यम अकेले(ए)या सेल मुक्त पी aeruginosa supernatant(बी)के साथ इलाज किया । कोशिकाओं को तुरंत उपचार के बाद चित्रित किया गया । लाइव कोशिकाएं (हरी) सक्रिय रूप से जीएफपी को व्यक्त करती हैं और प्रोपिडियम आयोडाइड को बाहर करती हैं, जबकि मृत कोशिकाएं (लाल) जीएफपी फ्लोरेसेंस खो देती हैं और झिल्ली पारमेबिलाइजेशन प्रॉपिडियम आयोडाइड को कोशिकाओं में प्रवेश करने और न्यूक्लिक एसिड को बांधने की अनुमति देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एस ऑरियसके साथ सहसंस्कृति में पी एरुगिनोसा का सेल ट्रैकिंग विश्लेषण ।
पहले, इस विधि का उपयोग डब्ल्यूटी याएग्रैबडीसीए एस ऑरियसके साथ कोकल्चर में डब्ल्यूटी पी एरुगिनोसा की सेल ट्रैकिंग करने के लिए किया गया था। (A)एस ऑरियस एग्रीएनबीडीसीएके साथ एक सहसंस्कृति में पी एरुगिनोसा एकल कोशिका पटरियों का प्रतिनिधित्व । (ख)यूक्लिडियन दूरी (डी(ई)के लिए योजनाबद्ध और संचित दूरी (डी(ए)माप निर्देशितता ((ई) /डी(ए)निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।(E) (ग)डब्ल्यूटी औरएजीआरबीडीसीए एस ऑरियसके साथ कोकल्चर में एकल डब्ल्यूटी पी एरुगिनोसा कोशिकाओं का निर्देशन माप । इस आंकड़े को लिमोली एट अल 201924से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

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यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों में सेल ट्रैकिंग और निगरानी सेल व्यवहार्यता सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए संशोधनों के साथ एकल-सेल स्तर पर बैक्टीरियल प्रजातियों की बातचीत के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह विधि समय के साथ अन्य प्रजातियों के साथ सहसंस्कृति में सूक्ष्मजीवों के एकल-कोशिका व्यवहार का अध्ययन करने के लिए नए रास्ते खोलती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल बैक्टीरियल सतह व्यवहार को देखने में इस कूँण विधि की उपयोगिता को दर्शाता है, विशेष रूप से उन जीवों का अध्ययन करते समय जिनमें गतिशीलता के लिए सतह और तरल दोनों से जुड़े उपांग होते हैं। उदाहरण के लिए, ध्यान के एक विमान में एक सतह के लिए जीवाणु आंदोलन को सीमित करके, एस ऑरियस के जवाब में पी एरुगिनोसा की बढ़ी हुई और दिशात्मक पीली-मध्यस्थता की कल्पना की जा सकती है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस इमेजिंग विधि के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए नमूना और इमेजिंग उपकरणों (यानी, उद्देश्यों और चरण) के तापमान और आर्द्रता सहित कई स्थितियों पर विचार करने की आवश्यकता है। अधिक सुझावों और समस्या निवारण के लिए, पूरक फ़ाइल 1देखें । प्रोटोकॉल के सफल उपयोग में एक महत्वपूर्ण कदम एग्राजिंग पैड की तैयारी है, क्योंकि अपर्याप्त रूप से सुखाने वाले पैड सबसे आम समस्याओं में से एक है। जैसा कि चित्रा 3Aमें दिखाया गया है, यदि पैड काफी लंबे समय तक सूख नहीं जाते हैं, तो बहाव समय-चूक इमेजिंग की शुरुआत में दिखाई देता है, जबकि पैड जो बहुत लंबे समय तक सूख जाते हैं, सिकुड़ने लगते हैं और कोशिकाएं फओव से कुछ घंटों इमेजिंग में बहती हैं। यह सुनिश्चित करना कि सभी सामग्रियों को पूर्व-गर्म किया जाता है और प्रयोग की अवधि में एक समान तापमान और आर्द्रता पर बनाए रखा जाता है, एक चरण-शीर्ष इनक्यूबेटर और नम लिंट-फ्री वाइप्स के उपयोग के माध्यम से, बहाव को कम करने में मदद करेगा। यह भी सलाह दी जाती है कि एक बैकअप पैड हमेशा के मामले में पहले पैड ठीक से सूख नहीं है या मोल्ड से नमूना पकवान के लिए हस्तांतरण के दौरान आंसू बनाया है । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को इमेजिंग करते समय माध्यम से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए, बैक्टीरियल संस्कृतियों को बढ़ाने के लिए और पैड बनाने के लिए कम-ऑटोफ्लोरेसेंस माध्यम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। माइक्रोस्कोपी के लिए न्यूनतम मीडिया का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि अमीर मीडिया में अक्सर उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस होता है। कम घनत्व वाले इनोकुलम और यहां तक कि एफओवी में कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के साथ शुरू करना भी इस विधि में प्रमुख कारक हैं। विशेष रूप से, पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने वाले पूर्व अध्ययनों में, इससे बैक्टीरिया को स्रावित कारकों का पर्याप्त ढाल उत्पन्न करने की अनुमति मिली, जिसे वर्तमान अन्य प्रजातियों(चित्रा 2 बी)द्वारा पता लगाया जा सकता है।

इस विधि के लाभों के बावजूद, इसकी कीमत, कम थ्रूपुट प्रकृति, फ्लोरेसेंस प्रतिबंध, और पर्यावरणीय स्थितियों को नियंत्रित करने पर उच्च निर्भरता सहित सीमाएं भी हैं। चित्रा 3B-3C-3C फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की प्रमुख सीमाएं दिखाते हैं। जैसा कि परिणाम अनुभाग में चर्चा की गई है, यदि फ्लोरोसेंट छवियों को कम अंतराल में कैप्चर किया जाता है, तो फोटोब्लेचिंग और फोटोटोक्सिसिटी हो सकती है। इन दो परिणामों से बचने के लिए, फ्लोरोसेंट छवि अंतराल को काफी दूर ले जाया जाना चाहिए और फ्लोरोफोर को पर्याप्त रूप से कल्पना करने के लिए जितना संभव हो उतना कम फ्लोरोसेंट प्रकाश एक्सपोजर समय के साथ लिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अंतराल का निर्धारण करते समय, प्रत्येक फ्लोरोफोर के परिपक्वता समय पर विचार करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, चित्रा 2, चित्रा 3 और चित्रा 4में दिखाए गए पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस उपभेदों में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस में लगभग 20 मिनट का परिपक्वता समय होता है और इसलिए संभावित फोटोब्लैचिंग प्रभावों की चिंता के बिना हर 20 मिनट में उत्साहित किया जा सकता है। इस बीच, इस विधि का एक और नुकसान यह है कि यह देर से अंतरप्रजाति बातचीत की टिप्पणियों के लिए अनुमति नहीं देता है एक बार कोशिकाओं को एक उच्च सेल घनत्व तक पहुंचने । व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, उन्हें ध्यान के एक विमान में रहना चाहिए। हालांकि, एक बार जनसंख्या एक उच्च कोशिका घनत्व तक पहुंच जाता है, कोशिकाओं को एक से अधिक विमान में विकसित करने के लिए शुरू करते हैं ।

इस विधि को विभिन्न फेनोटाइप जैसे सेल व्यवहार्यता(चित्रा 4)और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति (डेटा नहीं दिखाए गए) का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। चित्रा 4 इस बात का उदाहरण दिखाता है कि कैसे विधि को एगरेज़ पैड में प्रोपिडियम आयोडाइड जोड़कर बैक्टीरियल व्यवहार्यता की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस विधि का एक अन्य अनुप्रयोग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के माध्यम से किसी अन्य जीव के साथ सहसंस्कृति में जीवाणु जीन/प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापना है । उदाहरण के लिए, एक साथ विभिन्न जीन या प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक प्लाज्मिड वेक्टर या बैक्टीरियल गुणसूत्र में कई फ्लोरोफोरस को शामिल किया जा सकता है। यहां फ्लोरोफोरस का चयन करना महत्वपूर्ण है जिसमें ओवरलैपिंग एक्सिटेशन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा नहीं है। अंत में, पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण में बैक्टीरियल सेल ट्रैकिंग का उपयोग दिशात्मकता(चित्रा 5),गति और त्वरण, अन्य मापों के बीच, गणना करने में सक्षम बनाता है, साथ ही24।

कुल मिलाकर, पहले वर्णित मोनोकल्चर प्रोटोकॉल से अनुकूलित यह कोकल्चर इमेजिंग विधि कोरकल्चर में कई जीवाणु प्रजातियों के व्यवहार की कल्पना करने की क्षमता को बढ़ाती है। यह विधि एक मिश्रित संस्कृति के नजरिए से रोगाणुओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती है, जो इस बात की समझ में वृद्धि करेगी कि प्रत्येक प्रजाति अपने व्यवहार को एकल-कोशिका तरीके से कैसे बदल देती है, अंततः बैक्टीरियल प्रजातियां पॉलीमाइक्रोबियल वातावरण में कैसे बातचीत करती हैं, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन पोस्टडॉक-टू-फैकल्टी ट्रांजिशन अवार्ड लिमोली18एफ5 (डीएचएल), सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन जूनियर फैकल्टी रिक्रूटमेंट अवार्ड लिमोली19आर3 (डीएचएल) और एनआईएच टी32 ट्रेनिंग ग्रांट 5T32एच007638-34 (एएसपी) से फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया । हम जेफरी Meisner, मिंसु किम, और एसे गार्नर इमेजिंग और पैड बनाने के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल और सलाह साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass Cellvis D35-20-1.5-N One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes Kimberly-Clark Professional 06-666A
Low-Melt Agarose Nu-Sieve GTG/Lonza 50081 For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas VWR 82027-492
Round-Tapered Spatulas VWR 82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive Sigma-Aldrich S6685-25EA For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm Kord-Valmark /sold by RPI 2900
Tweezers VWR 89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose RPI G32045
KH2PO4 RPI P250500
MgSO4 Sigma-Aldrich 208094
NaCl RPI S23025
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
Tryptone BD Biosciences DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11 Andor 77026135 Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP Nikon 96372 Filter cube
Filter Cube TxRed Nikon 96375 Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER Okolab 77057447 Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking Nikon 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse Nikon Model Ti2-E Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) Nikon MRD00205 Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) Nikon MRD31905 Objective
ThermoBox with built-in fan heaters Tokai Hit TI2TB-E-BK Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) PMID: 7604262 Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) PMID: 23404398 USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide Invitrogen L7012 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit

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References

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एकल-सेल इंटरप्रीपी बैक्टीरियल इंटरैक्शन का गतिज दृश्य
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Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).More

Yarrington, K. D., Sánchez Peña, A., Limoli, D. H. Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (162), e61376, doi:10.3791/61376 (2020).

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