単細胞間細菌相互作用の運動的可視化
Summary
この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。
Abstract
多微生物群集は自然界でユビキタスであるが、単細胞レベルでの相互作用の研究は困難である。このように、2つの細菌病原体間の種間相互作用を観察するための顕微鏡ベースの方法が開発された。この方法を用いて、モチルグラム陰性病原体、 緑膿 菌および非可動性グラム陽性病原体との相互作用を問い合う方法を用 いることが、 ここで実証されている。このプロトコルは、カバースリップとアガロースパッドの間の各種を共同接種することで構成され、細胞を単一平面に維持し、空間と時間の両方で細菌の挙動を視覚化することができます。
さらに、ここで示したタイムラプス顕微鏡は、単一培養や他の種との共培養における細菌種運動性の変化を含む、2種以上の細菌種間で起こる初期の相互作用を視覚化するのに理想的である。顕微鏡の設定では限られたサンプル空間の性質上、このプロトコルは、細胞集団が高すぎると細菌種間の後の相互作用を研究するために適用されにくい。しかし、生きた細菌細胞や死んだ細菌細胞のイメージングのための染色の使用、蛍光レポーターによる遺伝子またはタンパク質発現の定量、単一種および多種実験の両方における細菌細胞の動きを追跡するプロトコルのいくつかの異なる用途があります。
Introduction
多微生物群集は、環境,1、2、3、2および1人間のニッチ34、55の様々なにまたがる4自然界で一般的です。ヒト疾患における最も悪名高い多微生物感染症のいくつかは、歯科バイオフィルム6、慢性創傷77、8、8慢性閉塞性肺疾患9、人工呼吸器関連肺炎10、および遺伝性疾患嚢胞性線維症(CF)11、12を有する個人における11,12呼吸器感染症を含む。これらの感染症は、多くの場合、多様な微生物種で構成されています。しかし、最近では、グラム陽性菌黄色ブドウ球菌とグラム陰性菌シュードモナス・エルギノーサとの相互作用に注目が集まった。これらの生物に対してコイン感染した患者およびインビトロ分析を含む研究は、疾患の進行、微生物の生存、病原性、代謝および抗生物質感受性に深い影響を及ぼす可能性のある競争的および協力的相互作用の両方を明らかにする(Hotterbeekxら201713とリモリとホフマン20193によって詳細にレビュー)。
感染時の種間相互作用への関心の高まりは、多微生物群集行動を研究するための様々な方法をもたらしました。典型的には、これらの研究は、単一培養と共培養の表現型の違いを調査するためにプレートまたはブロスベースのアッセイを利用している。例えば、固体表面上のP.緑素吸草およびS.アウレウスをコキュリングすることは、コロニー表現型、顔料、または多糖産生14、15、1615,16の成長阻害または変化の視覚化14を可能にした。混合種バイオフィルムは、生物または生物的表面上、ならびに液体培養における細菌種の交成も、遺伝子およびタンパク質発現17、18,18に加えて、成長、代謝、抗生物質耐性、競合および生存率の変化の測定を可能にした。これらのバルク培養実験は、P.緑素吸盤とS.アウレウスがコミュニティ規模でどのように影響を与えるかについての洞察を明らかにしているが、単一細胞レベルで起こる相互作用に関する重要な質問に答えることができない。ここで示す方法は、時間の経過とともに共培養されたコミュニティ内の単一細胞の動き、細胞生存率、および遺伝子発現の変化に焦点を当てることによって、種間相互作用を研究するためのアプローチを追加します。
単一細胞相互作用は、細胞のバルクコミュニティで行われる相互作用とは大きく異なる場合があります。単一細胞解析を通じて、コミュニティ内の異質性を定量化して、細胞の空間配置がコミュニティダイナミクスに与える影響や、グループの個々のメンバー内での遺伝子およびタンパク質発現レベルの変化を研究することができます。また、追跡セルは、複数の世代を通じて、単一のセルがどのように移動し、動作するかを把握できます。細胞の動きと遺伝子発現の変化を同時に追跡することで、遺伝子の変動とそれに対応する表現型との間に相関関係を作ることができます。単細胞レベルで個々の細菌種を研究するための以前のプロトコルが記載されている。これらの研究は、単一の平面における経時の生画像細胞を利用し、細胞分裂および抗生物質感受性19,20,20のような表素型を観察するのに有用であった。付加的な生画像顕微鏡は単一細菌種21、22、23,22,23の成長、運動性、表面の植民地化およびバイオフィルム形成を監視するために利用されている。しかし、これらの研究は、単一培養における細菌の生理学を理解するための洞察力を有するが、共培養における複数の細菌種の単細胞挙動を観察するための実験は限られている。
ここでは、単一種のイメージングに使用される以前のプロトコルは、P.緑素吸草症とS.アウレウスの相互作用を研究するために適応されてきた。これらの生物は、その細胞形態に基づいて位相コントラスト下で分化することができる(P.緑分症はバチルス及びS.アウレウスはコッシである)。この方法の開発は、最近、S.アウレウス24の存在下でのP.緑内因性の以前に記述されていない運動性行動の可視化を可能にした。P. aeruginosaは、遠くからS.アウレウスを感知し、S.アウレウス細胞のクラスターに向かって増加し、方向単一細胞の動きに応答することができることが判明した。P.アウレウスに向かう緑素吸い動きはIV型ピリ(TFP)を必要とすることが分かったが、その協調的な伸張と引き込みが筋状運動性25と呼ばれる動きを生み出す毛髪状突起。
これらの研究は、種間の以前の相互作用を尋問するためのこの方法の有用性を示している。しかし、後で相互作用する時点で高い細胞密度でのイメージングは、細胞の単一層を識別できなくなったため困難であり、これは主にポストイメージング解析中に問題を引き起こす。この制限を考えると、この方法は、後の相互作用を代表する高い細胞密度で従来の巨視アッセイをフォローアップできる以前の相互作用に最も適しています。この方法の追加の制限は、一度に1つのサンプルしか画像化できないので、低スループットの性質と、顕微鏡、カメラ、および環境室のコストが含まれます。また、蛍光顕微鏡は、光毒性や光漂白などの細菌細胞にリスクをもたらし、蛍光画像を取得できる頻度を制限します。最後に、この方法で使用されるアガロースパッドは、環境の変化に対して非常に影響を受けやすく、条件が正しくない場合にパッドが収縮または膨張し始めることができることを考えると、温度および湿度などの条件を制御することが重要です。最後に、この方法は宿主環境を模倣するものではありませんが、異なる細菌種が表面でどのように反応するかの手がかりを提供し、環境/宿主状態を模倣するように設計されたアッセイでフォローアップすることができます。
この方法は、単一細胞の動きを追跡する以前の研究とは異なり、細胞はカバースリップとアガロースパッドの間に接種され、細胞を表面に制限する。これにより、単一平面での時間経過に従ったセルトラッキングが可能になります。しかし、細胞が液体26に沈下されたときに観察される過渡的な表面関与のサイクルを制限する。アガロースパッドの下で細菌をイメージングする追加の利点は 、P.緑化 吸引運動性25を調べるために古典的に使用される巨視的なプレートベースのサブ表面接種アッセイを模倣していることである。このアッセイでは、細菌細胞はペトリ皿の底部と寒天の間に接種され、この顕微鏡プロトコルと同様に、接種の点から皿の底を外側に移動する細胞を単一の平面に保ちます。
ここで提示される種間相互作用を視覚化するためのタイムラプス顕微鏡プロトコルは、1)細菌試料およびアガロースパッドを調製し、2)イメージング取得用の顕微鏡設定を選択し、3)画像後分析から構成される。細胞の動きと追跡の詳細な視覚化は位相コントラストによって短時間間隔で画像を集録することによって行うことができる。蛍光顕微鏡は、経時の細胞生存率または遺伝子発現を決定するために利用することもできる。ここでは、アガロースパッドに生用染料を添加して蛍光顕微鏡に適応した例を1つ示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示される方法は、単細胞レベルでの細菌種相互作用の生細胞イメージングのためのプロトコルと、細胞追跡および細胞生存率の監視を含む他のアプリケーションの変更について説明する。この方法は、時間の経過とともに他の種との共培養における微生物の単細胞挙動を研究するための新しい道を開きます。具体的には、このプロトコルは、特に運動性のための表面および液体関連?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、嚢胞性線維症財団ポスドク間移行賞LIMOLI18F5(DHL)、嚢胞性線維症財団ジュニア教員採用賞LIMOLI19R3(DHL)、NIH T32トレーニンググラント5T32HL007638-34(ASP)からの資金提供によって支えられました。ジェフリー・マイズナー、ミンス・キム、イーサン・ガーナーが最初のプロトコルと、イメージングとパッドの作成に関するアドバイスを共有してくれたことに感謝します。
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
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