Kinetisk visualisering av encellede interarter bakterielle interaksjoner
Summary
Denne live-bakterielle celleavbildningsprotokollen muliggjør visualisering av interaksjoner mellom flere bakterielle arter på encellenivå over tid. Time-lapse imaging gjør det mulig for observasjon av hver bakteriell art i monokultur eller kokultur for å avhøre interspecies interaksjoner i multispecies bakterielle samfunn, inkludert individuelle cellemotilitet og levedyktighet.
Abstract
Polymikrobielle samfunn er allestedsnærværende i naturen, men å studere deres interaksjoner på encellenivå er vanskelig. Dermed er en mikroskopibasert metode utviklet for å observere interspecies interaksjoner mellom to bakterielle patogener. Bruken av denne metoden for å avhøre interaksjoner mellom et motilt Gram-negativt patogen, Pseudomonas aeruginosa og et ikke-motilt Gram-positivt patogen, er Staphylococcus aureus demonstrert her. Denne protokollen består av å co-inokulere hver art mellom en coverslip og en agarose pad, som opprettholder cellene i et enkelt plan og tillater visualisering av bakteriell atferd i både rom og tid.
Videre er time-lapse mikroskopi demonstrert her ideell for å visualisere de tidlige interaksjonene som finner sted mellom to eller flere bakterielle arter, inkludert endringer i bakterielle arter motilitet i monokultur og i kokultur med andre arter. På grunn av arten av det begrensede utvalgsrommet i mikroskopioppsettet, er denne protokollen mindre gjeldende for å studere senere interaksjoner mellom bakterielle arter når cellepopulasjonene er for høye. Det finnes imidlertid flere forskjellige anvendelser av protokollen som inkluderer bruk av farging for avbildning av levende og døde bakterielle celler, kvantifisering av gen- eller proteinuttrykk gjennom fluorescerende journalister, og sporing av bakteriell cellebevegelse i både enkeltarter og multispecies eksperimenter.
Introduction
Polymikrobielle samfunn er vanlige i naturen, som strekker seg over en rekke miljømessige1,,2,,3 og menneskelige nisjer4,5. Noen av de mest beryktede polymikrobielle infeksjonene i menneskelig sykdom inkluderer tannbiofilmer6,kroniskesår 7,,8og luftveisinfeksjoner hos personer med kronisk obstruktiv lungesykdom9, ventilator-assosiert lungebetennelse10, og den genetiske sykdommen cystisk fibrose (CF)11,12. Disse infeksjonene består ofte av ulike mikrobielle arter; Imidlertid har et nylig fokus på samspillet mellom den Gram-positive bakterien Staphylococcus aureus og Gram-negative bakterien Pseudomonas aeruginosa dukket opp. Studier inkludert pasienter som er sammenfvelt med disse organismene og in vitro-analysene, viser både konkurransedyktige og samarbeidende interaksjoner som kan ha dype og uventede påvirkninger på sykdomsprogresjon, mikrobiell overlevelse, virulens, metabolisme og antibiotikafølsomhet (gjennomgått i detalj av Hotterbeekx et al. 201713 og Limoli og Hoffman 20193).
Den økende interessen for interspecies interaksjoner under infeksjon har gitt en rekke metoder for å studere polymikrobiell samfunnsatferd. Vanligvis har disse studiene benyttet plate- eller buljongbaserte analyser for å undersøke fenotypiske forskjeller mellom monokultur og kokultur. For eksempel har koculturing P. aeruginosa og S. aureus på faste overflater tillatt for visualisering av veksthemming eller endringer i kolonifenotype, pigment eller polysakkaridproduksjon14,,15,,16. Biofilmer av blandede arter, på biotiske eller abiotiske overflater, samt koculturing bakterielle arter i flytende kultur har også gjort det mulig å måle endringer i vekst, metabolisme, antibiotikatoleranse, konkurranse og levedyktighet, i tillegg til gen- og proteinuttrykk17,18. Mens disse bulk kultureksperimentene har avslørt innsikt i hvordan P. aeruginosa og S. aureus kan påvirke hverandre på samfunnsskalaen, kan de ikke svare på viktige spørsmål om interaksjonene som finner sted på encellenivå. Metoden som presenteres her legger til tilnærmingene for å studere interspecies interaksjoner ved å fokusere på endringene i bevegelse, celle levedyktighet, og genuttrykk av enkeltceller i et kokulturert samfunn over tid.
Encellede interaksjoner kan avvike fra interaksjonene som finner sted i et bulkfellesskap av celler. Gjennom encelleanalyse kan heterogenitet i et samfunn kvantifiseres for å studere hvordan romlig plassering av celler påvirker samfunnsdynamikken eller hvordan gen- og proteinuttrykksnivåer endres i individuelle medlemmer av en gruppe. Sporing av celler kan også gi innsikt i hvordan enkeltceller beveger seg og oppfører seg over tid, gjennom flere generasjoner. Ved å spore cellebevegelse og endringer i genuttrykk samtidig, kan det gjøres korrelasjoner mellom gensvingninger og tilsvarende fenotyper. Tidligere protokoller for å studere individuelle bakterielle arter på encellenivå er beskrevet. Disse studiene dra nytte av live-imaging celler over tid i et enkelt plan, og har vært nyttig for å observere fenotyper som celledeling og antibiotikamottakelighet 19,20. Ytterligere live-imaging mikroskopi har blitt benyttet til å overvåke vekst, motilitet, overflatekolonisering og biofilm dannelse av enkelt bakteriellearter 21,,22,,23. Men mens disse studiene har vært innsiktsfulle for å forstå fysiologien til bakterier i monokultur, er eksperimenter for å observere encellede atferd av flere bakterielle arter over tid i kokultur begrenset.
Her er tidligere protokoller som brukes for enkeltartsavbildning tilpasset studieinteraksjoner mellom P. aeruginosa og S. aureus. Disse organismene kan differensieres under fasekontrast basert på deres cellemorfologier (P. aeruginosa er bacilli og S. aureus er cocci). Utvikling av denne metoden nylig aktivert visualisering av tidligere ubeskrevet motilitet atferd av P. aeruginosa i nærvær av S. aureus24. P. aeruginosa ble funnet å være i stand til å føle S. aureus på avstand og reagere med økt og retningsbestemte encellebevegelser mot klynger av S. aureusceller. P. aeruginosa bevegelse mot S. aureus ble funnet å kreve typen IV pili (TFP), hårlignende projeksjoner hvis koordinert forlengelse og tilbaketrekking genererer en bevegelse kalt rykninger motilitet25.
Disse studiene viser nytten av denne metoden for avhør av tidligere interaksjoner mellom arter. Bildebehandling ved høycelletetthet ved senere interaksjonstidspunkter er imidlertid vanskelig gitt at enkeltlag med celler ikke lenger kan identifiseres, noe som for det meste utgjør problemer under analyse etter bildebehandling. Gitt denne begrensningen er metoden best egnet for tidligere interaksjoner som deretter kan følges opp med tradisjonelle makroskopiske analyser ved høyere celletettheter som er representative for senere interaksjoner. Ytterligere begrensninger av denne metoden inkluderer lav gjennomstrømmingsnatur, siden bare en prøve kan avbildes om gangen og kostnaden for mikroskopet, kameraet og miljøkammeret. Videre utgjør fluorescensmikroskopi risiko for bakteriecellene som fototoksisitet og fotobleaching, og begrenser derfor frekvensen som fluorescensbilder kan anskaffes. Til slutt er agarose pads som brukes i denne metoden svært utsatt for endringer i miljøet, noe som gjør det avgjørende for å kontrollere for forhold som temperatur og fuktighet, gitt at putene kan begynne å krympe eller utvide hvis forholdene ikke er riktige. Til slutt, mens denne metoden ikke etterligner vertsmiljøet, gir den ledetråder for hvordan forskjellige bakterielle arter reagerer på overflater, som kan følges opp i analyser designet for å etterligne miljø / vertsforhold.
Denne metoden er forskjellig fra tidligere studier som sporer encellede bevegelser, ved at cellene er inokulert mellom en coverslip og agarose pad, som begrenser celler til overflaten. Dette gjør det mulig for cellesporing over tid i ett enkelt plan; Begrenser imidlertid sykluser av forbigående overflateengasjement observert når celler er nedsenket i væske26. En ekstra fordel med å bilde bakterier under en agarose pad er at den etterligner makroskopisk platebaserte sub-overflate inokulasjonsanalyser klassisk brukes til å undersøke P. aeruginosa rykninger motilitet25. I denne analysen er bakterielle celler inokulert mellom bunnen av en petriskål og agaren, og holder cellene i et enkelt plan når de beveger seg over bunnen av parabolen utover fra inokulasjonspunktet, mye som denne mikroskopiprotokollen.
Time-lapse mikroskopi protokollen for visualisering av interspecies interaksjoner presentert her består av 1) forbereder bakteriell prøve og agarose pad, 2) velge mikroskop innstillinger for imaging oppkjøp og 3) etter bildebehandling analyse. Detaljert visualisering av cellebevegelse og sporing kan utføres ved oppkjøp av bilder med korte tidsintervaller etter fasekontrast. Fluorescensmikroskopi kan også brukes til å bestemme cellelevabilitet eller genuttrykk over tid. Her viser vi ett eksempel på tilpasning for fluorescensmikroskopi gjennom tilsetning av levedyktighetsfargestoffer til agarose pads.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som presenteres her beskriver en protokoll for levende-celle avbildning av bakterielle arter interaksjoner på encellenivå med modifikasjoner for andre applikasjoner, inkludert cellesporing og overvåking av cellelevebilitet. Denne metoden åpner nye veier for å studere encellede atferd av mikroorganismer i kokultur med andre arter over tid. Spesielt viser protokollen nytten av denne kokulturmetoden for å observere bakteriell overflateatferd, spesielt når man studerer organismer som har både overflate- og v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), og NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi takker Jeffrey Meisner, Minsu Kim og Ethan Garner for å dele innledende protokoller og råd for bildebehandling og lage pads.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
