यह वयस्क और उम्र बढ़ने माउस हिप्पोकैम्पी से तीव्र टुकड़ा तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो ऊतक को हाइपोक्सिक क्षति को कम करने के लिए बर्फ-ठंडे एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और स्लाइस कटिंग का लाभ उठाता है। जिसके परिणामस्वरूप स्लाइस कई घंटों में स्वस्थ रहते हैं, और दीर्घकालिक पैच-क्लैंप और फील्ड-रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं।
तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस ने न्यूरोसाइंटिस्टों की पीढ़ियों को विस्तार से और उच्च निष्ठा के साथ सिनैप्टिक, न्यूरोनल और सर्किट गुणों का पता लगाने में सक्षम बनाया है। एलटीपी और लिमिटेड तंत्र, एकल न्यूरॉन डेंड्रिटिक गणना, और सर्किटरी में अनुभव पर निर्भर परिवर्तन की खोज, इस शास्त्रीय तैयारी के बिना संभव नहीं होता। हालांकि, कुछ अपवादों के साथ, तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग करके सबसे बुनियादी शोध अपेक्षाकृत युवा उम्र, ~ P20-P40 के कृंतक से स्लाइस का उपयोग करके किया गया है, भले ही सिनैप्टिक और आंतरिक उत्तेजना तंत्र में एक लंबी विकासात्मक पूंछ होती है जो पिछले P60 तक पहुंचती है। युवा हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग करने की मुख्य अपील हाइपोक्सिक क्षति के लिए उच्च सहिष्णुता द्वारा सहायता प्राप्त न्यूरोनल स्वास्थ्य का संरक्षण है। हालांकि, विकास के अधिक परिपक्व चरणों में न्यूरोनल फ़ंक्शन को समझने की आवश्यकता है, न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के विभिन्न पशु मॉडलों के विकास से आगे बढ़ना है जिसके लिए एक उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क की तैयारी की आवश्यकता होती है। यहां हम एक तीव्र हिप्पोकैम्पल स्लाइस तैयारी में एक संशोधन का वर्णन करते हैं जो मज़बूती से वयस्क और उम्र बढ़ने वाले माउस हिप्पोकैम्पी से स्वस्थ स्लाइस बचाता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और बर्फ-ठंडे सोडियम-मुक्त एनएमडीजी-एएससीएफ के साथ काटने हैं । साथ में, ये कदम एटीपी में हाइपोक्सिया-प्रेरित ड्रॉप को डेपुटेशन पर क्षीण करते हैं, साथ ही निष्क्रिय सोडियम फ्लक्स के कारण साइटोटॉक्सिक एडेमा भी। हम एक कंपन माइक्रोटॉम का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस प्लस कॉर्टेक्स के ट्रांसवर्सल स्लाइस को कैसे काटते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं। इस तरह से प्राप्त तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस रिकॉर्डिंग के कई घंटों में मज़बूती से स्वस्थ हैं, और फ्लोरोसेंटली लेबल न्यूरॉन्स को लक्षित करने सहित क्षेत्र-रिकॉर्डिंग और लक्षित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उपयुक्त हैं।
स्तनधारी तीव्र मस्तिष्क के टुकड़े की तैयारी के आगमन ने सेलुलर और सिनैप्टिक स्तर पर प्रयोगों को सुगम बनाया जो पहले केवल एपलिसिया1जैसी अकशेरुकी तैयारी में ही संभव थे । तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का विकास विशेष महत्व का था, क्योंकि यह काम करने वाली स्मृति और संदर्भ गठन के लिए जिम्मेदार संरचना है, और इसमें एक विशेष त्रि-सिनैप्टिक सर्किटरी है जो आसान शारीरिक हेरफेर के लिए उत्तरदायी है। हालांकि, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का विशाल बहुमत अभी भी अपेक्षाकृत युवा चूहों और चूहों से तैयार किया जाता है, क्योंकि स्वस्थ न्यूरॉन्स और सर्किट को संरक्षित करना आसान होता,है, और स्लाइस2,3,,4के लंबे समय तक व्यवहार्य रहते हैं। यहां, हम मानक स्लाइसिंग प्रोटोकॉल में संशोधन पेश करते हैं जिसके परिणामस्वरूप वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस की व्यवहार्यता में वृद्धि होती है।
स्तनधारी मस्तिष्क परेन्चिमा के दीर्घकालिक पूर्व वीवो व्यवहार्यता के लिए प्रमुख बाधा प्रारंभिक हाइपोक्सिक क्षति है जो तेजी से होती है एक बार मस्तिष्क में रक्त प्रवाह डेपुटेशन के बाद बंद हो जाता है। ऑक्सीजन की हानि के परिणामस्वरूप मस्तिष्क में प्रमुख ऊर्जा संसाधनों की तेजी से मेटाबोलिक खपत होती है, जिसमें फॉस्फो-क्रिएटिन (पी-क्रिएटिन) का नुकसान सबसे तेजी से होता है, इसके बाद ग्लूकोज, एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), और ग्लाइकोजन4। मस्तिष्क स्लाइस के दीर्घकालिक स्वास्थ्य के लिए एटीपी का संरक्षण विशेष महत्व रखता है, क्योंकि ना-के एटीपी के माध्यम से झिल्ली की क्षमता को बनाए रखने के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है, और परिणामस्वरूप तंत्रिका गतिविधि5,,6। वयस्क कृंतक मस्तिष्क में एटीपी स्तर ~ 2.5 mM है, और यह लगभग 1 मिनट के बाद डेपुटेशन4,,7,8 पर बेसल स्थिर स्थिति (~ 0.5 m M) तक पहुंचने के लिए 20 एस डेपुटेशन के भीतर तेज़ी सेगिरताहै।, युवा जानवरों में, एटीपी (~ 2 मिनट) में एक ही बूंद का निरीक्षण करने में अधिक समय लगता है; फेनोबार्बिटल एनेस्थीसिया के साथ यह आगे 4 मिनट4को धीमा है . इन बातों से पता चलता है कि एटीपी और अन्य ऊर्जा संसाधनों के नुकसान को रोकने के लिए मस्तिष्क को हाइपोक्सिक क्षति को रोकने के लिए एक आवश्यक रणनीति है और बदले में समय की लंबी अवधि में मस्तिष्क स्लाइस के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, विशेष रूप से वयस्क जानवरों में ।
कम तापमान मेटाबॉलिज्म को धीमा कर देता है। नतीजतन, यह प्रदर्शित किया गया है कि मामूली हाइपोथर्मिया मस्तिष्क ऊर्जा भंडार की रक्षा करता है: युवा जानवरों में, शरीर के तापमान को छह डिग्री से कम करना, 37 डिग्री सेल्सियस से 31 डिग्री सेल्सियस तक, एटीपी स्तर को नियंत्रित हाइपोक्सिया 9 के 4 घंटे से अधिक सामान्य स्तर के लगभग 80% तक बरकराररखताहै। पी-क्रिएटिन का स्तर इसी तरह संरक्षित है, साथ ही समग्र फॉस्फोरिलेशन संभावित9। इससे पता चलता है कि डेपुटेशन से पहले शरीर के तापमान को कम करना न्यूरोप्रोटेक्टिव हो सकता है, क्योंकि एटीपी के लगभग सामान्य स्तर को स्लाइस कटिंग और स्लाइस रिकवरी पीरियड के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है।
इस डिग्री के लिए कि एटीपी ड्रॉप को पूरी तरह से डेपुटेशन पर रोका नहीं जा सकता है, ना-के ATPase के आंशिक रूप से बिगड़ा हुआ कार्य की उम्मीद है, जिसके बाद निष्क्रिय सोडियम प्रवाह के माध्यम से depolarization होता है। चूंकि निष्क्रिय सोडियम प्रवाह कोशिकाओं में पानी के प्रवेश के बाद होता है, यह साइटोटॉक्सिक एडेमा और अंततः पाइक्नोसिस का कारण बनता है। वयस्क चूहों में, स्लाइस-कटिंग समाधानों में सुक्रोज के साथ ना + आयनों की जगह साइटोटॉक्सिक एडेमा10, 11,11के बोझ को कम करने के लिए एक सफल रणनीति रही है। हाल ही में, सोडियम चैनल पारगम्यता12 को कम करने वाले मिथाइलेटेड कार्बनिक cations ने सुक्रोज की तुलना में अधिक प्रभावी सुरक्षा प्रदान करने के लिए दिखाया है, विशेष रूप से वयस्क चूहों से स्लाइस में, एन-मिथाइल-डी-ग्लूकामाइन (एनएमडीजी) के साथ विभिन्न उम्र और मस्तिष्क क्षेत्रों में सबसे व्यापक रूप से लागू किया जा रहा है13,,14,15,,16।,
कई मस्तिष्क-टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल में केवल स्लाइस-कटिंग चरण के दौरान ठंडे तापमान का उपयोग करना शामिल है, कभी-कभी ना+ आयन प्रतिस्थापन रणनीति16,,17के संयोजन में। युवा जानवरों में, ये प्रोटोकॉल पर्याप्त न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करते हैं क्योंकि दिमाग को डेपुटेशन के बाद जल्दी निकाला जा सकता है क्योंकि खोपड़ी अभी भी पतली है और3को हटाने में आसान है। हालांकि, यह रणनीति वयस्क जानवरों से स्वस्थ स्लाइस का उत्पादन नहीं करती है। समय के साथ, वयस्क कृंतक का अध्ययन करने वाली कई प्रयोगशालाओं ने जानवर के शरीर के तापमान को कम करने के लिए बर्फ-ठंडे समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन शुरू किया है, और इसलिए काटना से पहले मस्तिष्क को हाइपोक्सिक क्षति। इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक सेरिबेलर स्लाइस 18,, मिडब्रेन स्लाइस19, नियोकॉर्टिकल स्लाइस11, 20,पेरिहिनल कॉर्टेक्स21,रैटिकैंपस10,22,,2023,घ्राण बल्ब 24 , वेंट्रल स्ट्रीटम25, विज़ुअल कॉर्टेक्स26का उत्पादन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था ।2226
चूहों में चूहे और कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में चूहों से स्लाइस तैयार करने में ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और ना+ आयन प्रतिस्थापन द्वारा पेश किए गए फायदों के बावजूद, माउस हिप्पोकैम्पस हाइपोक्सिया13,,20से बचाने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण क्षेत्रों में से एक बना हुआ है। आज तक, उम्र बढ़ने वाले चूहों और न्यूरोडिजेनरेशन के माउस मॉडल से हिप्पोकैम्पस को टुकड़ा करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक अलग हिप्पोकैम्पी27का शास्त्रीय तेजी से टुकड़ा करना शामिल है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, हम वयस्क मस्तिष्क में हाइपोथर्मिया शुरू करके हाइपोथर्मिया के नुकसान को कम करते हैं, जो बर्फ-ठंडे ना+के साथ जानवर को पार करके- मुफ्त एनएमडीजी-आधारित कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (एनएमडीजी-एसीसीएफ) के साथ। स्लाइस तो बर्फ ठंड ना+मुक्त NMDG-aCSF में काट रहे हैं । इस उन्नत प्रोटोकॉल के साथ हम वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस प्राप्त करते हैं जो टुकड़ा करने के बाद 10 घंटे तक स्वस्थ होते हैं और दीर्घकालिक क्षेत्र-रिकॉर्डिंग और पैच-क्लैंप अध्ययनों के लिए उपयुक्त होते हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से प्राप्त हिप्पोकैम्पस स्लाइस काटने के बाद कई घंटों तक स्वस्थ और व्यवहार्य रह सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार स्लाइस पै?…
The authors have nothing to disclose.
मैं डॉ कार्ला जे Shatz सलाह और समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करता हूं, और डॉ बारबरा के Brott और मिशेल के Drews गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए । काम NIH EY02858 और मैथर्स चैरिटेबल फाउंडेशन सीजेएस को अनुदान द्वारा समर्थित है ।
“60 degree” tool | made in-house | ||
#10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
CCD camera | Olympus | XM10 | |
Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
Feather blades | Feather | FA-10 | |
Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HCl | Fisher | A144SI-212 | |
Ice buckets | |||
KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
Magnetic stirrers and stir bars | |||
Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
Needle 27G1/2 | |||
NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Paper tape | |||
Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
pH meter | |||
Recovery chamber | in-house made | ||
Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
Spatulas | |||
Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |