Этот протокол описывает канонический метод для понимания критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo. Этот метод использует трансгенную модель мыши и некоторые канонические методы для анализа скелетного фенотипа.
Трансгенные модели мыши являются мощными для понимания критических генов, контролирующих дифференциацию и активность остеокласта, а также для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения остеопороза. Катепсин K (Ctsk)-Cre мышей были широко использованы для функциональных исследований остеокластов. Препонент сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) актуален в гомеостазе костей, но его роль в остеокластах in vivo остается плохо определенной. Чтобы обеспечить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей, мы создали остеокласт конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) и проанализировал его скелетный фенотип. Микро-КТ сканирование и 3D реконструкция подразумевает увеличение костной массы у условного нокаут мышей. Для обнаружения метаболизма костей были выполнены окрашивание, кальциин и ализарин красного двойного окрашивания, а также тартратостойкий кислотный фосфатаза (TRAP). Короче говоря, этот протокол описывает некоторые канонические методы и методы для анализа скелетного фенотипа и изучения критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo.
Скелетная кость является основным несущим органом человеческого тела и находится под давлением как внутренней, так и внешней среды во время ходьбы и физическихупражнений 1. На протяжении всей своей жизни, кости постоянно проходят через самообувека, которая уравновешивается остеобластов и остеокластов. Процесс очистки остеокластов старых костей и остеобластов, образующих новую кость, поддерживает гомеостаз и механическую функцию скелетнойсистемы 2. Нарушение баланса может вызвать заболевания костного обмена веществ, такие как остеопороз. Остеопороз, вызванный избыточной остеокластической активностью, широко распространен во всем мире и наносит существенныеэкономические потери обществу 2,3,4. В соответствии с ограниченным числом препаратов, доступных для леченияостеопороза и их риск побочных эффектов 4, важно раскрыть детали формирования остеокласта и деятельности.
Остеокласты, полученные из моноцитов / макрофаг гематопоэтической линии имеют несколько ядер (может иметь от 2 до 50 ядер) и большие (обычно больше, чем 100 мкм в диаметре)2. Хотя изучение механизмов и скрининг препаратов на остеокластические расстройства были широко улучшены с помощью культуры остеокласта in vitro, сложные органические реакции делают in vivo необходимым доказательством для целенаправленной терапии. Из-за генетического и патофизиологического сходства между мышами и людьми, генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения заболеваний человека in vivo6. Система Cre-loxP является широко используемой технологией для редактирования генов мыши и позволила исследователям исследовать генные функции в тканевой/клеточной манере5. Катепсин K (CSTK) является протеазы цистеина выделяется остеокластов, которые могут ухудшить костного коллагена8. Хорошо известно, что CTSK избирательно выражается в зрелых остеокластов; таким образом, Ctsk-Cre мышей считаются полезным инструментом для функциональных исследований остеокластов и был использован6.
Сигнал превудактор и активатор транскрипции (STAT) семьи является классическим и весьма значительным в иммунитете и прогрессиирака и развития 7,8. Среди семи STATs, STAT3, как сообщается, наиболее актуальным для кости гомеостаза9,10. Несколько исследований in vivo сообщили, что специфическая инактивация STAT3 при остеобластах уменьшаетформирование костей 9,10. Тем не менее, веские данные об участии STAT3 в формировании остеокласта и метаболизме костей в виво по-прежнему ограничены. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с остеокластом конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, далее называется Stat3Ctsk), что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей11. В настоящем исследовании мы описываем методы и протоколы, которые мы использовали для анализа изменений в костной массе, костной гистоморфологии, костной анаболии и катаболизма мышей Stat3Ctsk для изучения влияния остеокласт-специфического удаления STAT3 на гомеостаз костей.
Генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизма и фармацевтического лечения болезни человека13. Мышей Ctsk-Cre широко используются для функциональных исследований остеокластов6. В настоящем исследовании описаны протоко…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Вайгуо Цзоу и С. Като за реагенты и мышей, а также сотрудников лаборатории Цзоу за полезные дискуссии. Мы также благодарим Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы за помощь. Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайская встреча на высшем уровне – Плато Дисциплины, ФОНД SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования команды высокого уровня инноваций для Школы медицины Шанхайского университета Цзяо Тонг , Междисциплинарный исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Шанхайская школа медицины университета ЦзяоТанг (JYJC201902). И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай “Восходящие звезды медицинского таланта” Программа развития молодежи и “Чэнь Син” проекта из Шанхайского университета Цзяотун.
4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
rotary microtome | Leica | RM2265 | |
Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |