Summary
이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.
Abstract
MicroRNAs(miRNAs)는 내인성 발현비의 클래스로, ~21nt 소형 RNA는 식물과 동물 모두에서 유전자 발현의 조절에 관여한다. 대부분의 miRNAs는 주요 유전자를 표적으로 하는 유전자 발현의 음성 스위치로 작동합니다. 식물에서, 1 차 miRNAs (pri-miRNAs) 전사체는 RNA 폴리머라제 II에 의해 생성되고, 그(것)들은 pre miRNAs에게 불린 안정한 줄기 루프 구조물의 다양한 길이를 형성합니다. 엔도누클레스, 디커 와 같은1, miRNA-miRNA * 이중으로 사전 miRNA를 처리합니다. miRNA-miRNA* 듀플렉스에서 가닥 중 하나가 선택되고 Argonaute 1 단백질 또는 그 동형로그에 적재되어 표적 mRNA의 분열을 중재합니다. miRNAs는 주요 신호 분자이지만, 그들의 검출은 수시로 민감한 북부 얼룩 분석 대신 최적 PCR 기지를 둔 방법에 의해 실행됩니다. 우리는 모든 식물 조직에서 매우 높은 감도로 miRNA 수준의 정량화에 이상적인 간단하고 신뢰할 수 있으며 매우 민감한 북부 방법을 설명합니다. 또한 이 방법을 사용하여 miRNAs 및 전구체의 크기, 안정성 및 풍부를 확인할 수 있습니다.
Introduction
작은 규제 RNA의 최근 발견, microRNA, 그(것)들을 이해하는 연구 및 식물과 동물에 있는 그들의 역할1을지도했습니다. miRNAs의 긴 전구체는 HYL1 및 특정 dicer 같이 단백질2,,3에의해 21 에서 24 nt 성숙한 miRNAs로 가공됩니다. 22 nt miRNA는 이차 siRNAs4를생성하여 캐스케이드 침묵을 시작할 수 있습니다. 연구 결과는 발달, 세포 운명 및 응력반응에서miRNAs 및 이차 siRNAs의 역할을 보여주었습니다5,6.
북부 혼성화는 특정 RNA 분자를 검출하기 위해 일상적으로 사용되는 실험 방법입니다. 이 방법은 총 RNA 7의 풀에서 약 19-24 nt 긴 작은 RNA의 검출에 그것의 사용을 사용자 정의한다. 이 데모에서는 miRNA의 검출 및 정량화를 위해 이 기술의 사용을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소를 사용하여 프로브의 라벨링을 사용합니다. 따라서, 샘플내의 miRNA 수준은 감도증가로 검출될 수 있다. PCR 기반 방법과 달리 이 메서드는 miRNAs의 크기 결정뿐만 아니라 식의 정량화를 보장합니다. 이 프로토콜에서는 miRNA 탐지를 개선하는 중요한 단계를 보여줍니다. 우리는 miRNA의 고해상도 신호 검출을 얻기 위한 블로팅 및 혼성화단계를 수정했습니다. 이 기술은 또한 siRNAs, 타시 보조 RNA 및 snoRNAs와 같은 그밖 내인성 작은 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있습니다.
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Protocol
1. 15% 데니링 폴리아크라이알라미드 젤 준비
- 무게와 우레아 4.8 g을 추가, 40 % 아크릴아미드의 3.75 mL을 추가 : 비사 크라이 라미드 (19:1) 용액과 멸균 50 mL 튜브에 10x TBE pH 8.2의 1 mL을 추가합니다.
- 60°C에서 설정된 수조를 사용하여 우레아를 맑은 용액으로 녹입니다.
- 신선 자동 살균수를 사용하여 10mL로 볼륨을 구성하고 젤 믹스를 실온으로 냉각시하십시오.
- 신선한 10 % (w / v) 아황 산액을 준비하십시오.
2. 유리 판 및 전기 전구 장치의 조립
- 젤 전기 포하 및 전기 블로팅에 필요한 모든 장치를 세제로 세척하십시오. 부드러운 스폰지를 사용하여 부드럽게 스크러빙하여 잔류 버퍼와 아크릴아미드를 제거하고 물로 헹구고 건조시키십시오.
- 유리 판을 함께 조립하고 스폰지에 단단히 놓습니다. 이 설정에 1mm 두께의 플레이트를 사용합니다. 플레이트가 누출을 방지하기 위해 동일한 수준에 있는지 확인합니다.
- 10mL 젤 믹스에 8 μL의 TEMED와 80 μL을 새로 준비한 10% (w/v) 아황 아황염 용액을 추가합니다.
- 지체 없이 부드럽게 섞어서 조립된 유리 접시 사이에 붓습니다. 빗을 조심스럽게 놓습니다. 이 단계에서기포를 생성하지 마십시오.
- 젤이 약 45분 동안 중합되도록 허용합니다.
- 젤 러닝 셋업 내부에 넣기 전에 폴리머로 화된 젤을 멸균물로 씻으세요.
- 러닝 카세트 안에 접시를 조립하고 빗을 부드럽게 제거합니다.
- 갓 준비된 멸균 1x TBE, pH 8.2를 탱크에 붓습니다.
- 버퍼를 파이프로 사용하여 우물을 조심스럽게 씻어 소금 결정을 제거합니다. 이 단계는 RNA 견본이 젤을 가로질러 균일하게 달리는 것을 돕습니다.
- 30분 동안 80V에서 사전 실행을 수행합니다.
3. 염색및 시료 적재 준비
- 젤 로딩 염료 10mL의 경우, 브로모페놀 블루 5 mg, 자일렌 시아놀 5 mg의 무게를 달고, 10mL의 탈이온화된 포름아미드를 조심스럽게 넣고 잘 섞는다.
- Aliquot 10 μg의 총 RNA를 멸균 1.5 mL 튜브로 넣고 스피드박을 사용하여 시료를 건조시킵니다. 샘플을 과도하게 건조시키지 마십시오.
- 8 μL의 적재에서 RNA 샘플을 다시 중단합니다.
- 샘플을 98°C에서 2분간 가열하고 RT, 소용돌이에서 1분 동안 식히고 샘플을 3회 회전시합니다. 이 단계는 적절한 재서스펜션에 필수적이며, 이는 시료를 동등한 로딩하는 데 도움이 됩니다.
4. 겔 전기 전광
- 미리 실행을 중지하고 샘플 로딩하기 전에 우물을 세척합니다.
- 샘플을 98°C에서 1분 동안 가열하고 모세관 팁을 사용하여 샘플을 우물에 뜨겁게 적재합니다. 팁이 우물 의 바닥에 삽입하여 샘플이 우물에서 하나의 얇은 층을 차지하도록 합니다.
- 모든 샘플의 완전한 로딩. RNA 10년 마커를 로드하는 것을 포함한다.
- 브로모페놀 블루 염료가 거의 완전히 실행될 때까지 80 V에서 젤을 실행합니다. 브로모페놀 블루는 아크릴아미드 젤을 15% 데니링하여 10bp로 주행합니다.
5. 전기 블로팅 준비
- N+나일론 멤브레인을 유리 판의 치수로 자르고 오른쪽 상단 모서리에 있는 멤브레인에 HB 연필로 라벨을 붙입니다.
- 살균 수의 표면에 멤브레인을 부드럽게 놓고 라벨이 부착된 면을 수면쪽으로 향하게 합니다. 15 분 동안 멤브레인을 미리 흡수하십시오.
- 섬유 패드의 치수에 나는 블로팅 종이 4 조각을 잘라.
- 젤 샌드위치를 준비하여 카세트의 회색 면을 깨끗한 트레이에 놓습니다.
- 섬유 패드를 미리 적시고 카세트 위에 놓습니다. 기포를 제거합니다.
- 1x TBE에 1장의 블로팅 페이퍼를 미리 적시고 섬유 패드 위에 놓습니다. 플라스틱 파이펫을 종이 위에 굴려 기포를 제거합니다. 젖은 미리 젖은 얼룩지의 또 다른 조각을 놓고 기포를 제거합니다.
- 조심스럽게 실행 카세트에서 젤을 제거하고 샌드위치 설정 위에 배치, 첫 번째로드 RNA 샘플이 오른쪽을 향해 있도록.
- 미리 담근 멤브레인을 1x TBE에 부드럽게 담그고 젤 위에 놓고 라벨이 부착된 면을 아래로 향합니다. 기포를 제거하기 위해 밖으로 굴립니다.
- 얼룩지는 종이 한 조각을 찍어 멤브레인 위에 놓고 기포를 제거합니다. 또 다른 블롯 페이퍼를 찍어 샌드위치 셋업 위에 놓고 기포를 제거합니다.
- 미리 젖은 섬유 패드를 셋업 위에 놓고 카세트를 단단히 닫습니다.
- 트랜스블롯 카세트를 모듈에 놓고 1배 TBE, pH 8.2를 블로팅 마크까지 채웁니다.
- 10V에서 전송, 4 °C에서 하룻밤.
- 전이 후, 젖은 멤브레인을 종이 시트에 놓고 254-nm UV 광 (120,000 μjoles/cm²)으로 조사하여 RNA를 멤브레인에 즉시 연결합니다. 교차 연결된 블롯은 추가 혼성화를 위해 4°C에 저장될 수 있습니다.
6. 방사성 라벨 프로브 준비
- 검출될 작은 RNA에 완전히 보완되는 프로브를 설계한다.
- 최종 레이블은 표 1에제공된 레시피에 따라 구성 요소를 결합하여 5'엔드에서 ƳP32ATP(BRIT에서 얻은)를 사용하여 프로브에 라벨을 부착합니다.
- 위의 반응 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 Sephadex G-25 열을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 ƳP32ATP를 프로브에서 분리합니다.
7. 블롯의 혼성화
- 교차 연결된 블롯을 배치, 하이브리드화 병 안에 상단을 향한 RNA 측.
- 매우 민감한 혼성화 버퍼를 적극적으로 혼합하고, 10mL를 추가하고, 35°C에서 유지된 혼성화 오븐 내부에 블롯을 회전과 함께 배양한다.
- 20분 동안 사전 혼성화를 수행합니다.
- 오븐에서 병을 제거하고 레이블이 지정된 프로브를 하이브리드화 버퍼에 부드럽게 넣습니다.
- 12시간 동안 회전하여 35°C에서 블롯을 혼성화합니다.
- 혼성화 후 하이브리드화 용액을 15mL 튜브로 조심스럽게 이송한다. 이 용액은 재사용전까지 4°C로 저장할 수 있다.
- 2x SSC 버퍼와 0.5% SDS를 추가하여 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 2분 동안 블롯을 빠르게 세척합니다. 솔루션을 폐기합니다.
- 2배 SSC 버퍼와 35°C의 0.5% SDS로 블롯을 배양하고 30분 동안 회전합니다.
- 0.5배 SSC 버퍼와 0.5% SDS로 35°C의 회전을 30분 동안 세척합니다.
- 블롯을 혼성화 커버 안에 놓고 여분의 버퍼를 제거하고 밀봉합니다.
- 카세트 내부에 하룻밤 동안 방사선 프리 인광기 이미저 화면에 노출.
- 생체 분자 이미저를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.
- 0.5 X SSC 버퍼 플러스 0.1% SDS 및 0.1 X SSC 버퍼 플러스 0.1% SDS 플러스 0.1% SDS 30 분 과 함께 30 분 동안 회전과 함께 80 °C에서 배양하여 얼룩을 제거합니다.
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Representative Results
본 시연에서는, 인디카 라이스 바 화이트폰니(그림1)의다양한 조직에서 miR397의 표현을 검출하고 정량화하였다. miR397은 22 nt miRNA및 보존 된 miRNA입니다. miR397의 발현은 모든 테스트된 샘플에서 검출될 수 있다. 차세대 시퀀싱 데이터에 따라 샘플 1(모종 조직)은 miR397에서 백만(rpm)당 5개의 판독을 합니다. 우리는 그 신호를 편안하게 감지하여 방법이 매우 민감하고 매우 낮은 풍부한 miRNAs를 감지하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다. 이 실험에서는 miR168 및 U6을 로딩 컨트롤로 사용했습니다.
이 블롯(도1)에서는ImageJ를 사용하여 신호강도를 정량화시켰다. miR397의 발현은 식물성 잎 칼집에서 가장 높습니다.
그림 1: 쌀 샘플의 다른 조직에서 miR397의 발현의 검출 및 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 및 솔루션 | 제조 법 | 코멘트 |
| 10 X TBE | 0.89M 트라이 버퍼 | pH는 아세트산을 사용하여 8.2로 설정해야 합니다. |
| 0.89M 보릭산 | ||
| 30mM EDTA | ||
| 젤 믹스 | 아크릴아미드-비사크라이미드 솔, 19:1 | 젤 믹스는 우레아 크리스탈을 포함해서는 안됩니다. |
| 8M 우레아 | ||
| 1X TBE | ||
| 젤 로딩 염료 | 0.05 %(w /v) 브로모페놀 블루 | 탈이온화된 포름아미드를 취급하는 동안주의해야 합니다. |
| 0.05 %(w /v) 자일렌 자얀올 | ||
| 100 % deionized- 폼 아미드 | ||
| 프로브 라벨링 | PNK 버퍼 (10X, 2 μL) | 이 혼합물은 방사성 분자를 포함, 이 단계는 방사성 실험실 내부의 숙련 된 페르소넬에 의해 수행되어야 |
| PNK 효소 (1 μL) | ||
| 올리고 (100 μM, 0.1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| 워시 버퍼 - I | 2X SSC | |
| SDS 0.5% (w/v) | ||
| 워시 버퍼 - II | 0.5X SSC | |
| SDS 0.5% (w/v) | ||
| 제거 버퍼 - I | 0.5X SSC | |
| SDS 0.1% (w/v) | ||
| 제거 버퍼 - II | 0.1X SSC | |
| SDS 0.1% (w/v) |
표 1: 레시피 테이블.
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Discussion
이 방법은 덜 풍부한 miRNA를 포함하여 작은 RNA의 검출 및 정량화에 광범위하게 사용될 수 있습니다. 프로토콜은 주로 로딩 버퍼에서 총 RNA를 분해하는 단계를 설명하고, 겔 전기포에 의한 크기 분리, 멤브레인으로 RNA의 전달, RNA를 멤브레인에 교차 연결하고 원하는 방사성 표지된 올리고 프로브를 사용하여 혼성화한다.
모든 블로팅 실험에 대한 중요한 단계는 샘플 준비를위한 양질의 RNA를 사용하는 것입니다. 젤을 로드하기 전에 샘플이 자유롭게 흐르고 로딩 팁을 고수하지 않아야 합니다. 샘플을 로드하는 동안주의를 기울여야하며, 샘플이 우물에서 하나의 얇은 층을 차지되도록 팁은 우물 의 바닥 바로 위에 삽입해야합니다. 혼성화 오븐의 온도는 매우 덜 풍부한 miRNA의 검출을 위해 35 °C에서 유지되어야합니다. 블롯의 반복혼성화를 위해, 2배 SSC에서 축축함을 유지하여 멤브레인을 4°C로 저장하십시오.
이 방법은 다당류와 폴리페놀8이풍부한 조직에서 작은 RNA를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, RNA 샘플을 집중하기 위한 진공 건조의 사용은 다른 오래된 방법에 비해 더 나은 안정성과 적은 시료 손실을 제공합니다9. 이 방법의 다른 변형은 전기 전달 중에 1x TBE에 담그기 전에 물에서 멤브레인의 확산을 포함한다. 이것은 BLOT의 더 나은 해결책을 제공하는 RNA 전송의 효율성을 향상시킵니다.
이 방법의 주요 한계는 양성화 실험을 수행하기 위해 훈련된 인력과 방사성 동위 원소 실험실이 필요한 방사성 동위원소의 사용입니다. 이 방법은 여기서 miRNAs의 검출을 위한 RNA 블롯 분석에 관여하는 모든 단계에 관하여 상세한 정보를 제공한다. 이 프로토콜은 또한 신호감지(10)를제외한 작은 RNA의 크기를 보장한다. 이 기술은 분자 생물학자가 miRNAs, 이차 siRNAs 및 snoRNAs와 같은 다양한 작은 RNA의 풍부를 추정하는 강력한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
저자는 방사선 동위 원소를 위한 호스트 연구소 및 BRIT에 의해 제공된 방사선 실험실에 접근을 인정합니다. PVS 실험실은 국립 생물 과학 센터, 기본 연구 및 보조금타타 연구소 (BT / PR12394 / AGIII / 103/891/2014; BT/IN/스위스/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) 인도 정부 생명공학부. MP는 DBT 연구 준회원, DBT, 인도 정부를 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
