Summary
يوضح هذا الأسلوب استخدام تقنية التهجين الشمالي للكشف عن الميرناس من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من غير ترميز أعرب عن الذات، ~ 21 NT RNAs صغيرة تشارك في تنظيم التعبير الجيني في كل من النباتات والحيوانات. معظم miRNAs بمثابة مفاتيح سلبية للتعبير الجيني التي تستهدف الجينات الرئيسية. في النباتات، يتم إنشاء النصوص miRNAs الأولية (pri-miRNAs) بواسطة بوليميراز RNA الثاني، وأنها تشكل أطوال متفاوتة من هياكل حلقة الجذعية مستقرة تسمى ما قبل ميرناس. و endonuclease، Dicer-مثل1، يعالج ما قبل ميرناس في ميرنا ميرنا * دوبليكس. يتم اختيار أحد الخيوط من ميرنا ميرنا * دوبليكس وتحميلها على بروتين Argonaute 1 أو homologs للتوسط في شق mRNAs الهدف. على الرغم من أن الجزيئات الرئيسية التي تشير إلى الإشارات miRNAs، غالبا ما يتم الكشف عنها من قبل أقل من الطرق المثلى القائمة PCR بدلا من تحليل البقعة الشمالية الحساسة. نحن وصف طريقة بسيطة وموثوقة، وحساسة للغاية الشمالية التي هي مثالية للكمية من مستويات ميرنا مع حساسية عالية جدا، حرفيا من أي نسيج نباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد حجم واستقرار ووفرة الـ miRNAs وسلائفها.
Introduction
الاكتشاف الأخير للرنا RNAs التنظيمية الصغيرة، microRNAs، قاد البحوث في فهمها ودورها في النباتات والحيوانات1. تتم معالجة السلائف الطويلة من miRNAs إلى 21 إلى 24 nt ناضجة miRNAs بواسطة HYL1 والبروتينات المحددة مثل dicer2,3. A 22 NT ميرنا يمكن أن تبدأ تتالي إسكات عن طريق توليد siRNAs الثانوية4. وقد أظهرت الدراسات دور ميرناس و siRNAs الثانوية في التنمية, الخلية مصير واستجابات الإجهاد5,6.
التهجين الشمالي هو طريقة تجريبية تستخدم بشكل روتيني للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي محددة. هذا الأسلوب يخصص استخدامه في الكشف عن حوالي 19 -24 NT RNAs صغيرة طويلة من مجموعة من مجموع RNAs7. في هذه التظاهرة، ونحن توضيح استخدام هذه التقنية للكشف عن وكمية من miRNAs. وتستخدم هذه الطريقة وسم المجس باستخدام النظائر المشعة؛ وبالتالي، يمكن الكشف عن مستويات ميرنا في العينة مع زيادة الحساسية. على عكس الطرق القائمة على PCR، يضمن هذا الأسلوب تحديد كم التعبير وكذلك تحديد حجم miRNAs. في هذا البروتوكول، نعرض خطوات حاسمة لتحسين الكشف عن ميرنا. لقد قمنا بتعديل الخطوات في النشاف والتهجين للحصول على الكشف إشارة عالية الدقة من miRNAs. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للكشف عن RNAs صغيرة أخرى الذاتية مثل RNAs، رنا فاسي الثانوية وsnoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد 15٪ denaturing هلام بوليكريلاميد
- وزن وإضافة 4.8 غرام من اليوريا، إضافة 3.75 مل من 40٪ أكريلاميد: البيسكريلاميد (19:1) حل و 1 مل من 10x TBE pH 8.2 في أنبوب 50 مل عقيمة.
- حل اليوريا باستخدام حمام مائي تعيين في 60 درجة مئوية في حل واضح.
- المكياج وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام المياه المعقمة الطازجة autoclaved وتبريد مزيج هلام إلى درجة حرارة الغرفة.
- تحضير 10٪ جديدة (ث / الخامس) حل persulfate الأمونيوم.
2. تجميع لوحات الزجاج ووحدة الكهرباء
- غسل كل الأجهزة اللازمة للكهربية هلام والكهرباء النشاف مع المنظفات. فرك بلطف لهم باستخدام اسفنجة ناعمة لإزالة العازلة المتبقية والاكريلاميد، شطف بالماء والسماح لهم لتجف.
- تجميع كل من لوحات الزجاج معا ووضعها بحزم على الاسفنج. استخدم لوحة سمكها 1 مم لهذا الإعداد. تأكد من أن لوحات هي في نفس المستوى لتجنب التسرب.
- إلى مزيج هلام 10 مل، إضافة 8 ميكرولتر من TEMED و 80 ميكرولتر من الطازجة 10% أعد (ث / الخامس) محلول persulfate الأمونيوم.
- دون تأخير، مزيج بلطف وتصب هذا في بين لوحات الزجاج المجمعة. ضع المشط بعناية. تجنب توليد فقاعات الهواء في هذه الخطوة.
- السماح للجل البلمرة لمدة 45 دقيقة تقريبا.
- اغسل الجل البلمر بالماء المعقم قبل وضعه داخل الإعداد الذي يعمل بالهلام.
- تجميع لوحات داخل كاسيت تشغيل وإزالة المشط بلطف.
- صب الطازجة المعدة العقيمة 1x TBE، pH 8.2 في الخزان.
- غسل الآبار بعناية عن طريق الأنابيب العازلة لإزالة بلورات الملح. تساعد هذه الخطوة عينة RNA على تشغيل بشكل موحد عبر هلام.
- تنفيذ ما قبل تشغيل في 80 V لمدة 30 دقيقة.
3. إعداد صبغة التحميل والعينات
- ل 10 مل من هلام تحميل صبغة، تزن 5 ملغ من بروموفينول الأزرق، 5 ملغ من السيلين سيانول، إضافة 10 مل من الفورماميد deionized بعناية وخلطها جيدا.
- Aliquot 10 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي في أنبوب معقم 1.5 مل وتجفيف العينات باستخدام سرعة. لا الإفراط في تجفيف العينات.
- resuspend عينات RNA في 8 ميكرولتر من التحميل.
- سخني العينات على درجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وتبرد لمدة دقيقة في RT، ودوامة وتدور العينات، لمدة 3 مرات. هذه الخطوة ضرورية لإعادة التحمّل المناسبة، وهذا بدوره يساعد في تحميل العينات على قدم المساواة.
4. جل الكهرباء
- وقف تشغيل ما قبل وغسل الآبار قبل تحميل العينة.
- سخني العينات على درجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة دقيقة ثم قم بتحميل العينات الساخنة في البئر باستخدام نصائح شعرية. أدخل الطرف إلى أسفل البئر، بحيث تحتل العينة طبقة رقيقة واحدة في البئر.
- تحميل كامل لجميع العينات. وتشمل لتحميل علامة العقد RNA.
- تشغيل هلام في 80 الخامس حتى الصبغة الزرقاء bromophenol يعمل تماما تقريبا. بروموفينول الأزرق يعمل في 10 BP في هلام الاكريلاميد 15٪ denaturing.
5- التحضير للنقّل الكهربائي
- قطع غشاء ن + نايلون لأبعاد لوحة زجاجية وتسمية الغشاء في الزاوية اليمنى العليا مع قلم رصاص HB.
- ضع الغشاء بلطف على سطح الماء المعقم ، مواجهًا الجانب المسمى نحو سطح الماء. قبل نقع الغشاء لمدة 15 دقيقة.
- قطع 4 قطع من الورق النشاف الأول لأبعاد الألياف وسادة.
- إعداد ساندويتش هلام لوضع الجانب الرمادي من الكاسيت أسفل في علبة نظيفة.
- قبل الرطب لوحة الألياف ووضعها على الكاسيت. إزالة فقاعات الهواء.
- قبل الرطب قطعة واحدة من الورق النشاف في 1x TBE ومكان على لوحة الألياف. إزالة فقاعات الهواء عن طريق المتداول ماصة بلاستيكية على الورق. وضع قطعة أخرى من الورق قبل الرطب النشاف وإزالة فقاعات الهواء.
- إزالة بعناية هلام من الكاسيت قيد التشغيل ووضعها على إعداد شطيرة، بحيث أول عينة الحمض النووي الريبي تحميلها نحو اليمين.
- تراجع بلطف الغشاء قبل نقع في 1x TBE ووضعها على هلام، التي تواجه الجانب المسمى أسفل. طرح لإزالة فقاعات الهواء.
- تراجع قطعة من الورق النشاف، ووضعها على الغشاء، وإزالة فقاعات الهواء. تراجع قطعة أخرى من الورق النشاف، ووضعها على إعداد شطيرة وإزالة فقاعات الهواء.
- إكمال شطيرة عن طريق وضع قبل الرطب وسادة الألياف على الإعداد وإغلاق بحزم كاسيت.
- ضع الكاسيت المتحول في الوحدة النمطية وملأ 1x TBE، 8.2 pH حتى علامة النشاف.
- نقل في 10 V، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- بعد النقل، ضع الغشاء الرطب على ورقة ورقية، وعلى الفور عبر ربط الحمض النووي الريبي إلى الغشاء عن طريق التشعيع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر (120،000 ميكروجول/سم²). ربما تم تخزين البقعة المتقاطعة في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمزيد من التهجين.
6- إعداد مسبار مسمّى بشعاعي
- تصميم مسبار مكمل تماما لرنا الصغيرة التي سيتم الكشف عنها.
- نهاية التسمية المسبار باستخدام ƳP32ATP (التي تم الحصول عليها من بريت) في نهايتها 5 'عن طريق الجمع بين مكونات وصفة لكل المنصوص عليها في الجدول 1.
- احتضان خليط التفاعل أعلاه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- فصل غير موسومة ƳP32ATP من التحقيق باستخدام عمود سيخاديكس G-25 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
7. تهجين من وصمة عار
- ضع البقعة المتقاطعة ، جانب الحمض النووي الريبي التي تواجه الجزء العلوي داخل زجاجة التهجين.
- امزج بقوة مع العازلة التهجين الحساسة للغاية، إضافة 10 مل منه واحتضان البقعة داخل فرن التهجين التي حافظت على 35 درجة مئوية، مع دوران.
- تنفيذ ما قبل التهجين لمدة 20 دقيقة.
- إزالة الزجاجة من الفرن وإضافة المسبار المسمى في المخزن المؤقت التهجين بلطف.
- تهجين لطخة في 35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 12 ساعة.
- بعد التهجين نقل بعناية حل التهجين إلى أنبوب 15 مل. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية حتى إعادة استخدامه.
- قم بإجراء غسل سريع لللطخة لمدة 2 دقيقة لإزالة محلول التهجين الزائد عن طريق إضافة مخزن SSC 2x بالإضافة إلى 0.5٪ من الذاكرة SDS. تجاهل الحل.
- احتضان البقعة مع 2x SSC العازلة بالإضافة إلى 0.5٪ SDS ل35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة.
- اغسل البقعة مرة أخرى مع 0.5x SSC العازلة بالإضافة إلى 0.5٪ SDS ل35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة.
- ضع البقعة داخل غطاء التهجين، وأزل العازلة الزائدة وختمها.
- عرضها على شاشة تصوير خالية من الفوسفور للإشعاع بين عشية وضحاها داخل كاسيت.
- الكشف عن إشارة التهجين باستخدام التصوير الجزيئي الحيوي وتحليل النتائج باستخدام برامج مناسبة.
- تعري البقعة عن طريق احتضانها عند 80 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة مع 0.5 × SSC بالإضافة إلى 0.1٪ SDS و 0.1 X SSC العازلة بالإضافة إلى 0.1٪ SDS لمدة 30 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التظاهرة، لقد كشفنا وكميا التعبير عن miR397 في أنسجة مختلفة من رايس انديكا فار whiteponni (الشكل 1). miR397 هو 22 NT ميرنا والحفاظ عليها ميرنا. ويمكن الكشف عن التعبير عن miR397 في جميع العينات التي تم اختبارها. وفقا لبيانات تسلسل الجيل التالي، العينة 1 (أنسجة الشتلات) لديها miR397 في 5 قراءات لكل مليون (دورة في الدقيقة). اكتشفنا إشارتها بشكل مريح ، مما يشير إلى أن الطريقة حساسة للغاية ويمكن استخدامها للكشف عن الـ miRNAs المنخفضة جدًا. في هذه التجربة، استخدمنا miR168 و U6 كضوابط التحميل.
في هذه البقعة (الشكل 1) ، تم قياس قوة الإشارات كميا باستخدام ImageJ. التعبير عن miR397 هو أعلى في مُلَدَم نبات الخضري.
الشكل 1: الكشف عن التعبير عن miR397 وتحديده كمّاً في الأنسجة المختلفة لعينات الأرز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العازلة والحل | وصفه | تعليقات |
| 10 X TBE | 0.89M تريس العازلة | ينبغي تعيين الأسي إلى 8.2 باستخدام حمض الخليك |
| 0.89M حمض البوريك | ||
| 30m EDTA | ||
| هلام مزيج | 15% أكريلاميد-بياكريلاميد سول، 19:1 | هلام مزيج لا ينبغي أن تحتوي على بلورات اليوريا |
| 8M اليوريا | ||
| 1X TBE | ||
| هلام تحميل صبغة | 0.05٪(ث / الخامس) بروموفينول الأزرق | وينبغي توخي الحذر أثناء التعامل مع الفورماميد المديون |
| 0.05 ٪(ث / الخامس) Xylene xyanol | ||
| 100% من الـ 100 مُعَدّد- فورماميد | ||
| وضع العلامات على المسبار | PNK العازلة (10X، 2 ميكرولتر) | هذا الخليط يحتوي على جزيئات مشعة، يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بواسطة شخص مدرب داخل مختبر مشع |
| إنزيم PNK (1 ميكرولتر) | ||
| أوليغو (100 ميكرومتر، 0.1 ميكرولتر) | ||
| ƳP32 ATP (4 ميكرولتر) | ||
| غسل العازلة - أنا | 2X SSC | |
| 0.5% (ث/الخامس) SDS | ||
| غسل العازلة - II | 0.5X SSC | |
| 0.5% (ث/الخامس) SDS | ||
| تجريد المخزن المؤقت - I | 0.5X SSC | |
| 0.1 في المائة (ث/الخامس) SDS | ||
| تجريد المخزن المؤقت - II | 0.1X SSC | |
| 0.1 في المائة (ث/الخامس) SDS |
الجدول 1: جدول وصفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الرنا الصغير وتحديد كمهاته بما في ذلك الرنا الرنا الأقل وفرة. البروتوكول يصف أساسا الخطوات ل denaturing مجموع الجيش الملكي النيبالي في مخزن التحميل العازلة ، وحجم الفصل بواسطة جل electrophoresis ، ونقل الجيش الملكي النيبالي إلى غشاء ، عبر ربط الجيش الملكي النيبالي على الغشاء والتهجين باستخدام مسابير القلة المشعة المطلوبة.
الخطوة الحاسمة لأية تجربة النشاف هو استخدام الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة لإعداد العينة. قبل تحميل المواد الهلامية، يجب على المرء التأكد من أن العينات هي التدفق الحر وعدم التمسك نصائح التحميل. يجب توخي الحذر أثناء تحميل العينة ، يجب إدراج طرف فوق الجزء السفلي من البئر بحيث تحتل العينة طبقة رقيقة واحدة في البئر. يجب الحفاظ على درجة حرارة الفرن التهجين في 35 درجة مئوية للكشف عن miRNAs التي هي أقل وفرة للغاية. من أجل التهجين المتكرر لللطخة، قم بتخزين الغشاء عند 4 درجات مئوية عن طريق إبقائه رطبًا في 2x SSC.
يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن RNAs الصغيرة من الأنسجة الغنية في السكريات والبوليفينول8. في هذا البروتوكول، واستخدام فراغ التجفيف لتركيز عينات RNA يوفر أفضل الاستقرار وأقل فقدان العينة مقارنة مع الأساليب القديمة الأخرى9. وتشمل تعديلات أخرى في الطريقة، انتشار الغشاء في الماء قبل غمس في 1x TBE أثناء النقل الكهربائي. هذا يحسن كفاءة نقل RNA ، وتوفير أفضل قرار من لطخة.
ومن القيود الرئيسية التي تحد من هذه الطريقة استخدام النظائر المشعة، التي تحتاج إلى موظفين مدربين ومختبر للنظائر المشعة لإجراء تجارب التهجين. هذه الطريقة هنا يوفر معلومات مفصلة عن جميع الخطوات التي ينطوي عليها تحليل لطخة RNA للكشف عن miRNAs. هذا البروتوكول يضمن أيضا حجم RNA الصغيرة بصرف النظر عن الكشف عن الإشارة10. توفر هذه التقنية أداة قوية لعلماء الأحياء الجزيئية لتقدير وفرة مختلف الرنا الصغيرة مثل الرنا والسيليناس الثانوية وsnoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يعلن عن تضارب المصالح.
Acknowledgments
ويعترف المؤلفون بإمكانية الوصول إلى مختبر الإشعاع الذي يوفره المعهد المضيف والمعهد البريطاني للنظائر المشعة. ويدعم مختبر PVS المركز الوطني للعلوم البيولوجية، معهد تاتا للبحوث الأساسية والمنح (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014؛ BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19؛ BT/PR25767/GET/119/151/2017) من وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند. النائب يعترف DBT البحوث المنتسبين، DBT، حكومة الهند.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
