Summary
Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono una classe di RNA non codificanti endogenamente espressi, da 21 nt piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell'espressione genica sia nelle piante che negli animali. La maggior parte dei miRNA agisce come interruttori negativi dell'espressione genica mirata ai geni chiave. Nelle piante, le trascrizioni primarie di miRNA (pri-miRNA) sono generate dalla polimerasi RNA II e formano lunghezze variabili di strutture stabili ciclo-stelo chiamate pre-miRNA. Un endonuclease, simile a Dicer1, elabora i pre-miRNA in duplex miRNA-miRNA. Uno dei filamenti del duplex miRNA-miRNA è selezionato e caricato sulla proteina Argonaute 1 o sui suoi omologhi per mediare la scissione degli mRNA bersaglio. Sebbene i miRNA siano molecole chiave di segnalazione, il loro rilevamento viene spesso effettuato con metodi non ottimali basati sulla PCR anziché con un'analisi sensibile delle macchie settentrionali. Descriviamo un metodo settentrionale semplice, affidabile ed estremamente sensibile che è ideale per la quantificazione dei livelli di miRNA con una sensibilità molto elevata, letteralmente da qualsiasi tessuto vegetale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per confermare la dimensione, la stabilità e l'abbondanza di miRNA e dei loro precursori.
Introduction
La recente scoperta di piccoli RNA regolatori, i microRNA, ha guidato la ricerca nella loro comprensione e del loro ruolo nelle piante e negli animali1. I precursori lunghi dei miRNA vengono elaborati in miRNA maturi da 21 a 24 nt da HYL1 e specifiche proteine simili adicer2,,3. Un miRNA da 22 nt può avviare il silenziamento a cascata generando siRNA secondari4. Gli studi hanno dimostrato il ruolo dei miRNA e dei siRNA secondari nello sviluppo, nel destino cellulare e nelle risposte allo stress5,6.
L'ibridazione settentrionale è un metodo sperimentale regolarmente impiegato per rilevare specifiche molecole di RNA. Questo metodo personalizza il suo utilizzo nel rilevamento di circa 19 -24 nt lunghi piccoli RNA da un pool di RNA totali7. In questa dimostrazione viene illustrato l'utilizzo di questa tecnica per il rilevamento e la quantificazione dei miRNA. Questo metodo utilizza l'etichettatura delle sonde utilizzando i radioisotopi; pertanto, i livelli di miRNA nel campione possono essere rilevati con una maggiore sensibilità. A differenza dei metodi basati su PCR, questo metodo garantisce la quantificazione dell'espressione e la determinazione delle dimensioni dei miRNA. In questo protocollo, mostriamo passaggi cruciali che migliorano il rilevamento di miRNA. Abbiamo modificato le fasi di blotting e ibridazione per ottenere il rilevamento del segnale ad alta risoluzione dei miRNA. Questa tecnica può essere utilizzata anche per il rilevamento di altri piccoli RNA endogeni come siRNA, RNA tasi-secondari e snoRNA.
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Protocol
1. Preparazione di un gel di poliacrilammide denatura 15%
- Pesare e aggiungere 4,8 g di urea, aggiungere 3,75 mL del 40% di acrilammide: soluzione bisacrilamide (19:1) e 1 mL di 10x TBE pH 8.2 in un tubo sterile da 50 mL.
- Sciogliere l'urea con un bagno d'acqua impostato a 60 gradi centigradi in una soluzione chiara.
- Make-up il volume a 10 mL utilizzando acqua sterile appena autoclaved e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione fresca per solifati di ammonio al 10%.
2. Assemblaggio delle lastre di vetro e dell'unità di elettroforesi
- Lavare tutto l'apparato necessario per l'elettroforesi gel e l'elettro-blotting con detergente. Strofinare delicatamente con una spugna morbida per rimuovere il tampone residuo e acrilammide, risciacquare con acqua e lasciarli asciugare.
- Assemblare entrambi i piatti di vetro insieme e metterli saldamente sulla spugna. Utilizzare una piastra spessa 1 mm per questa configurazione. Assicurarsi che le piastre siano allo stesso livello per evitare perdite.
- Per la miscela di gel da 10 mL, aggiungere 8 L di TEMED e 80 ll di soluzione persultante di ammonio appena preparata 10% (w/v).
- Senza indugio, mescolare delicatamente e versare questo tra le lastre di vetro assemblate. Mettere il pettine con attenzione. Evitare di generare bolle d'aria in questo passaggio.
- Lasciare il gel a polimerizzare per circa 45 min.
- Lavare il gel polimerizzato con acqua sterile prima di essere posizionato all'interno della configurazione del gel.
- Assemblare le piastre all'interno della cassetta in esecuzione e rimuovere delicatamente il pettine.
- Versare sterile appena preparato 1x TBE, pH 8.2 nel serbatoio.
- Lavare i pozzi con attenzione pipetting il tampone per rimuovere i cristalli di sale. Questo passaggio aiuta il campione di RNA a funzionare uniformemente attraverso il gel.
- Eseguire una pre-esecuzione a 80 V per 30 min.
3. Preparazione del tinrito e dei campioni di carico
- Per 10 mL di gel carico colorante, pesare 5 mg di bromofenolo blu, 5 mg di xilene cyanol, aggiungere 10 mL di formamide di deionizzato con attenzione e mescolare bene.
- Aliquota di 10 g di RNA totale in un tubo sterile da 1,5 mL e asciugare i campioni con un speedvac. Non asciugare eccessivamente i campioni.
- Risospendere i campioni di RNA in 8: l'ora di carico.
- Riscaldare i campioni a 98 gradi centigradi per 2 min, raffreddare per 1 min a RT, vortice e girare i campioni, per 3 volte. Questo passaggio è essenziale per una corretta sospensione e a sua volta questo aiuta nel caricamento uguale dei campioni.
4. Elettroforesi gel
- Interrompere la pre-esecuzione e lavare i pozze prima del caricamento del campione.
- Riscaldare i campioni a 98 gradi centigradi per 1 min e caricare i campioni caldi nel pozzo utilizzando punte capillari. Inserire la punta sul fondo del pozzo, in modo che il campione occupi uno strato sottile nel pozzo.
- Caricamento completo di tutti i campioni. Includere per caricare l'RNA marcatore decennale.
- Eseguire il gel a 80 V fino a quando il colorante blu bromofenolo corre quasi completamente. Il blu bromofenolo corre a 10 bp in un gel di acrilammide denatura del 15%.
5. Preparazione per l'elettrosbilazione
- Tagliare la membrana di nylon alle dimensioni della piastra di vetro ed etichettare la membrana nell'angolo in alto a destra con una matita HB.
- Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua sterile, rivolto verso il lato etichettato verso la superficie dell'acqua. Pre-immergere la membrana per 15 min.
- Tagliare 4 pezzi di carta assorbente I alle dimensioni del pad in fibra.
- Preparare il sandwich gel per posizionare il lato grigio della cassetta in un vassoio pulito.
- Pre-bagnato il cuscinetto in fibra e posizionarlo sopra la cassetta. Rimuovere le bolle d'aria.
- Pre-bagnato un pezzo di carta assorbente in 1x TBE e posizionare sopra il pad in fibra. Rimuovere le bolle d'aria facendo rotolare una pipetta di plastica sulla carta. Posare un altro pezzo di carta da urlo pre-bagnato e rimuovere le bolle d'aria.
- Rimuovere con attenzione il gel dalla cassetta in esecuzione e posizionarlo sopra l'impostazione del sandwich, in modo che il primo campione di RNA caricato sia verso destra.
- Immergere delicatamente la membrana preimbente in 1x TBE e posizionarla sopra il gel, rivolto verso il basso. Stendere per rimuovere le bolle d'aria.
- Immergere un pezzo di carta assorbente, posarlo sulla membrana e rimuovere le bolle d'aria. Immergere un altro pezzo di carta assorbendo, posizionarlo sopra il setup sandwich e rimuovere le bolle d'aria.
- Completare il panino posizionando un pad in fibra pre-bagnato sopra l'installazione e chiudere saldamente la cassetta.
- Posizionare la cassetta transblot nel modulo e riempire 1x TBE, pH 8.2 fino al segno di gonfiore.
- Trasferire a 10 V, peruna notte a 4 gradi centigradi.
- Dopo il trasferimento, posizionare la membrana umida su un foglio di carta e collegare immediatamente l'RNA alla membrana mediante irradiazione con luce UV da 254 nm (120.000 "joule/cm2). La macchia incrociata potrebbe essere immagazzinata a 4 gradi centigradi per un'ulteriore ibridazione.
6. Preparazione della sonda etichettata radio
- Progettare una sonda completamente complementare al piccolo RNA che deve essere rilevato.
- Etichetta fine della sonda utilizzando ƳP32ATP (ottenuto da BRIT) alla sua fine di 5' combinando i componenti come da ricetta prevista nella Tabella 1.
- Incubare la miscela di reazione di cui sopra a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Separare ƳP32ATP non etichettati dalla sonda utilizzando una colonna Sephadex G-25 in base al protocollo del produttore.
7. Ibridazione della macchia
- Posizionare la macchia collegata incrociata, lato RNA rivolto in alto all'interno di una bottiglia di ibridazione.
- Mescolare vigorosamente il buffer di ibridazione ultra-sensibile, aggiungerne 10 mL e incubare la macchia all'interno di un forno di ibridazione mantenuto a 35 gradi centigradi, con rotazione.
- Eseguire la pre-ibridazione per 20 min.
- Togliere delicatamente la bottiglia dal forno e aggiungere la sonda etichettata nel buffer di ibridazione.
- Ibridare la macchia a 35 gradi centigradi, con rotazione per 12 h.
- Dopo l'ibridazione trasferire attentamente la soluzione di ibridazione in tubo da 15 mL. Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi fino al riutilizzo.
- Eseguire un lavaggio rapido della macchia per 2 min per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso aggiungendo 2x buffer SSC più 0.5% SDS. Eliminare la soluzione.
- Incubare la macchia con buffer SSC 2x più 0,5% SDS per 35 gradi centigradi, con rotazione per 30 min.
- Lavare nuovamente la macchia con buffer SSC da 0,5 x più 0,5% SDS per 35 oC, con rotazione per 30 min.
- Posizionare la macchia all'interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il buffer in eccesso e sigillarlo.
- Esponilo a uno schermo di imager senza radiazioni durante la notte all'interno di una cassetta.
- Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando imager biomolecolare e analizzare i risultati utilizzando un software adatto.
- Strisciare la macchia incubandolo a 80 gradi centigradi, con rotazione per 30 min con buffer SSC 0,5 X più 0,1% SDS e 0,1 X buffer SSC più 0,1% SDS per 30 min.
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Representative Results
In questa dimostrazione, abbiamo rilevato e quantificato l'espressione di miR397 in diversi tessuti di indica var whiteponni (Figura 1). miR397 è un miRNA da 22 nt e miRNA conservato. L'espressione di miR397 può essere rilevata in tutti i campioni testati. Secondo i dati di sequenziamento di nuova generazione, il campione 1 (tessuto di semina) ha miR397 a 5 letture per milione (rpm). Abbiamo rilevato il suo segnale comodamente, indicando che il metodo è molto sensibile e può essere utilizzato per rilevare anche molto bassi abbondanti miRNA. In questo esperimento, abbiamo usato miR168 e U6 come controlli di caricamento.
In questa macchia (Figura 1), la forza dei segnali è stata quantificata utilizzando ImageJ. L'espressione di miR397 è la più alta nella rottura vegetativa delle foglie.
Figura 1: Rilevamento e quantificazione dell'espressione di miR397 in diversi tessuti di campioni di riso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer e soluzione | Ricetta | Commenti |
| 10 X TBE | Buffer Tris da 0,89 M | il pH deve essere impostato su 8,2 utilizzando acido acetico |
| 0,89M Acido borico | ||
| 30mM EDTA | ||
| Miscela di gel | 15% acrilammide-bisacrylamide sol, 19:1 | Miscela di gel non deve contenere cristalli di urea |
| 8M urea | ||
| 1X TBE | ||
| Colorante per il caricamento gel | 0,05 %(w/v) blu bromofenolo | Occorre prestare attenzione durante la manipolazione del formamide deionizzato |
| 0,05 %(w/v) Xylene xyanol | ||
| 100 % deionizzato- formamide | ||
| Etichettatura della sonda | Buffer PNK (10X, 2 l) | Questa miscela contiene molecole radioattive, questo passo deve essere eseguito da personale addestrato all'interno di un laboratorio radioattivo |
| Enzima PNK (1 l) | ||
| Oligo (100 M, 0,1 l) | ||
| ƳP32ATP (4 -L) | ||
| Buffer Lavaggio - I | 2X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Buffer Lavaggio - II | 0.5X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - I | 0.5X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS | ||
| Stripping Buffer - II | 0.1X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS |
Tabella 1: Tabella delle ricette.
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Discussion
Questo metodo può essere ampiamente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di piccoli RNA, compresi i miRNA meno abbondanti. Il protocollo descrive principalmente i passaggi per decolorare l'RNA totale in un buffer di carico, la separazione delle dimensioni mediante elettroforesi gel, il trasferimento di RNA in una membrana, il collegamento incrociato dell'RNA sulla membrana e l'ibridazione utilizzando sonde oligo radioetichettate desiderate.
Il passo critico per qualsiasi esperimento di blotting è l'uso di RNA di buona qualità per la preparazione del campione. Prima di caricare i gel, è necessario assicurarsi che i campioni siano liberi di fluire e non attaccarsi alle punte di carico. Attenzione deve essere preso durante il caricamento del campione, punta deve essere inserita appena sopra la parte inferiore del pozzo in modo che il campione occupa uno strato sottile nel pozzo. La temperatura del forno di ibridazione deve essere mantenuta a 35 gradi centigradi per il rilevamento di miRNA estremamente abbondanti. Per l'ibridazione ripetuta della macchia, conservare la membrana a 4 gradi centigradi mantenendola umida in 2x SSC.
Questo metodo può essere utilizzato per rilevare piccoli RNA da tessuti ricchi di polisaccaridi e polifenoli8. In questo protocollo, l'uso dell'essiccazione sottovuoto per la concentrazione di campioni di RNA fornisce una migliore stabilità e una minore perdita di campione rispetto ad altri metodi più vecchi9. Altre modifiche nel metodo includono la diffusione della membrana in acqua prima di immergersi in 1x TBE durante l'elettrotrasferimento. Questo migliora l'efficienza del trasferimento di RNA, fornendo una migliore risoluzione delle macchie.
Una delle principali limitazioni del metodo è l'uso di radioisotopi, che ha bisogno di personale addestrato e di un laboratorio di radioisotopi per eseguire gli esperimenti di ibridazione. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su tutti i passaggi coinvolti nell'analisi della macchia dell'RNA per il rilevamento dei miRNA. Questo protocollo assicura anche la dimensione del piccolo RNA a parte il suo rilevamento del segnale10. La tecnica fornisce uno strumento robusto per i biologi molecolari per stimare l'abbondanza di vari piccoli RNA come miRNA, siRNA secondari e snoRNA.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'accesso al laboratorio di radiazioni fornito dall'istituto ospitante e BRIT per il radioisotopo. Il laboratorio PVS è supportato dal National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Svizzera/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India. MP riconosce DBT-Research Associateship, DBT, Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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