Summary
Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de não codificação expressa endógenamente expressa, ~21 nt pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão genética em plantas e animais. A maioria dos miRNAs atuam como interruptores negativos de expressão genética visando genes-chave. Nas plantas, as transcrições miRNAs primárias (pri-miRNAs) são geradas pela polimerase RNA II, e formam diferentes comprimentos de estruturas estáveis de laço-tronco chamadas pré-miRNAs. Uma endonuclease, semelhante a Dicer1, processa os pré-miRNAs em duplexes miRNA-miRNA*. Um dos fios do duplex miRNA-miRNA* é selecionado e carregado na proteína Argonaute 1 ou seus homólogos para mediar o decote dos mRNAs alvo. Embora os miRNAs sejam moléculas-chave de sinalização, sua detecção é frequentemente realizada por métodos baseados em PCR menos que ideais em vez de uma análise sensível da mancha do norte. Descrevemos um método norte simples, confiável e extremamente sensível que é ideal para a quantificação dos níveis de miRNA com sensibilidade muito alta, literalmente de qualquer tecido vegetal. Além disso, este método pode ser usado para confirmar o tamanho, estabilidade e a abundância de miRNAs e seus precursores.
Introduction
A recente descoberta de pequenas RNAs regulatórias, microRNAs, tem liderado pesquisas para entendê-las e seu papel em plantas e animais1. Precursores longos de miRNAs são processados em miRNAs maduros de 21 a 24 nt por HYL1 e proteínas específicas semelhantes a dicer2,,3. Um miRNA de 22 nt pode iniciar o silenciamento em cascata gerando siRNAssecundárias 4. Estudos têm mostrado o papel das miRNAs e siRNAs secundárias no desenvolvimento, destino celular e respostas ao estresse5,6.
A hibridização do norte é um método experimental rotineiramente empregado para detectar moléculas específicas de RNA. Este método personaliza seu uso na detecção de aproximadamente 19 -24 nt de comprimento pequeno RNAs de um pool de RNAs totais7. Nesta demonstração, ilustramos o uso desta técnica para a detecção e quantificação de miRNAs. Este método utiliza rotulagem de sondas usando radioisótopos; assim, os níveis de miRNA na amostra podem ser detectados com maior sensibilidade. Ao contrário dos métodos baseados em PCR, este método garante quantificação de expressão, bem como determinação de tamanho dos miRNAs. Neste protocolo, mostramos passos cruciais que melhoram a detecção de miRNA. Modificamos etapas em blotting e hibridização para obtenção de detecção de sinal de alta resolução de miRNAs. Esta técnica também pode ser usada para a detecção de outros RNAs pequenos endógenos, como siRNAs, RNAs tasi-secundários e snoRNAs.
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Protocol
1. Preparação de um gel de poliacrilamida de 15% de desnaturação
- Pesar e adicionar 4,8 g de ureia, adicionar 3,75 mL de 40% de acrilamida: solução bisacrilamida (19:1) e 1 mL de 10x TBE pH 8.2 em um tubo estéril de 50 mL.
- Dissolva a ureia usando um banho de água a 60 °C em uma solução clara.
- Recarrege o volume para 10 mL usando água estéril recém-autoclavada e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente.
- Prepare a solução fresca de persulfito de amônio de 10% (p/v).
2. Montagem das placas de vidro e unidade de eletroforese
- Lave todos os aparelhos necessários para a eletroforese do gel e eletro-blotting com detergente. Esfregue-os suavemente usando uma esponja macia para remover tampão residual e acrilamida, enxágue com água e deixe-os secar.
- Monte as duas placas de vidro juntas e coloque-as firmemente sobre a esponja. Use uma placa de 1 mm de espessura para esta configuração. Certifique-se de que as placas estão no mesmo nível para evitar vazamentos.
- Ao mix de gel de 10 mL, adicione 8 μL de TEMED e 80 μL de solução de persulgônio de amônio recém-preparada de 10% (w/v).
- Sem demora, misture delicadamente e despeje isso entre as placas de vidro montadas. Coloque o pente com cuidado. Evite gerar bolhas de ar nesta etapa.
- Deixe o gel polimerizar por aproximadamente 45 min.
- Lave o gel polimerizado com água estéril antes de colocar dentro da configuração de gel.
- Monte as placas dentro do de corrida e remova o pente suavemente.
- Despeje 1x TBE estéril recém-preparado, pH 8.2 no tanque.
- Lave os poços cuidadosamente, encanar o tampão para remover cristais de sal. Esta etapa ajuda a amostra de RNA a correr uniformemente através do gel.
- Faça uma pré-execução em 80 V por 30 minutos.
3. Preparação de corante de carregamento e amostras
- Para 10 mL de corante de carregamento de gel, pese 5 mg de azul bromofenol, 5 mg de cianol de xileno, adicione 10 mL de formamide desionizado cuidadosamente e misture-os bem.
- Aliquot 10 μg de RNA total em um tubo estéril de 1,5 mL e seque as amostras usando um speedvac. Não seque demais as amostras.
- Resuspend as amostras de RNA em 8 μL de carregamento.
- Aqueça as amostras a 98 °C por 2 min, esfrie por 1 min no RT, vórtice e gire as amostras, por 3 vezes. Esta etapa é essencial para a ressuspensão adequada e, por sua vez, ajuda no carregamento igual das amostras.
4. Eletroforese de gel
- Pare a pré-execução e lave os poços antes do carregamento da amostra.
- Aqueça as amostras a 98 °C por 1 min e carregue as amostras quentes no poço usando pontas capilares. Insira a ponta na parte inferior do poço, de modo que a amostra ocupe uma camada fina no poço.
- Carregamento completo de todas as amostras. Inclua carregar o marcador da década de RNA.
- Execute o gel a 80 V até que o corante azul bromofenol funcione quase completamente. Bromophenol azul funciona a 10 bp em um gel de acrilamida de 15% de desnaturação.
5. Preparação para eletro-mancha
- Corte a membrana N+nylon nas dimensões da placa de vidro e rotule a membrana em seu canto superior direito com um lápis HB.
- Coloque suavemente a membrana na superfície da água estéril, voltada para o lado rotulado em direção à superfície da água. Pré-mergulhe a membrana por 15 minutos.
- Corte 4 pedaços de papel manchado I nas dimensões da almofada de fibra.
- Prepare o sanduíche de gel para colocar o lado cinza do em uma bandeja limpa.
- Pré-molhar a almofada de fibra e colocá-la sobre o. Remova bolhas de ar.
- Pré-molhado um pedaço de papel de mancha em 1x TBE e coloque sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Coloque outro pedaço de papel de mancha pré-molhado e remova bolhas de ar.
- Remova cuidadosamente o gel do de corrida e coloque-o sobre a configuração do sanduíche, de tal forma que a primeira amostra de RNA carregada seja para a direita.
- Mergulhe suavemente a membrana pré-encharcada em 1x TBE e coloque-a sobre o gel, de frente para o lado rotulado para baixo. Role para fora para remover as bolhas de ar.
- Mergulhe um pedaço de papel manchado, coloque-o sobre a membrana, e remova as bolhas de ar. Mergulhe outro pedaço de papel manchado, coloque-o sobre a configuração do sanduíche e remova bolhas de ar.
- Complete o sanduíche colocando uma almofada de fibra pré-molhada sobre a configuração e feche firmemente o.
- Coloque o transblot no módulo e encha 1x TBE, pH 8.2 até a marca de manchas.
- Transfira a 10 V, durante a noite a 4 °C.
- Após a transferência, coloque a membrana úmida em uma folha de papel e transfira imediatamente o RNA à membrana por irradiação com luz UV de 254 nm (120.000 μjoules/cm²). A mancha transversal talvez armazenada a 4 °C para posterior hibridização.
6. Preparação da sonda radiolabeled
- Projete uma sonda completamente complementar ao pequeno RNA que deve ser detectado.
- Rotule a sonda final usando32ATP (obtida da BRIT) no final de 5' combinando os componentes conforme receita fornecida na Tabela 1.
- Incubar a mistura de reação acima a 37 °C por 30 min.
- Separe o ATP não rotulado de32ATP da sonda usando uma coluna Sephadex G-25 de acordo com o protocolo do fabricante.
7. Hibridização da mancha
- Coloque a mancha cruzada, o lado RNA voltado para cima dentro de uma garrafa de hibridização.
- Misture vigorosamente o tampão de hibridização ultrassensível, adicione 10 mL dele e incubar a mancha dentro de um forno de hibridização mantido a 35 °C, com rotação.
- Realizar a pré-hibridização por 20 min.
- Retire a garrafa do forno e adicione a sonda rotulada no tampão de hibridização suavemente.
- Hibridize a mancha a 35 °C, com rotação para 12 h.
- Após a hibridização transfira cuidadosamente a solução de hibridização para tubo de 15 mL. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C até reutilizar.
- Realize uma lavagem rápida da mancha por 2 minutos para remover a solução de hibridização em excesso adicionando tampão SSC 2x mais SDS de 0,5%. Descarte a solução.
- Incubar a mancha com tampão SSC 2x mais SDS de 0,5% para 35 °C, com rotação de 30 min.
- Lave a mancha novamente com tampão SSC de 0,5x mais SDS de 0,5% para 35°C, com rotação de 30 min.
- Coloque a mancha dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e sele-a.
- Exponha-o a uma tela de imagem de fósforo livre de radiação durante a noite dentro de uma fita.
- Detecte o sinal de hibridização usando imager biomolecular e analise os resultados usando software adequado.
- Retire a mancha incubando-a a 80 °C, com rotação para 30 min com tampão SSC de 0,5 X mais 0,1% SDS e 0,1 X SSC tampão mais 0,1% SDS por 30 min.
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Representative Results
Nesta demonstração, detectamos e quantificamos a expressão do miR397 em diferentes tecidos de arroz indica var whiteponni(Figura 1). miR397 é um miRNA de 22 nt e miRNA conservado. A expressão do miR397 pode ser detectada em todas as amostras testadas. De acordo com os dados de sequenciamento de próxima geração, a amostra 1 (tecido de mudas) tem miR397 a 5 leituras por milhão (rpm). Detectamos seu sinal confortavelmente, indicando que o método é muito sensível e pode ser usado para detectar até mesmo miRNAs muito baixas e abundantes. Neste experimento, usamos miR168 e U6 como controles de carregamento.
Nesta mancha(Figura 1),a força dos sinais foi quantificada utilizando ImageJ. A expressão do miR397 é mais alta em baia de folhas vegetativas.
Figura 1: Detecção e quantificação da expressão do miR397 em diferentes tecidos de amostras de arroz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão e solução | Receita | Comentários |
| 10 X TBE | Tampão Tris 0.89M | pH deve ser definido para 8.2 usando ácido acético |
| 0,89M Ácido bórico | ||
| EDTA 30mM | ||
| Mistura de gel | 15% acrilamida-bisacrilamida sol, 19:1 | Mistura de gel não deve conter cristais de ureia |
| Ureia 8M | ||
| 1X TBE | ||
| Corante de carregamento de gel | 0,05 %(w/v) azul bromofenol | Deve-se tomar cuidado ao manusear formamida desionizada |
| 0,05 %(w/v) Xileno xyanol | ||
| 100 % de formamide deionizado | ||
| Rotulagem da sonda | Tampão PNK (10X, 2 μL) | Esta mistura contém moléculas radioativas, esta etapa deve ser realizada por personel treinado dentro de um laboratório radioativo |
| Enzima PNK (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μL) | ||
| ATP 32 (4 μL) | ||
| Tampão de Lavagem - I | 2X SSC | |
| SDS 0,5% (w/v) | ||
| Tampão de lavagem - II | 0,5X SSC | |
| SDS 0,5% (w/v) | ||
| Tampão de despojo - I | 0,5X SSC | |
| SDS 0,1% (w/v) | ||
| Tampão de despojo - II | 0.1X SSC | |
| SDS 0,1% (w/v) |
Tabela 1: Tabela de receitas.
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Discussion
Este método pode ser amplamente utilizado para detecção e quantificação de pequenos RNAs, incluindo miRNAs menos abundantes. O protocolo descreve principalmente os passos para desnaturar o RNA total em um buffer de carregamento, separação de tamanho por eletroforese de gel, transferência de RNA para uma membrana, cruzar o RNA para a membrana e hibridizar usando sondas oligo chamadas radiolabeled desejadas.
O passo crítico para qualquer experimento de manchas é o uso de RNA de boa qualidade para preparação de amostras. Antes de carregar os géis, deve-se certificar-se de que as amostras estão fluindo livremente e não aderindo às pontas de carregamento. Deve-se tomar cuidado durante o carregamento da amostra, a ponta deve ser inserida logo acima da parte inferior do poço para que a amostra ocupe uma camada fina no poço. A temperatura do forno de hibridização deve ser mantida a 35 °C para detecção de miRNAs extremamente menos abundantes. Para a hibridização repetida da mancha, armazene a membrana a 4 °C mantendo-a úmida em 2x SSC.
Este método pode ser usado para detectar pequenas RNAs de tecidos ricos em polissacarídeos e polifenóis8. Neste protocolo, o uso da secagem a vácuo para concentrar amostras de RNA proporciona melhor estabilidade e menor perda de amostra em comparação com outros métodos mais antigos9. Outra modificação no método inclui a disseminação da membrana na água antes de mergulhar em 1x TBE durante a eletrotransferimento. Isso melhora a eficiência da transferência de RNA, proporcionando uma melhor resolução da mancha.
Uma grande limitação do método é o uso de radioisótopos, que precisa de pessoal treinado e um laboratório de radioisótopos para realizar os experimentos de hibridização. Este método aqui fornece informações detalhadas sobre todas as etapas envolvidas na análise de manchas de RNA para a detecção de miRNAs. Este protocolo também garante o tamanho do pequeno RNA além de sua detecção de sinal10. A técnica fornece uma ferramenta robusta para biólogos moleculares estimar a abundância de vários pequenos RNAs, como miRNAs, siRNAs secundárias e snoRNAs.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o acesso ao laboratório de radiação fornecido pelo instituto anfitrião e pelo BRIT para radioisótopos. O laboratório PVS é apoiado pelo Centro Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Tata de Pesquisa Fundamental e bolsas (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. MP reconhece DBT-Research Associateship, DBT, Governo da Índia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
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- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
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