Summary
この方法は、全RNA抽出物からmiRNAを検出するためのノーザンハイブリダイゼーション技術の使用を実証する。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物の両方における遺伝子発現の調節に関与する内因的に非コード的に発現するクラスであり、〜21nt小さいRNAである。ほとんどのmiRNAは、主要遺伝子を標的とする遺伝子発現の陰性スイッチとして機能します。植物では、一次miRNA(プリミRNA)転写産物はRNAポリメラーゼIIによって生成され、プレミRNAと呼ばれる安定したステムループ構造の様々な長さを形成する。エンドヌクレアーゼ、Dicer-like1は、プレミRNAをmiRNA-miRNA*二重鎖に処理します。miRNA-miRNA*二重鎖からストランドの1つを選択し、アルゴノート1タンパク質またはそのホモログにロードして、標的mRNAの切断を仲介する。miRNAは主要なシグナル伝達分子ですが、それらの検出は、感度の高いノーザンブロット分析ではなく、最適なPCRベースの方法よりも低い方法で行われることが多い。我々は、文字通り、任意の植物組織から、非常に高感度でmiRNAレベルの定量に最適である、シンプルで信頼性の高い、非常に敏感な北部の方法を記述します。さらに、この方法は、miRNAとその前駆体のサイズ、安定性および存在量を確認するために使用することができる。
Introduction
最近の小さな規制RNAの発見, マイクロRNA, それらを理解する研究をリードし、植物や動物でのそれらの役割1.miRNAの長い前駆体はHYL1および特異的なダイサー様タンパク質22、33によって21〜24nt成熟したmiRNAに処理される。22 nt miRNA は、二次 siRNA4を生成することによってカスケードサイレンシングを開始できます。研究は、開発におけるmiRNAおよび二次siRNAの役割を示している, 細胞の運命とストレス応答5,,6.
ノーザンハイブリダイゼーションは、特定のRNA分子を検出するために日常的に採用されている実験的方法である。このメソッドは、合計 RNA7のプールから約 19 -24 nt 長い小さな RNA の検出での使用をカスタマイズします。このデモでは、miRNAの検出と定量にこの手法を用いるための方法を示します。この方法では、放射性同位元素を使用したプローブのラベリングを使用します。したがって、サンプル中のmiRNAレベルは、感度の向上とともに検出することができる。PCRベースの方法とは異なり、この方法は、miRNAのサイズ決定だけでなく、発現の定量を保証します。このプロトコルでは、miRNA検出を改善する重要なステップを示します。miRNAの高分解能信号検出を得るためのブロッティングとハイブリダイゼーションのステップを修正しました。この技術はまた、siRNA、タシ二次RNAおよびスノRNAのような他の内因性小さいRNAを検出するために使用することができる。
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Protocol
1. 15%変性ポリアクリルアミドゲルの調製
- 尿素の4.8 gを加え、40%アクリルアミドの3.75 mLを加え、ビサクリアミド(19:1)溶液と10x TBE pH 8.2の1 mLを無菌50 mLチューブに加えます。
- 60°Cにセットした水浴を用いて尿素を透明な溶液に溶かします。
- オートクレーブされた新しい滅菌水を使用して体積を10 mLにメイクアップし、ゲルミックスを室温まで冷却します。
- 新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を調製します。
2. ガラス板と電気泳動ユニットの組み立て
- ゲル電気泳動と電気ブロッティングに必要な装置をすべて洗剤で洗います。柔らかいスポンジを使ってやさしくこすり、残留バッファーとアクリルアミドを取り除き、水で洗い流し、乾燥させます。
- 両方のガラス板を一緒に組み立て、スポンジの上にしっかりと置きます。このセットアップには厚さ1mmのプレートを使用してください。漏れを避けるために、プレートが同じレベルであることを確認してください。
- 10 mLのゲルミックスに、8 μLのTEMEDと80 μLの新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を加えます。
- 遅滞なく、組み立てられたガラス板の間に静かに混ぜて注ぎます。櫛を慎重に置きます。このステップでは気泡の発生を避けてください。
- ゲルを約45分間重合します。
- ゲルランニングセットアップの内側に入れる前に、滅菌水で重合したゲルを洗浄してください。
- ランニングカセットの中にプレートを組み立て、くしをそっと取り外します。
- 作りたての無菌1x TBE、pH 8.2をタンクに注ぎます。
- 塩結晶を除去するためにバッファーをピペット化して井戸を慎重に洗浄します。このステップは、RNAサンプルがゲル全体を均一に実行するのに役立ちます。
- 80 Vで30分間前走を行います。
3. 積載染料とサンプルの調製
- ゲルローディング色素の10 mLの場合、5mgのブロモフェノールブルー、キシレンシアノール5mgを量り、10mLの脱イオン化ホルムアミドを慎重に加え、よく混ぜます。
- アリコート10 μgの全RNAを無菌1.5 mLチューブに入れ、speedvacを使用してサンプルを乾燥させます。サンプルを過度に乾燥させないでください。
- 8 μLの荷重でRNAサンプルを再中断します。
- 98°Cで2分間加熱し、RTで1分間冷却し、サンプルを回転させ、3回回転させます。このステップは、適切な再懸濁のために不可欠であり、順番にこれは、サンプルの等しい負荷に役立ちます。
4. ゲル電気泳動
- 事前実行を停止し、サンプルローディングの前に井戸を洗います。
- 98°Cでサンプルを1分間加熱し、毛細管の先端を使用してサンプルを井戸に熱くロードします。サンプルがウェル内の1つの薄い層を占めるように、先端を井戸の底に挿入します。
- すべてのサンプルの完全な読み込み。RNA 10年マーカーをロードすることを含む。
- ブロモフェノールブルー染料がほぼ完全に実行されるまで、ゲルを80 Vで実行します。ブロモフェノールブルーは、15%変性アクリルアミドゲルで10 bpで実行されます。
5. エレクトロブロッティングの準備
- N+ナイロン膜をガラス板の寸法に切り、右上の隅にHB鉛筆でラベルを付けます。
- 滅菌水の表面に静かに膜を置き、ラベル付けされた側を水面に向けます。膜を15分間あらかじめ浸します。
- 4枚のブロッティングペーパーIをファイバーパッドの寸法にカットする。
- カセットのグレーの側面を清潔なトレイに入れるためのゲルサンドイッチを準備します。
- 繊維パッドをあらかじめ濡らし、カセットの上に置きます。気泡を取り除く。
- 1x TBEで1枚のブロッティングペーパーを事前に濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチック製のピペットを紙の上に転がして気泡を取り除きます。別の濡れたブロッティングペーパーを置き、気泡を取り除きます。
- 実行中のカセットからゲルを慎重に取り出し、最初にロードされたRNAサンプルが右側に向かうよう、サンドイッチのセットアップの上に置きます。
- 1x TBEに浸した膜をそっと浸し、ラベル付きの側面を下に向けてゲルの上に置きます。ロールアウトして気泡を取り除きます。
- ブロッティング紙を1枚浸し、膜の上に置き、気泡を取り除きます。別のブロッティングペーパーを浸し、サンドイッチのセットアップの上に置き、気泡を取り除きます。
- セットアップの上にプリウェットファイバーパッドを置き、しっかりとカセットを閉じてサンドイッチを完成させます。
- トランスブロットカセットをモジュールに入れ、1x TBE、pH 8.2をブロッティングマークまで充填します。
- 10 Vで、一晩4°Cで移動する。
- 転写後、湿った膜を紙シートに置き、254nm UV光(120,000 μjoules/cm²)を照射してRNAを膜に直ちにクロスリンクします。架橋ブロットは、さらにハイブリダイゼーションのために4°Cで保存される可能性があります。
6. 放射性標識プローブの調製
- 検出される小さなRNAと完全に相補的なプローブを設計します。
- 表1に示すレシピに従ってコンポーネントを組み合わせることにより、ƳP32ATP(BRITから取得)を使用してプローブにラベルを付けます。
- 上記の反応混合物を30分間37°Cでインキュベートする。
- メーカーのプロトコルに従ってSephadex G-25カラムを使用して、非ラベルのƳP32ATPをプローブから分離します。
7. ブロットのハイブリダイゼーション
- 交差したブロットを、RNA側はハイブリダイゼーションボトルの中に上に向けます。
- 超高感度ハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合し、10 mLを加え、35°Cで維持したハイブリダイゼーションオーブン内のブロットを回転でインキュベートします。
- 20分間の事前ハイブリダイゼーションを行います。
- オーブンからボトルを取り出し、ラベル付きプローブをそっとハイブリダイゼーションバッファに追加します。
- 35°Cでブロットをハイブリダイズし、12時間回転させます。
- ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を15 mLチューブに慎重に移します。この溶液は、再使用するまで4°Cで保存することができます。
- 2x SSCバッファーに0.5%SDSを加えて過剰なハイブリダイゼーション溶液を除去するために、2分間のブロットのクイック洗浄を行います。ソリューションを破棄します。
- 2x SSCバッファーに0.5%のSDSを加えた35°Cでブロットをインキュベートし、30分間回転させます。
- 0.5x SSCバッファーに0.5%SDSを加えた35°Cで再びブロットを洗浄し、30分間回転させます。
- ブリダイゼーションカバーの中にブロットを入れ、余分なバッファーを取り除き、密封します。
- カセット内の一晩の放射線フリー蛍光体イメージャースクリーンに公開します。
- 生体分子画像を用いてハイブリダイゼーション信号を検出し、適切なソフトウェアを用いて結果を解析する。
- 80 °Cでインキュベートしてブロットを取り除き、0.5 X SSCバッファに0.1%SDSと0.1 X SSCバッファに加えて0.1%SDCバッファを30分間30分間回転させます。
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Representative Results
このデモでは、インディカ米の異なる組織におけるmiR397の発現を検出し、定量化した(図1)。miR397は22のnt miRNAおよび保存されたmiRNAである。miR397の発現は、テストされたすべてのサンプルで検出することができます。次世代シーケンシングデータに従って、サンプル1(苗組織)は100万回当たり5読み(rpm)でmiR397を有する。我々は、その信号を快適に検出し、この方法が非常に敏感であり、非常に低い豊富なmiRNAを検出するために使用できることを示した。今回の実験では、読み込みコントロールとして miR168 とU6を使用しました。
このブロット(図1)では、ImageJを用いて信号の強度を定量した。miR397の発現は、栄養葉鞘において最も高い。
図1:米サンプルの異なる組織におけるmiR397の発現の検出と定量化この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファとソリューション | レシピ | コメント |
| 10 X TBE | 0.89M トリスバッファ | pHは酢酸を使用して8.2に設定する必要があります |
| ホウ酸 0.89M | ||
| 30mM EDTA | ||
| ゲルミックス | 15% アクリルアミドビサリアミドゾル, 19:1 | ゲルミックスは尿素結晶を含んではなりません |
| 8M尿素 | ||
| 1X TBE | ||
| ゲルローディング染料 | 0.05 %(w/v) ブロモフェノールブルー | 脱イオン化されたフォルミドを扱っている間は注意が必要です |
| 0.05 %(w/v) キシレンキシヤノール | ||
| 100 % 脱イオン - フォームアミド | ||
| プローブのラベリング | PNKバッファ(10X、2 μL) | この混合物は放射性分子を含み、このステップは放射性実験室の中で訓練されたペルソナによって行われなければならない |
| PNK酵素(1 μL) | ||
| オリゴ(100 μM、0.1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| ウォッシュバッファ - I | 2X SSC | |
| 0.5% (w/v) SDS | ||
| ウォッシュバッファ - II | 0.5X SSC | |
| 0.5% (w/v) SDS | ||
| ストリッピングバッファ - I | 0.5X SSC | |
| 0.1% (w/v) SDS | ||
| ストリッピングバッファ - II | 0.1X SSC | |
| 0.1% (w/v) SDS |
表1: レシピの表
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Discussion
この方法は、あまり豊富なmiRNAを含む小さなRNAの検出および定量化に広く使用することができる。プロトコルは主に、ローディングバッファー内の全RNAを変量するステップ、ゲル電気泳動によるサイズ分離、膜へのRNAの伝達、RNAを膜に架橋し、所望の放射性標識されたオリゴプローブを使用してハイブリダイズするステップを記述する。
ブロッティング実験の重要なステップは、サンプル調製のための良質のRNAの使用です。ゲルをロードする前に、サンプルが自由に流れ、負荷の先端に固執していないことを確認する必要があります。サンプルをロードする間は注意が必要ですが、サンプルがウェル内の1つの薄い層を占めているように、先端は井戸の底のすぐ上に挿入する必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの温度は、非常に少ない豊富なmiRNAの検出のために35°Cで維持されなければなりません。ブロットのハイブリダイゼーションを繰り返す場合は、2倍のSSCで湿気を保ち、4°Cで保存してください。
この方法は、多糖類およびポリフェノール8が豊富な組織から小さなRNAを検出するために使用することができる。このプロトコルでは、RNAサンプルを濃縮するための真空乾燥の使用は、他の古い方法9と比較して、より良い安定性とサンプルの損失を少なく提供します。この方法の他の修飾は、電気移動中に1x TBEに浸漬する前に、水中で膜の広がり出す方法を含む。これにより、RNAの伝達効率が向上し、ブロットの分解能が向上します。
この方法の大きな制限は、訓練を受けた人員と放射性同位元素ラボがハイブリダイゼーション実験を行う必要がある放射性同位元素の使用です。この方法は、miRNAの検出のためのRNAブロット分析に関与するすべてのステップに関する詳細な情報を提供します。このプロトコルはまた、その信号検出10とは別に小さなRNAのサイズを保証する。この技術は、miRNA、二次siRNAおよびスノRNAのような様々な小さいRNAの存在を推定するための分子生物学者のための強力なツールを提供する。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
著者らは、ホスト研究所とBRITが提供する放射線ラボへのアクセスを認めている。PVS研究所は、国立生物科学センター、タタ基礎研究所、助成金(BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;;BT/IN/スイス/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017) インド政府バイオテクノロジー省から。MPは、DBT研究アソシエイトシップ、DBT、インド政府を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
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- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
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