Summary
यह विधि कुल आरएनए अर्क से miRNAs का पता लगाने के लिए उत्तरी संकरण तकनीक के उपयोग को दर्शाता है।
Abstract
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएन) अंतर्जात व्यक्त गैर-कोडिंग का एक वर्ग है, ~ 21 एनटी छोटे आरएनए पौधों और जानवरों दोनों में जीन अभिव्यक्ति के नियमन में शामिल हैं। अधिकांश miRNAs प्रमुख जीन को लक्षित जीन अभिव्यक्ति के नकारात्मक स्विच के रूप में कार्य करते हैं । पौधों में, प्राथमिक मीन्रान (पीआरआईएनए) ट्रांसक्रिप्ट आरएनए पॉलीमरेज II द्वारा उत्पन्न होते हैं, और वे स्थिर स्टेम-लूप संरचनाओं की अलग-अलग लंबाई बनाते हैं जिन्हें प्री-मिरनास कहा जाता है। एक एंडोक्यूलीज, डिसर-लाइक1, प्री-मिरना-मिरना * डुप्लेक्स में प्री-मिरना को संसाधित करता है। मिरना-मिरना * डुप्लेक्स से एक किस्में का चयन किया जाता है और लक्ष्य mRNAs के दरार मध्यस्थता करने के लिए Argonaute 1 प्रोटीन या उसके समरूपों पर लोड किया जाता है। यद्यपि miRNAs प्रमुख संकेत अणु हैं, उनका पता लगाना अक्सर संवेदनशील उत्तरी दाग विश्लेषण के बजाय इष्टतम पीसीआर-आधारित तरीकों से कम द्वारा किया जाता है। हम एक सरल, विश्वसनीय और अत्यंत संवेदनशील उत्तरी विधि का वर्णन करते हैं जो किसी भी पौधे के ऊतकों से शाब्दिक रूप से बहुत उच्च संवेदनशीलता के साथ मिरना स्तरों के मात्राकरण के लिए आदर्श है। इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग मीन्राएएस और उनके अग्रदूतों के आकार, स्थिरता और बहुतायत की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
लघु नियामक आरएनए, माइक्रोआरएनए की हालिया खोज ने उन्हें समझने में अनुसंधान का नेतृत्व किया है और पौधों और जानवरों में उनकी भूमिका1। एमआईआरएन के लंबे अग्रदूतों को एचवाईएल1 और विशिष्ट डाइसर जैसे प्रोटीन2,3द्वारा 21 से24परिपक्व मीन्रा में संसाधित किया जाता है। 22 एनटी मिरना माध्यमिक सिर्ना4का उत्पादन करके झरना को शुरू कर सकता है । अध्ययनों से पता चला है कि विकास, कोशिका भाग्य और तनाव प्रतिक्रियाओं में मिरना और माध्यमिक सीआरएएनए की भूमिका5,,6।
उत्तरी संकरण एक प्रयोगात्मक विधि है जो विशिष्ट आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए नियमित रूप से नियोजित है। यह विधि कुल आरएनए7के पूल से लगभग 19 - 24 एनटी लंबे छोटे आरएनए का पता लगाने में इसके उपयोग को अनुकूलित करती है । इस प्रदर्शन में, हम miRNAs का पता लगाने और मात्राकरण के लिए इस तकनीक के उपयोग को दर्शाते हैं। यह विधि रेडियोआइसोटोप का उपयोग करके जांच की लेबलिंग का उपयोग करती है; इस प्रकार, नमूने में मिरना स्तरों को बढ़ी हुई संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है। पीसीआर-आधारित तरीकों के विपरीत, यह विधि अभिव्यक्ति के मात्राकरण के साथ-साथ मिरनस के आकार निर्धारण को सुनिश्चित करती है। इस प्रोटोकॉल में, हम महत्वपूर्ण कदम दिखाते हैं जो मिरना का पता लगाने में सुधार करते हैं। हमने मीनआरएनए का उच्च संकल्प संकेत पता लगाने के लिए ब्लॉटिंग और हाइब्रिडीकरण में कदम संशोधित किए हैं। इस तकनीक का उपयोग अन्य अंतर्जात छोटे आरएनए जैसे एसआईआरएन, तासी-माध्यमिक आरएनए और स्नोर्ना का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है।
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Protocol
1. 15% डेनटरिंग पॉलीएक्रेलैमाइड जेल की तैयारी
- वजन और यूरिया के 4.8 ग्राम जोड़ें, 40% एक्रिलैमाइड के 3.75 एमएल जोड़ें: बिस्क्र्लेमाइड (19:1) समाधान और 10x TBE pH 8.2 के 1 एमएल को बाँझ 50 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
- यूरिया को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी स्नान का उपयोग करके एक स्पष्ट समाधान में घोलें।
- ताजा ऑटोक्लेव बाँझ पानी का उपयोग करके 10 एमएल तक वॉल्यूम बनाएं और जेल मिश्रण को कमरे के तापमान में ठंडा करें।
- ताजा 10% (w/v) अमोनियम persulfate समाधान तैयार करें ।
2. ग्लास प्लेट्स और इलेक्ट्रोफोरेसिस यूनिट की असेंबली
- डिटर्जेंट के साथ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इलेक्ट्रो-ब्लॉटिंग के लिए आवश्यक सभी उपकरण धोएं। अवशिष्ट बफर और एक्रिलैमाइड को हटाने के लिए नरम स्पंज का उपयोग करके धीरे-धीरे उन्हें साफ़ करें, पानी से कुल्ला करें और उन्हें सूखने दें।
- दोनों ग्लास प्लेटों को एक साथ इकट्ठा करें और उन्हें स्पंज पर मजबूती से रखें। इस सेटअप के लिए 1 एमएम मोटी प्लेट का इस्तेमाल करें। सुनिश्चित करें कि प्लेटें रिसाव से बचने के लिए एक ही स्तर पर हैं।
- 10 एमएल जेल मिश्रण करने के लिए, TEMED के 8 माइक्रोन और हौसले से तैयार 10% (w/v) अमोनियम persulfate समाधान के ८० μL जोड़ें ।
- बिना किसी देरी के, धीरे-धीरे मिलाएं और इसे इकट्ठे ग्लास प्लेटों के बीच डालें। कंघी को ध्यान से रखें। इस चरण में हवा-बुलबुले पैदा करने से बचें।
- जेल को लगभग 45 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें।
- जेल चलाने वाले सेटअप के अंदर रखने से पहले पॉलीमराइज्ड जेल को बाँझ पानी से धोएं।
- प्लेटों को चल रहे कैसेट के अंदर इकट्ठा करें और कंघी को धीरे-धीरे हटा दें।
- टैंक में ताजा तैयार बाँझ 1x TBE, पीएच 8.2 डालो।
- नमक क्रिस्टल को हटाने के लिए बफर को पाइप करके कुओं को ध्यान से धोएं। यह कदम आरएनए नमूने को जेल में समान रूप से चलाने में मदद करता है।
- 30 मिनट के लिए ८० वी पर एक पूर्व रन प्रदर्शन करते हैं ।
3. लोडिंग डाई और नमूने की तैयारी
- जेल लोडिंग डाई के 10 एमएल के लिए, 5 मिलीग्राम ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 5 मिलीग्राम जाइलीन सायनोल का वजन करें, 10 एमएल डिओनाइज्ड फॉर्मामाइड को ध्यान से जोड़ें और उन्हें अच्छी तरह से मिलाएं।
- एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में कुल आरएनए के 10 माइक्रोन अलीकोट और एक speedvac का उपयोग कर नमूनों सूखी। नमूनों को अधिक सूखा न करें।
- लोडिंग के 8 माइक्रोल में आरएनए नमूनों को फिर से खर्च करें।
- नमूनों को 2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, आरटी, भंवर में 1 मिनट के लिए ठंडा करें और नमूनों को 3 बार स्पिन करें। यह कदम उचित पुनर्पंचन के लिए आवश्यक है और बदले में यह नमूनों की समान लोडिंग में मदद करता है।
4. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस
- सैंपल लोड होने से पहले से चलाना बंद कर दें और कुओं को धो लें।
- नमूनों को 1 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और केशिका युक्तियों का उपयोग करके नमूनों को अच्छी तरह से गर्म लोड करें। अच्छी तरह से नीचे टिप डालें, ताकि नमूना अच्छी तरह से एक पतली परत में रह रहे हैं।
- सभी नमूनों की पूरी लोडिंग। आरएनए दशक मार्कर लोड करने के लिए शामिल करें।
- 80 वी पर जेल चलाएं जब तक ब्रोमोफेनॉल ब्लू डाई लगभग पूरी तरह से चलता है। ब्रोमोफेनॉल ब्लू 15% डेनटुरिंग एक्रिलामाइड जेल में 10 बीपी पर चलता है।
5. इलेक्ट्रो-ब्लॉटिंग की तैयारी
- एन + नायलॉन झिल्ली को ग्लास प्लेट के आयामों में काटें और एचबी पेंसिल के साथ अपने शीर्ष-दाएं कोने पर झिल्ली को लेबल करें।
- धीरे-धीरे बाँझ पानी की सतह पर झिल्ली रखें, पानी की सतह की ओर लेबल पक्ष का सामना करना पड़ रहा है। झिल्ली को 15 मिनट के लिए प्री-सोख दें।
- फाइबर पैड के आयामों के लिए कागज मैं ब्लॉटिंग के 4 टुकड़े काटें।
- कैसेट के ग्रे साइड को साफ ट्रे में नीचे रखने के लिए जेल सैंडविच तैयार करें।
- फाइबर पैड को प्री-वेट करें और इसे कैसेट के ऊपर रखें। हवा के बुलबुले निकालें।
- 1x TBE में ब्लॉटिंग पेपर का प्री-वेट वन पीस और फाइबर पैड पर रखें। कागज के ऊपर एक प्लास्टिक पिपेट रोलिंग द्वारा हवा के बुलबुले निकालें। पूर्व गीला दाग कागज का एक और टुकड़ा रखना और हवा बुलबुले को दूर।
- जेल को रनिंग कैसेट से सावधानी से हटा दें और इसे सैंडविच सेटअप पर रखें, जैसे कि पहला लोडेड आरएनए नमूना दाईं ओर हो।
- धीरे-धीरे 1x TBE में पूर्व लथपथ झिल्ली को डुबोएं और इसे जेल पर रखें, लेबल वाले पक्ष का सामना करना पड़ रहा है। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए रोल आउट करें।
- ब्लॉटिंग पेपर का एक टुकड़ा डुबोएं, इसे झिल्ली के ऊपर रखें, और हवा के बुलबुले को हटा दें। ब्लॉटिंग पेपर का एक और टुकड़ा डुबोएं, इसे सैंडविच सेटअप पर रखें और हवा के बुलबुले को हटा दें।
- सेटअप के ऊपर प्री-वेट फाइबर पैड रखकर सैंडविच को पूरा करें और कैसेट को मजबूती से बंद करें।
- मॉड्यूल में ट्रांसब्लॉट कैसेट रखें और 1x TBE, पीएच 8.2 को ब्लॉटिंग मार्क तक भरें।
- 10 वी पर स्थानांतरण, रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- स्थानांतरण के बाद, नम झिल्ली को पेपर शीट पर रखें और तुरंत 254-एनएम यूवी लाइट (120,000 माइक्रोजूल/सेमी ²) के साथ विकिरण द्वारा आरएनए को झिल्ली से क्रॉस-लिंक करें। क्रॉस-लिंक्ड दाग शायद आगे संकरण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
6. रेडियोलेबल जांच की तैयारी
- एक जांच डिजाइन करें जो छोटे आरएनए के लिए पूरी तरह से पूरक है जिसका पता लगाया जाना है।
- टेबल 1में प्रदान किए गए नुस्खा के अनुसार घटकों के संयोजनों को जोड़कर अपने 5 ' अंत में32एटीपी (ब्रिट से प्राप्त) के ƳP का उपयोग करके जांच को समाप्त करें।
- उपरोक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेपडेक्सजी-25कॉलम का उपयोग करके जांच से ३२ एटीपी के ƳP अलग से लेबल किया गया है ।
7. दाग का संकरण
- एक संकरण बोतल के अंदर शीर्ष का सामना करना पड़ पार से जुड़े दाग, आरएनए पक्ष रखें ।
- अति-संवेदनशील संकरण बफर को तेजी से मिलाएं, इसमें से 10 एमएल जोड़ें और रोटेशन के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए संकरण ओवन के अंदर दाग को इनक्यूबेट करें।
- 20 मिनट के लिए पूर्व संकरण प्रदर्शन करें।
- ओवन से बोतल निकालें और संकरण बफर धीरे में लेबल जांच जोड़ें ।
- 12 घंटे के लिए रोटेशन के साथ, 35 डिग्री सेल्सियस पर दाग को संकरित करें।
- संकरण के बाद सावधानी से संकरण समाधान को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस समाधान को फिर से उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 2x एसएससी बफर प्लस 0.5% एसडीएस जोड़कर अतिरिक्त संकरण समाधान को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए दाग का त्वरित धोने का प्रदर्शन करें। समाधान को त्याग दें।
- 35 डिग्री सेल्सियस के लिए 2x एसएससी बफर प्लस 0.5% एसडीएस के साथ दाग को इनक्यूबेट करें, जिसमें 30 मिनट के लिए रोटेशन हो।
- 30 मिनट के लिए रोटेशन के साथ, 35 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.5x एसएससी बफर प्लस 0.5% एसडीएस के साथ फिर से दाग धोएं।
- एक संकरण कवर के अंदर दाग रखें, अतिरिक्त बफर को हटा दें और इसे सील करें।
- इसे एक कैसेट के अंदर रात भर एक विकिरण मुक्त-फॉस्फोर इमेजर स्क्रीन पर बेनकाब करें।
- बायोमॉलिक्यूलर इमेजर का उपयोग करके संकरण संकेत का पता लगाएं और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें।
- 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके दाग पट्टी, 0.5 एक्स एसएससी बफर प्लस 0.1% एसडीएस और 0.1 एक्स एसएससी बफर प्लस 0.1% 30 मिनट के लिए एसडीएस के साथ 30 मिनट के लिए रोटेशन के साथ।
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Representative Results
इस प्रदर्शन में, हमने इंडिका राइस वेर व्हाइटपोनी(चित्रा 1)के विभिन्न ऊतकों में miR397 की अभिव्यक्ति का पता लगाया है और मात्रा निर्धारित की है। miR397 एक 22 nt miRNA और संरक्षित miRNA है । सभी परीक्षण नमूनों में miR397 की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सकता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आंकड़ों के अनुसार, नमूना 1 (अंकुर ऊतक) में 5 रीड्स प्रति मिलियन (आरपीएम) पर miR397 है। हमने इसके संकेत को आराम से पता लगाया, यह दर्शाता है कि विधि बहुत संवेदनशील है और इसका उपयोग बहुत कम प्रचुर मात्रा में मीन्रान का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रयोग में, हमने लोडिंग नियंत्रण के रूप में miR168 और U6 का उपयोग किया है।
इस दाग(चित्रा 1)में, इमेजजे का उपयोग करके संकेतों की ताकत की मात्रा निर्धारित की गई थी। miR397 की अभिव्यक्ति वनस्पति पत्ती म्यान में सबसे अधिक है।
चित्र 1: चावल के नमूनों के विभिन्न ऊतकों में miR397 की अभिव्यक्ति का पता लगाना और मात्राकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| बफर और समाधान | नुस्खा | टिप्पणियाँ |
| 10 एक्स टीबीई | 0.89 M Tris बफर | पीएच को एसिटिक एसिड का उपयोग करके 8.2 पर सेट किया जाना चाहिए |
| 0.89 M बोरिक एसिड | ||
| 30mM EDTA | ||
| जेल मिश्रण | 15% एक्रिलामाइड-बिसाक्रियामाइड सोल, 19:1 | जेल मिक्स में यूरिया क्रिस्टल नहीं होना चाहिए |
| 8M यूरिया | ||
| 1X TBE | ||
| जेल लोडिंग डाई | 0.05% (w/v) ब्रोमोफेनॉल ब्लू | डिवोनाइज्ड फॉर्ममाइड को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए |
| 0.05% (w/v) जाइलीन जायनॉल | ||
| 100% डिएकोनाइज्ड- फॉर्ममाइड | ||
| जांच की लेबलिंग | PNK बफर (10X, 2 माइक्रोल) | इस मिश्रण रेडियोधर्मी अणुओं में शामिल हैं, इस कदम को एक रेडियोधर्मी प्रयोगशाला के अंदर प्रशिक्षित व्यक्तित्व द्वारा किया जाना चाहिए |
| पीएनके एंजाइम (1 माइक्रोल) | ||
| ओलिगो (100 माइक्रोन, 0.1 माइक्रोन) | ||
| ƳP32 एटीपी (4 माइक्रोन) | ||
| वॉश बफर - मैं | 2X एसएससी | |
| 0.5% (w/v) एसडीएस | ||
| वॉश बफर - II | 0.5X एसएससी | |
| 0.5% (w/v) एसडीएस | ||
| बफर अलग करना - मैं | 0.5X एसएससी | |
| 0.1% (w/v) एसडीएस | ||
| बफर अलग करना - II | 0.1X एसएससी | |
| 0.1% (w/v) एसडीएस |
तालिका 1: व्यंजनों की तालिका।
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Discussion
इस विधि का उपयोग कम प्रचुर मात्रा में मीनरों सहित छोटे आरएनए का पता लगाने और मात्राकरण के लिए बड़े पैमाने पर किया जा सकता है। प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एक लोडिंग बफर में कुल आरएनए को विकृत करने, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा आकार जुदाई, आरएनए को झिल्ली में स्थानांतरित करने, आरएनए को झिल्ली पर क्रॉस-लिंक करने और वांछित रेडियोलेबल ओलिगो प्रोब्स का उपयोग करके संकरित करने के लिए कदमों का वर्णन करता है।
किसी भी ब्लॉटिंग प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करने के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए का उपयोग है। जैल लोड करने से पहले, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि नमूने मुफ्त बह रहे हैं और लोडिंग युक्तियों से चिपके नहीं हैं। नमूना लोड करते समय देखभाल की जानी चाहिए, टिप को कुएं के नीचे के ठीक ऊपर डाला जाना चाहिए ताकि नमूना कुएं में एक पतली परत पर कब्जा कर सके। संकरण ओवन का तापमान बहुत कम प्रचुर मात्रा में हैं कि miRNAs का पता लगाने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए। दाग के बार-बार संकरण के लिए, झिल्ली को 2x एसएससी में नम रखकर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
इस विधि का उपयोग पॉलीसैकराइड्स और पॉलीफेनॉल8से समृद्ध ऊतकों से छोटे आरएनए का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, आरएनए नमूनों को ध्यान में रखने के लिए वैक्यूम सुखाने का उपयोग अन्य पुराने तरीकों की तुलना में बेहतर स्थिरता और नमूने की कम हानि प्रदान करता है9। विधि में अन्य संशोधन में इलेक्ट्रो-ट्रांसफर के दौरान 1x एफबीई में डुबकी लगाने से पहले पानी में झिल्ली का प्रसार शामिल है। यह आरएनए हस्तांतरण की दक्षता में सुधार करता है, जो दाग का बेहतर समाधान प्रदान करता है।
विधि की एक प्रमुख सीमा रेडियोआइसोटोप्स का उपयोग है, जिसे संकरण प्रयोगों को करने के लिए प्रशिक्षित कर्मियों और रेडियोआइसोटोप लैब की आवश्यकता होती है। यह विधि यहां miRNAs का पता लगाने के लिए आरएनए दाग विश्लेषण में शामिल सभी चरणों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है । यह प्रोटोकॉल इसके सिग्नल डिटेक्शन10के अलावा छोटे आरएनए के आकार को भी सुनिश्चित करता है । यह तकनीक आणविक जीवविज्ञानियों के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करती है ताकि विभिन्न छोटे आरएनए जैसे मिरना, माध्यमिक सीआरएएनए और स्नोर्ना की बहुतायत का अनुमान लगाया जा सके।
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Disclosures
हितों का कोई टकराव घोषित नहीं ।
Acknowledgments
लेखक रेडियोआइसोटोप के लिए मेजबान संस्थान और ब्रिट द्वारा प्रदान की गई विकिरण प्रयोगशाला तक पहुंच को स्वीकार करते हैं। पीवीएस प्रयोगशाला को नेशनल सेंटर फॉर बायोलॉजिकल साइंसेज, टाटा इंस्टीट्यूट फॉर फंडामेंटल रिसर्च एंड ग्रांट (बीटी/PR12394/AGIII/103/891/2014) द्वारा समर्थित किया जाता है; बीटी/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; भारत सरकार के जैव प्रौद्योगिकी विभाग से बीटी/PR25767/GET/119/151/2017) । सांसद ने डीबीटी-रिसर्च एसोसिएटशिप, डीबीटी, भारत सरकार को स्वीकार किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
