Summary
Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.
Abstract
МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.
Introduction
Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных1. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы5,6.
Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно используемым для обнаружения конкретных молекул РНК. Этот метод настраивает его использование в обнаружении примерно 19 -24 nt длинных малых РНК из пула общего RNAs7. В этой демонстрации мы иллюстрируем использование этого метода для обнаружения и количественной оценки миРНК. Этот метод использует маркировку зондов с использованием радиоизотопов; таким образом, уровни миРНК в образце могут быть обнаружены с повышенной чувствительностью. В отличие от методов на основе ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку экспрессии, а также определение размера miRNAs. В этом протоколе мы показываем важные шаги, которые улучшают обнаружение miRNA. Мы модифицировали шаги в blotting и гибридизации для получения высокого разрешения обнаружения сигнала miRNAs. Этот метод также может быть использован для обнаружения других эндогенных малых РНК, таких как siRNAs, tasi-вторичных РНК и snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление 15% денатурированного полиакриламида гель
- Взвешивать и добавлять 4,8 г мочевины, добавить 3,75 мл 40% акриламида: бисакриламид (19:1) раствор и 1 mL 10x TBE pH 8.2 в стерильную трубку 50 мл.
- Растворите мочевину с помощью водяной ванны, установленной при 60 градусов по Цельсию, в четкий раствор.
- Макияж объема до 10 мЛ с использованием свежеавтонатуренной стерильной воды и охладить гель смесь до комнатной температуры.
- Приготовьте свежий 10% (w/v) раствор аммония персульфата.
2. Сборка стеклянных пластин и электрофорезного блока
- Вымойте весь аппарат, необходимый для геля электрофорез и электро-blotting с моющим средством. Аккуратно скраб их с помощью мягкой губкой, чтобы удалить остаточный буфер и акриламид, промыть водой и дать им высохнуть.
- Соберите оба стеклянные пластины вместе и поместите их твердо на губку. Используйте 1 мм толщиной пластины для этой установки. Убедитесь, что пластины находятся на том же уровне, чтобы избежать утечки.
- К 10 мл геля смеси добавьте 8 МЛ TEMED и 80 мл свежеприготовленного 10% (w/v) раствор аммония.
- Без промедления, аккуратно перемешать и залить это между собранными стеклянными пластинами. Поместите гребень тщательно. Избегайте генерации пузырьков воздуха на этом этапе.
- Разрешить гель полимеризировать в течение примерно 45 мин.
- Вымойте полимеризованный гель с стерильной водой, прежде чем поместить внутри гель работает установки.
- Соберите пластины внутри бегущей кассеты и аккуратно снимите гребень.
- Налейте свежеприготовленные стерильные 1x TBE, рН 8.2 в бак.
- Тщательно вымойте колодцы, трубив буфер для удаления кристаллов соли. Этот шаг помогает образцу РНК работать равномерно через гель.
- Выполните предварительный запуск на 80 V в течение 30 минут.
3. Подготовка погрузочного красителя и образцов
- Для 10 мл гель нагрузки красителя, весить 5 мг бромофено голубого, 5 мг ксилен цианола, добавить 10 мл деионированного формамида тщательно и хорошо перемешать их.
- Aliquot 10 мкг общей РНК в стерильную трубку 1,5 мл и высушите образцы с помощью speedvac. Не переувяхайте образцы.
- Повторное увеличение образцов РНК в 8 мл загрузки.
- Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 2 минут, охладите в течение 1 мин на RT, вихрь и спина образцов, в течение 3 раз. Этот шаг необходим для правильной резусения и, в свою очередь, это помогает в равной загрузке образцов.
4. Гель электрофорез
- Остановить предварительное запуск и вымыть скважины перед загрузкой образца.
- Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 1 мин и загрузите образцы горячими в колодец с помощью капиллярных наконечников. Вставьте кончик на дно колодца, чтобы образец занимал один тонкий слой в колодце.
- Полная загрузка всех образцов. Включите для загрузки маркера десятилетия РНК.
- Выполнить гель на 80 В до бромофенола синий краситель работает почти полностью. Бромофенол синий работает на 10 bp в 15% денатурации акриламид гель.
5. Подготовка к электро-размыву
- Вырежьте НЗюлоновую мембрану до размеров стеклянной пластины и отметьте мембрану в правом верхнем углу карандашом HB.
- Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды, обращенной к обозначенной стороне к поверхности воды. Предварительно замочите мембрану в течение 15 мин.
- Вырезать 4 куска промокания бумаги я в размерах волокна площадку.
- Приготовьте сэндвич с гелем для размещения серой стороны кассеты в чистый лоток.
- Предварительно промокнуть волокна площадку и поместите его на кассету. Удалите пузырьки воздуха.
- Предварительно мокрый один кусок пятно бумаги в 1x TBE и место над волокна площадку. Удалите пузырьки воздуха, прокатки пластиковый пипетки над бумагой. Положите еще один кусок предварительно мокрой промокальной бумаги и удалить пузырьки воздуха.
- Тщательно удалите гель из беговой кассеты и поместите его над сэндвич установки, таким образом, что первый загруженный образец РНК вправо.
- Аккуратно окуните предварительно пропитанную мембрану в 1x TBE и поместите ее на гель, стоящие перед маркированной стороной вниз. Раскатать, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Опустите кусок промокания бумаги, положите его на мембрану и удалите пузырьки воздуха. Dip еще один кусок blotting бумаги, поместите его на сэндвич установки и удалить пузырьки воздуха.
- Заполните сэндвич, поместив предварительно мокрый волокна площадку над установкой и твердо закрыть кассету.
- Поместите трансблот кассету в модуль и заполните 1x TBE, рН 8.2 до знака промокания.
- Трансфер при 10 В, ночь при 4 градусах Цельсия.
- После передачи поместите влажную мембрану на бумажный лист и немедленно перекрещиваем РНК к мембране путем облучения 254-нм УФ-излучением (120 000 юулов/см2). Кросс-связанные помарки, возможно, хранятся при 4 градусов по Цельсию для дальнейшей гибридизации.
6. Подготовка радиомаркированного зонда
- Дизайн зонда, который полностью дополняет небольшой РНК, которая должна быть обнаружена.
- Конец этикетки зонда с использованием ƳP32ATP (получено из BRIT) в конце 5' путем объединения компонентов в соответствии с рецептом, представленным в таблице 1.
- Инкубировать вышеупомянутую реакцию смеси при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
- Отдельные немаркированные ƳP32АТФ от зонда с помощью колонки Sephadex G-25 в соответствии с протоколом производителя.
7. Гибридизация помарки
- Поместите скрещенные связаны пятно, РНК стороны перед верхней внутри бутылки гибридизации.
- Энергично смешайте сверхчувствительный буфер гибридизации, добавьте 10 мл и инкубировать пятно внутри печи гибридизации, поддерживаемой при температуре 35 градусов по Цельсию, с вращением.
- Выполните до гибридизацию в течение 20 мин.
- Выньте бутылку из духовки и аккуратно добавьте маркированный зонд в буфер гибридизации.
- Гибридизируйте помарку при 35 градусов по Цельсию, с вращением на 12 ч.
- После гибридизации тщательно перенесите раствор гибридизации в 15-мл-трубу. Это решение может храниться при 4 градусах цельсия до повторного использования.
- Выполните быструю стирку помарки в течение 2 минут, чтобы удалить избыток решения гибридизации, добавив 2x буфер SSC плюс 0,5% SDS. Откажитесь от решения.
- Инкубировать пятно с 2x буфером SSC плюс 0,5% SDS для 35 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин.
- Вымойте пятно снова с 0,5x SSC буфер плюс 0,5% SDS для 35 "C, с вращением в течение 30 мин.
- Поместите пятно внутри крышки гибридизации, удалите избыточный буфер и запечатайте его.
- Подвергнуть его радиации свободного фосфора изображения экрана на ночь внутри кассеты.
- Обнаружить сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного изображения и проанализировать результаты с помощью подходящего программного обеспечения.
- Полоса пятно путем инкубации его при 80 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин с 0,5 X SSC буфер плюс 0,1% SDS и 0,1 X SSC буфер плюс 0,1% SDS в течение 30 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой демонстрации, мы обнаружили и количественно выражение miR397 в различных тканях риса Indica var whiteponni (Рисунок 1). miR397 является 22 nt miRNA и сохраненной миРНК. Выражение miR397 можно обнаружить во всех проверенных образцах. Согласно данным секвенирования следующего поколения, образец 1 (саженная ткань) имеет miR397 на 5 считываний на миллион (об/мин). Мы обнаружили его сигнал удобно, указывая, что метод является очень чувствительным и может быть использован для обнаружения даже очень низкий обильный miRNAs. В этом эксперименте мы использовали miR168 и U6 в качестве элементов управления погрузкой.
В этом пятно (Рисунок 1), сила сигналов была количественно с помощью ImageJ. Выражение miR397 является самым высоким в вегетативной листовой ошейи.
Рисунок 1: Обнаружение и количественная оценка экспрессии miR397 в различных тканях образцов риса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Буфер и решение | Рецепт | Комментарии |
| 10 X TBE | 0.89M Трис буфер | рН должен быть установлен на 8,2 с использованием уксусной кислоты |
| 0,89M Борная кислота | ||
| 30mM ЭДТА | ||
| Гель микс | 15% акриламид-бисакриламидный соль, 19:1 | Гель смесь не должна содержать кристаллы мочевины |
| 8М мочевины | ||
| 1X TBE | ||
| Гель загрузки красителя | 0.05 %(w/v) бромофенол синий | Следует проявлять осторожность при обработке деионизированного формамида |
| 0,05 %(w/v) Ксилен ксянол | ||
| 100 % деионизированных формамид | ||
| Маркировка зонда | Буфер PNK (10X, 2 л) | Эта смесь содержит радиоактивные молекулы, этот шаг должен быть выполнен обученным персоной внутри радиоактивной лаборатории |
| Фермент PNK (1 мл) | ||
| Олиго (100 мкм, 0,1 л) | ||
| ƳP32 ATP (4 мл) | ||
| Стиральная буфер - Я | 2X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Уош Буфер - II | 0.5X SSC | |
| 0,5% (w/v) SDS | ||
| Зачистка буфер - Я | 0.5X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS | ||
| Зачистка буфера - II | 0.1X SSC | |
| 0,1% (w/v) SDS |
Таблица 1: Таблица рецептов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная связь РНК с мембраной и гибридизация с помощью желаемых радиомаркированных олиго зондов.
Критическим шагом для любого эксперимента по blotting является использование РНК хорошего качества для подготовки образца. Перед загрузкой гелей необходимо убедиться, что образцы свободно текут и не прилипают к погрузочным советам. Уход должен быть принят во время загрузки образца, кончик должен быть вставлен чуть выше нижней части колодца, так что образец занимает один тонкий слой в колодце. Температура печи гибридизации должна быть сохранена на уровне 35 градусов по Цельсию для обнаружения миРНК, которые являются чрезвычайно менее обильными. Для повторной гибридизации помарки, хранить мембрану при 4 градусов по Цельсию, сохраняя его влажным в 2x SSC.
Этот метод может быть использован для обнаружения небольших РНК из тканей, которые богаты полисахаридами и полифенолами8. В этом протоколе использование вакуумной сушки для концентрации образцов РНК обеспечивает лучшую стабильность и меньшую потерю образца по сравнению с другими более старыми методами9. Другие изменения в метод включает в себя, распространение мембраны в воде перед погружением в 1x TBE во время электро-передачи. Это повышает эффективность передачи РНК, обеспечивая лучшее разрешение пятна.
Основным ограничением метода является использование радиоизотопов, которым необходим обученный персонал и радиоизотопная лаборатория для проведения экспериментов по гибридизации. Этот метод здесь предоставляет подробную информацию о всех шагах, участвующих в анализе РНК помарки для обнаружения miRNAs. Этот протокол также обеспечивает размер небольшой РНК, кроме обнаружения сигнала10. Этот метод является надежным инструментом для молекулярных биологов для оценки обилия различных малых РНК, таких как миРНК, вторичные сиРНК и сноРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не декларии.
Acknowledgments
Авторы признают доступ к радиационной лаборатории, предоставленной принимающим институтом и BRIT для радиоизотопа. Лаборатория ПВС поддерживается Национальным центром биологических наук, Институтом фундаментальных исследований и грантов Тата (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) от Департамента биотехнологии, правительство Индии. Депутат признает DBT-исследования ассоциированных, DBT, правительство Индии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
