Summary
Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.
Abstract
MicroRNA'lar (miRNA'lar) hem bitkilerde hem de hayvanlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan endojen olarak ifade edilen kodlamayan, ~21 nt küçük RNA'lar sınıfıdır. MiRNA'ların çoğu, anahtar genleri hedefleyen gen ekspresyonunun negatif anahtarları olarak hareket eder. Bitkilerde, birincil miRNA 'lar (pri-miRNA'lar) transkriptleri RNA polimeraz II tarafından oluşturulur ve pre-miRNA adı verilen kararlı kök-döngü yapılarının değişen uzunluklarını oluştururlar. Bir ensonükleaz, Dicer benzeri1, miRNA-miRNA* dublekslerine pre-miRNA'ları işler. MiRNA-miRNA* dubleks iplikçiklerinden biri seçilir ve hedef mRNA'ların bölünmesine aracılık etmek için Argonaute 1 proteinine veya homologlarına yüklenir. MiRNA'lar anahtar sinyal molekülleri olmasına rağmen, bunların tespiti genellikle hassas bir kuzey leke analizi yerine optimal PCR tabanlı yöntemlerden daha az yöntemle gerçekleştirilir. Biz çok yüksek hassasiyet ile miRNA düzeylerinin sayısallaştırılması için ideal basit, güvenilir ve son derece hassas kuzey yöntemi tarif, kelimenin tam anlamıyla herhangi bir bitki dokusundan. Ayrıca, bu yöntem boyutu, kararlılık ve miRNA ve öncüllerinin bolluğunu onaylamak için kullanılabilir.
Introduction
Küçük düzenleyici RNA'lar, mikroRNA'lar, son keşif onları ve bitki vehayvanlardakirollerini anlamak araştırma yol açmıştır 1 . MiRNA'ların uzun öncüleri HYL1 ve spesifik dicer benzeri proteinler2,3ile 21-24 nt olgun miRNA'lara işlenir. Bir 22 nt miRNA ikincil siRNA'lar4oluşturarak basamaklı susturma başlatabilirsiniz. Çalışmalar gelişme miRNA'lar ve ikincil siRNA'ların rolünü göstermiştir, hücre kaderi ve stres yanıtları5,6.
Kuzey hibridizasyonu belirli RNA moleküllerini tespit etmek için rutin olarak kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntem, toplam RNA7bir havuzdan yaklaşık 19 -24 nt uzun küçük RNA tespitinde kullanımını özelleştirmektedir. Bu gösteride, miRNA'ların saptanması ve ölçülmesi için bu tekniğin kullanımını gösteriyoruz. Bu yöntem, radyoizotoplar kullanarak probların etiketlenmesi kullanır; böylece numunedeki miRNA düzeyleri artan hassasiyetle saptayabilir. PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin nicelemesini ve miRNA'ların boyut tayinini sağlar. Bu protokolde miRNA tespitini geliştiren önemli adımlar gösteriyoruz. MiRNA'ların yüksek çözünürlüklü sinyal algılaması için lekeleme ve hibridizasyon adımlarını değiştirdik. Bu teknik aynı zamanda siRNA, tasi-sekonder RNA ve snoRNA gibi diğer endojen küçük RNA'ların saptanması için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. %15 denaturing poliakrilamid jelin hazırlanması
- Tartmak ve üre 4.8 g ekleyin, % 40 akrilamid 3.75 mL ekleyin: bisacrylamide (19:1) çözeltisi ve 1 mL 10x TBE pH 8.2 steril 50 mL tüp içine.
- 60 °C'de bir su banyosu seti kullanarak üreyi berrak bir çözelti ye doğru çözün.
- Taze otoklavlı steril su kullanarak hacmi 10 mL'ye kadar makyajlayın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun.
- Taze %10 (w/v) amonyum persülfat çözeltisi hazırlayın.
2. Cam plakalar ve elektroforez ünitesinin montajı
- Jel elektroforezi ve elektro-leke için gerekli tüm cihazları deterjanla yıkayın. Yavaşça artık tampon ve akrilamid kaldırmak için yumuşak bir sünger kullanarak ovmak, su ile durulayın ve onları kurumasını bekleyin.
- Her iki cam plakayı bir araya getirin ve süngerin üzerine sıkıca yerleştirin. Bu kurulum için 1 mm kalınlığında bir plaka kullanın. Sızıntıyı önlemek için plakaların aynı seviyede olduğundan emin olun.
- 10 mL jel karışımına 8 μL TEMED ve 80 μL taze hazırlanmış %10 (w/v) amonyum persülfat çözeltisi ekleyin.
- Gecikmeden, yavaşça karıştırın ve monte cam plakalar arasında dökün. Taramayı dikkatlice yerleştirin. Bu adımda hava kabarcıkları üretmekten kaçının.
- Jel yaklaşık 45 dakika polimerize izin verin.
- Jel çalışan kurulum içine yerleştirmeden önce steril su ile polimerize jel yıkayın.
- Plakaları çalışan kasetin içine monte edin ve taramayı nazikçe çıkarın.
- Tankın içine taze hazırlanmış steril 1x TBE, pH 8.2 dökün.
- Tuz kristallerini çıkarmak için tamponboruları borulayarak kuyuları dikkatlice yıkayın. Bu adım, RNA örneğinin jel üzerinde düzgün çalışmasına yardımcı olur.
- 30 dakika boyunca 80 V'de ön çalıştırma yapın.
3. Yükleme boyası ve numunelerinin hazırlanması
- Jel yükleme boya 10 mL için, bromofenol mavi5 mg tartmak, ksilen siyanol 5 mg, dikkatle deiyonize formamid 10 mL ekleyin ve iyice karıştırın.
- Aliquot 10 μg toplam RNA steril 1.5 mL tüp içine ve bir speedvac kullanarak örnekleri kuru. Numuneleri aşırı kurutmayın.
- 8 μL yüklemede RNA örneklerini yeniden askıya alın.
- Numuneleri 98 °C'de 2 dk ısıtın, RT'de 1 dakika serinleyin, girdap ta ve numuneleri 3 kez döndürün. Bu adım uygun geri süspansiyon için gereklidir ve bu da numunelerin eşit yüklenmesine yardımcı olur.
4. Jel elektroforez
- Ön çalıştırmayı durdurun ve numune yüklemesinden önce kuyuları yıkayın.
- Numuneleri 98 °C'de 1 dk ısıtın ve kılcal uçlu uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyuya yükleyin. İpucunu kuyunun dibine yerleştirin, böylece örnek kuyuda ince bir tabaka kaplar.
- Tüm numunelerin tam yüklemesi. RNA onyılı işaretçisini yüklemek için ekleyin.
- Bromofenol mavisi boya neredeyse tamamen çalışana kadar 80 V jel çalıştırın. Bromofenol mavisi 10 bp'de %15 denaturing akrilamid jeli ile çalışır.
5. Elektro-blotting için hazırlık
- N+naylon membranı cam plaka boyutlarına kesin ve sağ üst köşesindeki membranı HB kalemle etiketleyin.
- Membranı steril su yüzeyine hafifçe yerleştirin ve etiketli tarafa su yüzeyine bakacak şekilde yerleştirin. Önceden 15 dakika boyunca membran ıslatın.
- Fiber ped boyutlarına 4 adet lekeleme kağıdı I kesin.
- Kasetin gri tarafını temiz bir tepsiye yerleştirmek için jel sandviçi hazırlayın.
- Önceden lif pedi ısla ve kasetin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları kaldırın.
- Önceden ıslak bir parça blotting kağıt 1x TBE ve fiber ped üzerine yerleştirin. Kağıt üzerinde plastik bir pipet haddeleme hava kabarcıkları çıkarın. Önceden ıslak lekeleme kağıdı başka bir parça lay ve hava kabarcıkları kaldırın.
- Jeli çalışan kasetten dikkatlice çıkarın ve ilk yüklenen RNA numunesinin sağa doğru olması için sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin.
- Önceden ıslatılmış membranı 1x TBE'ye yavaşça batırın ve etiketlenmiş tarafa bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları kaldırmak için dışarı rulo.
- Leke kağıt bir parça daldırma, membran üzerine koymak ve hava kabarcıkları kaldırın. Leke kağıt başka bir parça Daldırma, sandviç kurulum üzerine yerleştirin ve hava kabarcıkları kaldırın.
- Kurulum üzerine önceden ıslak fiber ped yerleştirerek sandviç tamamlayın ve sıkıca kaset kapatın.
- Transblot kasetini modüle yerleştirin ve 1x TBE, pH 8.2'yi lekeleme işaretine kadar doldurun.
- 10 V'de, gece boyunca 4 °C'de aktarın.
- Transferden sonra, nemli membranı bir kağıt levhaüzerine yerleştirin ve 254 nm UV ışığı (120.000 μjoules/cm²) ile ışınlama ile RNA'yı hemen membrana bağlayın. Çapraz bağlı leke belki daha fazla hibridizasyon için 4 °C'de depolanır.
6. Radyoetiketli sonda hazırlanması
- Tespit edilecek küçük RNA'nın tamamen tamamlayıcısı bir sonda tasarlayın.
- Tablo 1'deverilen tarife göre bileşenleri birleştirerek 5' ucunda32ATP (BRIT'den elde edilen) ƳP kullanarak son etiket.
- Yukarıdaki reaksiyon karışımını 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- Üreticiprotokolüne göre sephadex G-25 sütunu kullanarak 32 ATP'denetiketlenmemişƳP ayrı bir şekilde sondadan ayırın.
7. Lekenin hibridizasyonu
- Çapraz bağlı leke, RNA tarafı bir hibridizasyon şişesi içinde üst bakan yerleştirin.
- Ultra hassas hibridizasyon tamponunu şiddetle karıştırın, 10 mL ekleyin ve 35 °C'de tutulan bir hibridizasyon fırınının içine girin.
- 20 dk için ön hibridizasyon gerçekleştirin.
- Şişeyi fırından çıkarın ve etiketli probu hibridizasyon tamponuna hafifçe ekleyin.
- Lekeyi 35 °C'de, 12 saat döndürülür.
- Hibridizasyondan sonra hibridizasyon çözeltisini dikkatlice 15 mL tüpe aktarın. Bu çözelti yeniden kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
- 2x SSC tampon artı% 0.5 SDS ekleyerek aşırı hibridizasyon çözümünü kaldırmak için 2 dakika için leke hızlı bir yıkama gerçekleştirin. Çözümü atın.
- 35 °C için 2x SSC tampon artı %0,5 SDS ile 30 dakika rotasyon ile lekeyi kuluçkaya yatırın.
- Lekeyi 30 dakika boyunca döndürülürken, 35°C için 0,5 x SSC tamponu artı %0,5 SDS ile tekrar yıkayın.
- Lekeyi bir melezleme kapağının içine yerleştirin, fazla arabelleği çıkarın ve kapatın.
- Bir gecede bir kaset içinde radyasyonsuz fosfor görüntüleyici ekrana maruz.
- Biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini algıla ve uygun yazılımları kullanarak sonuçları analiz edin.
- Lekeyi 80 °C'de kuluçkaya yatarak, 30 dakika boyunca 0,5 X SSC tampon artı %0,1 SDS ve %0,1 X SSC tamponu artı 30 dakika için %0,1 SDS ile soyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu gösteride indica rice var whiteponni'nin farklı dokularında miR397 ifadesini tespit ettik ve ölçtük (Şekil 1). miR397 22 nt miRNA ve korunmuş miRNA olduğunu. Test edilen tüm örneklerde miR397 ifadesi saptanabilir. Yeni nesil sıralama verilerine göre, örnek 1 (fide dokusu) milyonda 5 okuma (rpm) miR397'ye sahiptir. Sinyalini rahatça tespit ettik, bu yöntemin çok hassas olduğunu ve çok düşük miktardaki miRNA'ları bile tespit etmek için kullanılabileceğini belirttik. Bu deneyde, yükleme kontrolleri olarak miR168 ve U6'yı kullandık.
Bu lekede(Şekil 1),sinyallerin mukavemeti ImageJ kullanılarak ölçüldü. MiR397 ifadesi vegetatif yaprak kılıfı en yüksektir.
Şekil 1: Pirinç örneklerinin farklı dokularında miR397 ifadesinin saptanması ve ölçülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek ve çözüm | Tarifi | Yorum |
| 10 X TBE | 0.89M Tris tampon | pH asetik asit kullanılarak 8.2 olarak ayarlanmalıdır |
| 0.89M Borik asit | ||
| 30mM EDTA | ||
| Jel karışımı | %15 akrilamid-bisacrylamide sol, 19:1 | Jel karışımı üre kristalleri içermemelidir |
| 8M üre | ||
| 1X TBE | ||
| Jel yükleme boyası | 0.05%(w/v) bromofenol mavisi | Deiyonize formamid kullanılırken dikkatli olunmalıdır |
| 0.05 %(w/v) Ksilen xyanol | ||
| % 100 deiyonize- formamid | ||
| Sondanın etiketlenmesi | PNK arabelleği (10X, 2 μL) | Bu karışım radyoaktif moleküller içerir, bu adım bir radyoaktif laboratuvar içinde eğitimli personel tarafından yapılmalıdır |
| PNK enzimi (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0.1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Yıkama Tampon - I | 2X SSC | |
| %0,5 (w/v) SDS | ||
| Yıkama Tamponu - II | 0.5X SSC | |
| %0,5 (w/v) SDS | ||
| Sıyırma Tampon - I | 0.5X SSC | |
| %0,1 (w/v) SDS | ||
| Sıyırma Tampon - II | 0.1X SSC | |
| %0,1 (w/v) SDS |
Tablo 1: Yemek tarifleri tablosu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, daha az bol miRNA'lar da dahil olmak üzere küçük RNA'ların saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılabilir. Protokol esas olarak bir yükleme tamponunda toplam RNA'nın denatife, jel elektroforezinin boyut ayrımına, RNA'nın bir membrana aktarılmasına, RNA'nın membrana çapraz bağlanmasına ve istenilen radyoetiketli oligo probları kullanılarak hibridize edilmesine yönelik adımları açıklar.
Herhangi bir lekeleme deneyi için kritik adım, numune hazırlama için kaliteli RNA kullanılmasıdır. Jelleri yüklemeden önce, numunelerin serbest akışlı olduğundan ve yükleme ipuçlarına yapışmadığından emin olmak gerekir. Numune yüklenirken dikkatli olunmalı, numunenin kuyuda ince bir tabaka kapabilmesi için uç kuyunun altına hemen yerleştirilmelidir. Son derece daha az bol olan miRNA'ların tespiti için hibridizasyon fırınının sıcaklığı 35 °C'de muhafaza edilmelidir. Lekenin tekrartekrar hibridizasyonu için membranı 2x SSC'de nemli tutarak 4 °C'de saklayın.
Bu yöntem, poliakkaritler ve polifenoller açısından zengin dokulardan küçük RNA'ları tespit etmek için kullanılabilir8. Bu protokolde, konsantre RNA numuneleri için vakum kurutma kullanımı diğer eski yöntemlere göre daha iyi stabilite ve numune kaybı sağlar9. Yöntemdeki diğer değişiklikler, elektro-transfer sırasında 1x TBE daldırma önce suda membran yayılması içerir. Bu, RNA transferinin verimliliğini artırarak lekenin daha iyi çözümünü sağlar.
Yöntemin önemli bir sınırlama radyoizotoplar kullanımı, eğitimli personel ve hibridizasyon deneyleri gerçekleştirmek için bir radyoizotop laboratuvarı ihtiyacı. Bu yöntem burada miRNA'ların tespiti için RNA leke analizinde yer alan tüm adımlarla ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Bu protokol aynı zamanda sinyal algılama10dışında küçük RNA boyutunu sağlar. Bu teknik, moleküler biyologlar için miRNA' lar, ikincil siRNA'lar ve snoRNA'lar gibi çeşitli küçük RNA'ların bolluğunu tahmin etmek için sağlam bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edilemis.
Acknowledgments
Yazarlar radyoizotop için ev sahibi enstitü ve BRIT tarafından sağlanan radyasyon laboratuvarına erişim kabul. PVS laboratuvarı Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi, Tata Temel Araştırma Enstitüsü ve hibeler tarafından desteklenir (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/İsviçre/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden. MP DBT-Araştırma Associateship, DBT, Hindistan Hükümeti kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
