Summary
在这里，我们提供一个协议，从人类诱导多能干细胞（iPSCs）生成体外NMJ。该方法在1个月内可以诱导形态成熟、功能良好的NMJs。由此产生的NMJs可能用于模拟相关疾病、研究病理机制或筛选药物化合物以进行治疗。
Abstract
神经肌肉结 （NMJ） 是一种专门的突触，将运动神经元的运动电位传输到骨骼肌，用于机械运动。NMJ结构的结构影响神经元的功能，肌肉和相互作用。先前的研究已经报告了许多策略，通过共同培养运动神经元和卵管产生NMJ在体外复杂的诱导过程和漫长的培养期，但一直努力重新概括成熟的NMJ形态和功能。我们的体外 NMJ 感应系统是在单一培养皿中区分人类 iPSC 而构建的。通过切换肌原和神经原感应介质进行诱导，生成的NMJ含有突触前和突触后成分，包括运动神经元、骨骼肌和施万细胞在一个月的培养。NMJ的功能测定还表明，乳管收缩可由Ca++ 触发，然后由乙酰胆碱受体（AChR）抑制剂curare抑制，其中刺激信号通过NMJ传输。这种简单而健壮的方法成功地推导出了具有功能连接的 NMJ 的复杂结构。这种体外人类NMJ，其综合结构和功能，在研究病理机制和化合物筛选方面具有广阔的潜力。
Introduction
神经肌肉结（NMJ）是一种专门的突触，将信号从运动神经元传输到骨骼肌，以控制自愿肌肉运动,1，2。此突触由突触前和突触后部分组成。在突触前部分，运动神经元通过外细胞增多从突触囊泡中释放乙酰胆碱（ACh）。ACh从突触囊泡释放，穿过突触裂口，并结合在突触后部分的 AChR，以触发肌肉收缩的动作潜力,3，4。这种微妙结构的任何故障都可能导致NMJ疾病，包括脊髓肌肉萎缩（SMA）、先天性肌无力综合征（CMS）、肌无力（MG）5、6、7等。5,6,7这些疾病极大地损害了患者的生活质量，不幸的是，由于缺乏对病理机制的理解，没有有效的治疗方法。在这项研究中，我们旨在从人类 iPSC 生成体外人类 NMJ，用于精确的疾病建模和治疗化合物筛查。
先前的研究表明，通过联合培养策略在体外产生NMJ的可能性。分别生成运动神经元和骨骼肌管。这两种细胞类型可以从人类或小鼠原组织培养物中产生，或从干细胞8、9、10、11,10,11诱导，然后共同培养为NMJ形成。8,进一步的应用包括将共培养的NMJ合并到微流体3D器件中，并使用光遗传学单元进行可量化的功能测定12，13。12,13然而，这些策略需要很长的培养期，需要努力同时获得NMJ的主要成分，无论是运动神经元还是骨骼肌管。然而，NMJ的另一个重要组成部分，Schwann细胞，不能在这些培养系统中产生。包含 myotube、运动神经元和 Schwann 细胞的先进培养系统是可取的，因为它可以为 NMJ 研究提供可靠而可靠的模型。
myogenic分化1（MYOD1）是众所周知的致病性调节器14。应用 MYOD1 将 iPSC 驱动到肌管的高效肌生成分化方法在先前的研究中被构建。因此，我们在 iPSCs15中过度表达 MYOD1 诱导肌管，并显示出肌生成分化的高效率。有趣的是，神经元细胞在第10天之后自发地与 myotube 一起出现。神经元细胞在原生培养中的出现，促使我们开发在单一培养皿中生成体外NMJ的策略。在这里，我们提供一种策略，通过在同一培养皿中过度表达人类 iPSC 中的 MYOD1 来生成 NMJs。运动神经元由多种神经营养因子（GDNF、BDNF、NT3等）自发诱导8，同时，施万细胞也可以诱导16，17。,17通过脑管、运动神经元和施万细胞之间的相互作用，成熟的NMJ形成18。该方法能有效地生成功能NMJ，使病理机制和治疗化合物筛查的潜在研究。
Protocol
1. 制备细胞外基质 （ECM）涂层板
- 将 ECM（参见 材料表）与冰冷 1x PBS 稀释至最终浓度为 2%。
- 在 50 mL 塑料管中将 1 mL 的 ECM 添加到 49 mL 的 1x PBS 中。通过上下多次移液，混合均好。
- 将 1 个盖玻片放入 6 井板的每个井中。在每个井中加入 1.5 mL 的 2% ECM。
- 在 37 °C 下用 2% ECM 孵育井板 2 小时。
- 从井板中吸出 ECM，并在使用前将板存放在 4°C。
2. iPSC 对 NMJ 的分化
- 种子 4 x 105 的 iPSC 每井在 6 井板准备在第 1 节。确保将预沉积在井中的盖玻片上的细胞播种。
注：在这项研究中，201B7MYOD iPS细胞系，从樱井博士的实验室的礼物，使用了15。- 从 6 厘米培养盘上的 iPSC 上取下介质，用 1x PBS 清洗 iPCs 一次。
- 将1 mL的细胞分离溶液加入到盘中，在37°C下孵育10分钟。
- 将3 mL的灵长类胚胎茎（ES）细胞培养素加入培养皿，轻轻移液器3次。
- 将包含分离的 iPSC 的上一代收集到 50 mL 塑料管中，并在 4 °C 下以 160 x g 的离心机进行 5 分钟。
- 小心吸上清液，用 10 μM Y27632 在 3 mL 灵长类 ES 细胞培养中重新暂停 iPSCs，并使用血细胞计计算细胞数。
- 使用灵长类 ES 细胞培养基和 10 μM Y27632 稀释 iPSC，浓度为 2 x 105 细胞 /mL。在第 1 节所述的井中预沉积的盖玻片上添加 2 mL 的 iPCC。
- 将 iPSC 感应到 NMJ
- 在第1天，24小时后，种子的 iPSCs 到6井板，删除培养基，并替换为2 mL的新鲜灵长类ES细胞介质含有1μg/mL多氧环素到每个井。
- 用含有1微克/mL多氧环素（最终浓度）的2 mL的介质（MDM）（表1）改变介质。每天刷新媒体从第2天到第10天。
- 从第11天开始，将NMJ介质的介质切换到2mL（表1）到每一个井。刷新介质每 3\u20124 天后，直到第 30 天。
- 在第 30 天通过相位倒置显微镜观察分化的 NMJ。NMJ 可用于以下分析。
3. 免疫荧光 （IF） 染色
- 第30天，从6井板块中吸出培养媒介。在室温下，将 2 mL 的 4% 半甲醛添加到每一个井中 30 分钟，从而修复 NMJ 培养物。
- 将 2 mL 的 1x PBS 添加到每个井中（每次洗涤 3 分钟），将样品洗净 3 次。
- 用0.1%的三顿/PBS对样品进行渗透，10分钟。
- 重复步骤 3.2。
- 在室温下用 0.5% BSA 将样品块住 1 小时。
- 重复步骤 3.2。
- 在4°C下用原抗体孵育样品过夜。抗体的稀释如下：岛1（1μg/mL），硫辛重链（MYH）（1/300），神经丝（NF）（1微克/mL），S-100 （1/300），突触囊泡蛋白2 （SV2） （1 μg/mL），Tuj1 （1/1000）。
- 重复步骤 3.2。
- 在室温下用二次抗体孵育样品1小时。使用的二级抗体浓度如下：抗小鼠IgG 488偶联（0.1μg/mL），抗兔IgG 488偶联（0.1微克/mL）。
- 重复步骤 3.2。
- 用 aBTX-647 （0.5 μg/mL） 孵育样品，用于 AChR 染色，用 DAPI（1 μg/mL）孵育样品，用于核染色。
- 重复步骤 3.2。
- 从 6 井板中拿起一对钳子，将其安装在显微镜幻灯片上 50% 甘油/PBS 溶液中。
4. 扫描电子显微镜 （SEM）
- 在室温下用0.1M磷酸钾缓冲液中准备4%的甲状甲醛和1%的谷胱甘肽修复NMJ培养物，使用1小时。
- 在室温下（每次洗涤10分钟），将样品浸入0.1 M磷酸钾缓冲液中，将样品洗涤3次。
- 用乙醇浓度上升（50%、70%、90%、95%和100%两次）使样品脱水。将样品浸入每个乙醇浓度中10分钟。
- 用临界点干燥机（-30 °C，0.1 Torr）干燥样品。
- 用 Pt （铂金） 离子涂布机 （30 mA 3 分钟; Pt 的厚度约为 20 nm） 涂覆样品。
- 在 5 kV 下通过 SEM 观察样品。
5. 传输电子显微镜 （TEM）
- 使用细胞刮刀从 NMJ 培养板中采集组织。用剃须刀刀片和凝胶将组织形状成小颗粒（3 mm 3），形成凝胶包裹的碎片。将凝胶包裹的片件与2%的半成醛和2%的谷胱甘肽在4°C的磷酸钾缓冲液中过夜。
- 将样品浸入0.1 M磷酸钾缓冲液（每次洗涤15分钟）中，将样品浸入3次。
- 在室温下用双精馏 H2O 中准备的 1% 三氧化二氮的样品进行后修复 1 小时。
注意：此步骤必须在化学罩中完成。 - 重复步骤 5.2。
- 用乙醇浓度上升（50%、70%、90%、95%和100%两次）使样品脱水。将样品浸入每个乙醇浓度中10分钟。
- 吸气100%乙醇。将环氧树脂的容积比渗透到100%乙醇混合物（1：3、1：1和3：1）的样品中。在室温下，以 10 rpm 轻轻搅拌每个混合物 1 小时。
- 用纯环氧树脂代替环氧乙醇混合物，在室温下以 10 rpm 轻轻搅拌 4 小时。
- 4 小时后，用新鲜的环氧树脂刷新环氧树脂，并在室温下以 10 rpm 的转速轻轻搅拌。
- 将样品嵌入胶囊中，用新鲜的环氧树脂，在65°C的烤箱中固化样品。
- 超微切除术
- 在解剖显微镜下粗体修剪样品块，以的正确方向。
- 在超微体上用玻璃刀微调粗剪块，以获得光滑的表面。
- 用钻石刀从修剪良好的方块中准备 70 nm 超薄部分。使用 200 个网状碳型涂层铜网格检索超薄部分。
- 染色含有饱和醋酸化液的网格的超薄部分，用双蒸馏 H2O 准备 30 分钟，用双蒸馏 H2O（每次洗涤 10 分钟）清洗网格 3 次。
- 此外，将超薄部分与雷诺的铅柠檬酸盐19 （2.5%） 对比5分钟，用煮沸的H2O预冷至室温洗涤3次（每次洗涤10分钟）。在染色区域周围放几个氢氧化钠颗粒，以防止部分出现 二氧化碳沉淀。
- 观察 TEM 在 70 kV 的超薄部分。
6. 肌肉收缩和治疗
- 要触发 myotube 收缩，请在第 2.3 步中的培养基中添加 25 mM CaCl2。 可以在1\u20122分钟内观察到 myotube 的移动。
- 将 6 井板放在倒置显微镜的舞台上。通过活细胞显微镜录制一部 myotube 收缩电影。
- 要停止乳管收缩，请向培养基（300 ng/mL）添加咖干。然后将影片录制为步骤 6.2。
- 使用运动矢量分析软件打开影片文件，然后单击 "运动分析 "按钮分析影片。
注：myotube 收缩显示为时动图形。电影是彩色编码，以显示 myotube 的移动速度。颜色编码的火花信号指示 myotube 的移动，其中红色显示最快的移动速度，蓝色显示最慢的移动速度。
Representative Results
使用我们的分化策略，该培养在 30 天显示了 NMJ 的突触前和后突触分量。NMJ成分在一个井中诱导和发育良好，其形态和在NMJ中的位置通过 IF 显微镜（图1）得到证明。图1A 中的流程图总结了 NMJ 分化进展的时间过程。神经丝（NF）、突触囊泡（SV2）和 AChR（图Figure 11B，C）的染色表示神经元。NF 和 SV2 的单染色图像显示在补充图 1 中。α-bungarotoxin 染色表示 ACHR （图 1C） 。合并的图像显示了在 NMJ 中运动神经元和 AChR 的相对位置（图 1D，E）。第二组 IF 染色表示运动神经元由 Tuj1 和岛 1 （图 1G，H）和后突触性 myotube 由 myosin 重链 （图 1I）.施万细胞在NMJ培养中也标有S-100抗体（补充图2）。
为了进一步确认NMJ组件的身份，我们使用SEM进行详细的形态分析。成熟的NMJ形态与扩展轴孔终端，轴龙和肌肉纤维如图2A，B所示。TEM 被执行，以揭示NMJ组件的成熟超结构，包括突触囊泡前突触轴突终端和后突触部分，这是由突触裂口分离（图2C\u2012E）。交汇点折叠由黄色虚线表示，该虚线标记神经元和肌肉纤维的交汇点（图 2C）。包含突触囊泡的成熟轴突终端如图2D、E（黄色箭头）Figure 2D所示。形态学结果表明，NMJ成分诱导良好，成熟。
为了评估体外NMJ的功能，我们用CaCl2 刺激运动神经元以触发 myotube 收缩，从而进行运动分析。结果表明，Ca2+ 可触发肌肉收缩。收缩可能由库拉雷打断。NMJ显示突出的运动信号，随着治疗而消失（图3）。此效果确认运动神经元信号通过 NMJ 传输以触发肌肉收缩。综合起来，IF显微镜、SEM 和 TEM 数据展示了上述协议生成的体外 NMJ 中 NMJ 组件的空间分布、形态和成熟度。运动分析验证了体外NMJ的功能，这意味着它的潜在应用，以制定治疗策略。
图1：NMJ感应流程图和NMJ培养的 IF 图像。（A） NMJ分化进展的流程图。（B+u2012F）检测NMJ成分、神经丝（NF）、突触囊泡（SV2）和 AChR。面板 D 中的白色箭头表示 NMJ。（G+u2012K）NMJ 的突触前和后突触分量。Tuj1 和 Islet1 表示运动神经元，而 myosin 重链 （MYH） 表示 myotube。a - btx， 阿尔法 - 邦加罗毒素。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：成熟NMJ的SEM和TEM图像。（A） NMJ组件的空间分布显示固定在肌肉纤维 （Mf） 表面上的轴孔端子。（B） NMJ 的放大倍率越高，显示轴子端子。（C） 成熟的 NMJ 的超结构，具有突触前轴突（红色箭头）和突触囊泡（Sv）、突触裂解（Sc）和突触后部分（红色箭头）。交汇点折叠 （jf） 由黄色虚线指示。斧头，斧头（D， E）高放大图像显示轴突终端（黄色箭头）中的突触囊泡。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：体外NMJ的 Myotubes 收缩分析。用 25 mM CaCl 2 溶液 （绿线）触发了 Myotube 收缩。用咖色（黄线）治疗后，收缩被抑制。也请参阅补充电影1和补充电影2。请单击此处查看此图的较大版本。
补充电影1：由Ca++ 触发的myotube 收缩。请点击这里下载此视频。
补充电影2：在治疗后，乳管的收缩要弱得多。请点击这里下载此视频。
补充图1：NMJ培养中神经丝（NF，白箭头）的单染色图像。 NMJ 培养中突触囊泡（SV2，白色箭头）的单染色图像。 请点击这里下载此图。
补充图2：在NMJ培养中由S-100抗体标记的Schwann细胞。请点击这里下载此图。
| 致突变分化介质（MDM） | 梅姆阿尔法 | 500mL |
| 100mm 2-ME | 1117μL | |
| 多西环素 | 1μg/mL | |
| Ksr | 56mL （最终到 10%） | |
| 笔/笔 | 2.5mL | |
| 总 | 560mL | |
| 100mM 2-甲醇 | 2-甲醇 | 7μL |
| d.d. 水 | 993μL | |
| 总 | 1000μL | |
| NMJ 介质 | 神经基础介质 （NB） | 500mL |
| B27 | 1 倍 （库存在 50 倍） | |
| Bdnf | 10ng/mL | |
| Gdnf | 10ng/mL | |
| N2 | 1x （库存在 100 倍） | |
| NT3 | 10ng/mL | |
| 笔/笔 | 2.5mL | |
表1：介质公式。
Discussion
先前的研究已经报告了NMJ形成的方法，用复杂的方法，需要长期培养88，10，12，13，20。,10,12,13,20这些成就引领体外NMJ的进步。然而，复杂的方法阻碍了NMJ研究的获取。我们的协议避免了共同培养，在单个井中高效、有力地生成 NMJ。在我们的诱导系统中观察到NMJ中的三种细胞类型，包括脑管、运动神经元和Schwann细胞18。此外，验证了成熟的形态和功能。
根据我们先前的研究，初始细胞密度是NMJ形成的关键因素，不同的细胞密度在培养基18中诱导不同数量的NMJ。低细胞密度（< 1 x 104/cm2）导致神经元数量减少，不利于NMJ的形成。虽然需要更多的时间和资源来准备更高的细胞密度（> 1 x 105/cm2），我们建议细胞密度在1.5 x 104/cm2 和5 x 104/cm2 之间使用我们的协议。该协议产生的NMJ是一种异质组织，具有多种细胞类型，更接近于模拟生理条件。发现在培养皿上均匀分布的 myotube，但运动神经元随机出现，这种现象导致 NMJ 在培养中分布不均匀。此 NMJ 适用于定性研究，而不是需要均匀培养系统的分析。我们还使用其他单元格系 eq.、H9（ES 细胞系）18 和 A11（iPS 单元系，未显示的数据）通过该协议生成 NMJ。NMJ可以在形态和功能上成功生成。然而，培养条件需要针对不同的细胞系进行优化。
化学触发的 myotube 收缩和咖干依赖抑制证实我们的体外 NMJ 是功能性的，并可能应用于实际检测。自发的肌肉收缩在3\u20124周的培养中随机观察到，但可以通过将培养时间延长到两个月18来避免。
已经发布了各种策略，用于生成不同成熟阶段的体外NMJ，但我们系统中产生的体外NMJ显示出显著的成熟度，因为我们可以观察到伽玛在培养18期间向阿查的epilon亚单位的过渡。成熟度是体外NMJ21疾病建模的一个重要考虑因素。总之，具有集成结构成分、成熟度和功能的体外NMJ具有潜在的治疗开发用途。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢樱井博士提供201B7MYOD。电子显微镜研究由冈本富田和科达（京都大学医学研究生院电子显微研究中心电子显微镜研究部）支持。单克隆抗体由HHMI/哥伦比亚大学开发，由美国国家卫生研究院儿童健康和人类发展研究所创建的发展研究杂交瘤库获得，并保留在爱荷华大学生物系。我们还感谢大岛时史郎、中川嘉二郎和松井爱一进行运动向量分析。这项工作得到了日本科学促进协会KAKENHI的资助，赠款号16H05352和20H03642（给MKS）;iPS细胞研究基金（至CYL和MKS）;莫奇达医学和药物研究纪念基金会（至MKS）;武田科学基金会（TO MKS）;以及利用疾病特异性 iPS 细胞的棘手疾病研究计划赠款，该资助由日本医学研究开发机构 （17935400 到 CYL 和 MKS， 17935423 到 MKS） 提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
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