Summary
Her leverer vi en protokol til at generere in vitro NMJs fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Denne metode kan fremkalde NMJs med modne morfologi og funktion i 1 måned i en enkelt brønd. De resulterende NMJs kunne potentielt bruges til at modellere relaterede sygdomme, til at studere patologiske mekanismer eller til at screene lægemiddelforbindelser til behandling.
Abstract
Den neuromuskulære krydset (NMJ) er en specialiseret synapse, der overfører handling potentialer fra motoren neuron til skeletmuskulatur for mekanisk bevægelse. Arkitekturen i NMJ struktur påvirker funktionerne i neuron, musklen og den gensidige interaktion. Tidligere undersøgelser har rapporteret mange strategier ved co-culturing de motoriske neuroner og myotubes til at generere NMJ in vitro med komplekse induktion proces og lang kultur periode, men har kæmpet for at opsummere modne NMJ morfologi og funktion. Vores in vitro NMJ induktionssystem er konstrueret ved at differentiere menneskelig iPSC i en enkelt kulturskål. Ved at skifte myogene og neurogene induktionsmedium til induktion indeholdt den resulterende NMJ præ- og postsynaptiske komponenter, herunder motorneuroner, skeletmuskulatur og Schwann-celler i en måneds kulturen. Den funktionelle analyse af NMJ viste også, at myotubes sammentrækning kan udløses af Ca++ derefter hæmmet af curare, en acetylcholin receptor (AChR) hæmmer, hvor stimulerende signal overføres gennem NMJ. Denne enkle og robuste tilgang med succes afledt den komplekse struktur af NMJ med funktionelle tilslutningsmuligheder. Denne in vitro menneskelige NMJ, med sine integrerede strukturer og funktion, har lovende potentiale for at studere patologiske mekanismer og sammensatte screening.
Introduction
Den neuromuskulære krydset (NMJ) er en specialiseret synapse, der sender signaler fra motoriske neuroner til skeletmuskulatur til at styre frivilligemuskelbevægelser 1,2. Denne synapse består af præ- og post-synaptiske dele. I den præ-synaptiske del frigiver den motoriske neuron acetylcholin (ACh) fra synaptiske vesikler ved exocytose. ACh er frigivet fra synaptiske vesikler til at krydse den synaptiske kløft og til at binde sig til AChR på post-synaptic del til at udløse en handling potentiale for muskelsammentrækning3,4. Enhver fejl i denne delikate struktur kan forårsage NMJ sygdomme, herunder spinal muskelatrofi (SMA), medfødt myasthenic syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG)5,6,,7,osv. Disse sygdomme i høj grad skader kvaliteten af patienternes liv og desværre har ingen effektive behandling tilgange på grund af manglende forståelse for den patologiske mekanisme. I denne undersøgelse, Vi havde til formål at generere in vitro menneskelige NMJ fra menneskelige iPSCs for nøjagtig sygdom modellering og for terapeutiske forbindelser screening.
Tidligere undersøgelser har vist muligheden for at generere in vitro NMJ ved co-kultur strategier. De motoriske neuroner og skelet myotubes genereres henholdsvis. De to celletyper kan genereres fra humane eller mus primære væv kulturer eller induceres fra stamceller8,,9,10,11 ogderefter co-dyrket for NMJ dannelse. De yderligere anvendelser omfatter sammenlægning af co-kultiverede NMJ i microfluidic 3D-enheder og til at anvende optogenetiske enheder til kvantificerbare funktionelle analyser12,13. Men disse strategier tager en lang kultur periode og kræver kamp for at opnå de primære komponenter i NMJ, enten motor neuron eller skelet myotube samtidigt. Endnu en vigtig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan ikke genereres i disse kultursystemer. Den avancerede kultur system, der indeholder myotube, motor neuron og Schwann celle er ønskeligt, da det kan tilbyde en pålidelig og robust model for NMJ undersøgelser.
Myogen differentiering 1 (MYOD1) er en velkendt myogen regulator for myogenese14. Den effektive myogen differentieringsmetode, som anvendte MYOD1 til at køre iPSC ind i myotubes, blev bygget i en tidligere undersøgelse15. Derfor har vi induceret myotubes ved overexpressing MYOD1 i iPSCs15, og høj effektivitet af myogen differentiering blev vist. Interessant, neuron celler dukkede sammen med myotubes spontant efter dag 10. Fremkomsten af neuronceller i myogen kultur har fået os til at udvikle strategien for at generere in vitro NMJ i en enkelt skål. Her tilbyder vi en strategi for at generere NMJs ved at overexpresse MYOD1 i menneskelige iPSCs for myogenic og motor neuron induktion i samme kultur parabol. De motoriske neuroner induceres spontant med flere neurotrofiske faktorer (GDNF, BDNF, NT3, osv.) 8, og i mellemtiden kan Schwann celler også induceres16,17. Gennem samspillet mellem myotubes, motor neuroner og Schwann celler, den modne NMJ dannes18. Denne metode kan generere funktionelle NMJ effektivt, gør det muligt for den potentielle undersøgelse af patologiske mekanismer og terapeutisk sammensatte screening.
Protocol
1. Klargøring af ekstracellulære matrixplader (ECM)-belagte plader
- ECM (se Materialetabel)fortyndes med iskold 1x PBS til en endelig koncentration på 2%.
- Der tilsættes 1 ml ECM til 49 ml 1x PBS i et 50 ml plastrør. Bland godt ved pipettering op og ned flere gange.
- Placer 1 coverslip i hver brønd af en 6-brønd plade. Der tilsættes 1,5 ml 2% ECM i hver brønd.
- Indkube brøndpladen med 2% ECM i 2 timer ved 37 °C.
- Aspirat ECM fra brøndpladen og opbevar pladen ved 4 °C før brug.
2. Differentiering af iPSCs mod NMJ
- Frø 4 x 105 iPSCs pr brønd på 6-brøndpladen tilberedt i afsnit 1. Sørg for at frø cellerne på coverslip pre-deponeret i brønden.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 201B7MYOD iPS cellelinje, en gave fra Dr. Sakurai's Lab, brugt15.- Fjern mediet fra iPSCs på 6 cm kulturskålen, og vask iPSCs én gang med 1x PBS.
- Der tilsættes 1 ml celleløsning til skålen og inkuberes i 10 min. ved 37 °C.
- Tilsæt 3 ml primat embryonale stængel (ES) cellemedium til skålen og pipette 3 gange forsigtigt.
- Supernatanten, som indeholder fritliggende iPSC'er, opsamls i et 50 ml plastrør og centrifuge ved 160 x g ved 4 °C i 5 min.
- Inspirer forsigtigt supernatanten, opslæmm i iPSCs i 3 ml primat ES cellemed 10 μM Y27632, og tæl cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
- IPC'erne fortyndes med primat ES-cellemedium og 10 μM Y27632 til en koncentration på 2 x 105 celler/ml. Tilføj 2 ml iPSCs på dækslæderne, der er deponeret i brønden, og som er beskrevet i afsnit 1.
- Induktion af iPSCs til NMJ
- På dag 1, 24 timer efter såning af iPSCs til 6-brøndpladen, fjernes kulturmediet og erstattes med 2 ml frisk primat ES-cellemedium indeholdende 1 μg/ml doxycyclin til hver brønd.
- Mediet med 2 ml myogen differentieringsmedium (MDM) (tabel 1) indeholdende 1 μg/ml doxycyclin (endelig koncentration) til hver brønd. Genopfrisk mediet hver dag fra dag 2 til dag 10.
- Fra dag 11 skal mediet skiftes til 2 ml NMJ-medium (tabel 1) til hver brønd. Opdater mediet hver 3\u20124 dage derefter indtil dag 30.
- Overhold den differentierede NMJ efter fase inverteret mikroskopi på dag 30. NMJ kan anvendes til følgende analyse.
3. Immunfluorescens (HVIS) farvning
- På dag 30 aspirere kulturmediet fra 6-brøndspladen. Fastgør NMJ kultur ved at tilføje 2 ml 4% paraformaldehyd til hver brønd i 30 min ved stuetemperatur.
- Prøverne vaskes 3 gange ved at tilsætte 2 ml 1x PBS til hver brønd (3 min. for hver vask).
- Permeabilize prøverne med 0,1% Triton/ PBS i 10 min.
- Gentag trin 3.2.
- Prøven med 0,5% BSA i 1 time ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.2.
- Prøverne inkuberes med de primære antistoffer ved 4 °C natten over. Fortyndingen af antistoffer er som følger: Islet 1 (1 μg/ml), myosintunge kæde (MYH) (1/300), neurofilamenter (NF) (1 μg// mL), S-100 (1/300), synaptisk vesicleprotein 2 (SV2) (1 μg/ml), Tuj1 (1/1000).
- Gentag trin 3.2.
- Prøverne inkuberes med de sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Koncentrationen af de sekundære anvendte antistoffer er som følger: antimuse-IgG 488 konjugeret (0,1 μg/ml), antikanin-IgG 488 konjugeret (0,1 μg/ml).
- Gentag trin 3.2.
- Prøverne inkuberes med aBTX-647 (0,5 μg/ml) for AChR-farvning og med DAPI (1 μg/ml) for kernefarvning.
- Gentag trin 3.2.
- Tag dækslækkeren op med et par kraftang fra 6-brøndpladen, og monter den i 50% glycerol/PBS-opløsning på et mikroskopslid.
4. Scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Fix NMJ kultur med 4% paraformaldehyd og 1% glutaraldehyd fremstillet i 0,1 M kaliumphosphat buffer ved stuetemperatur i 1 time.
- Prøverne vaskes 3 gange ved at nedsænke dem i 0,1 M kaliumphosphatbuffer ved stuetemperatur (10 min. for hver vask).
- Dehydrer prøverne med stigende koncentrationer af ethanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100% to gange). Prøverne nedsænkes i hver ethanolkoncentration i 10 minutter.
- Prøverne tørres med en kritisk punkttørrer (-30 °C, 0,1 Torr).
- Coat prøverne med Pt (platin) ion coater (30 mA i 3 min; tykkelse af Pt er omkring 20 nm).
- Overhold prøverne ved SEM ved 5 kV.
5. Transmission elektron mikroskopi (TEM)
- Brug en celleskraber til at høste vævet fra NMJ-kulturpladen. Form vævet til en lille pellet (3 mm3)med et barberblad og lim ved gelering til at danne en gel-indpakket stykke. Det gelindpakkede stykke bestemmes med 2 % paraformaldehyd og 2 % glutaraldehyd fremstillet i 0,1 M kaliumphosphatbuffer ved 4 °C natten over.
- Prøverne vaskes 3 gange ved at nedsænke dem i 0,1 M kaliumphosphatbuffer (15 min. for hver vask) ved stuetemperatur.
- Prøverne anbringes efter 1% osmium tetroxid fremstillet i dobbeltdestilleret H2O i 1 time ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: Dette trin skal udføres i en kemisk hætte. - Gentag trin 5.2.
- Dehydrer prøverne med stigende koncentrationer af ethanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100% to gange). Prøverne nedsænkes i hver ethanolkoncentration i 10 minutter.
- Aspirate 100% ethanol. Infiltrere prøverne med stigende volumenforhold af epoxy harpiks til 100% ethanol blandinger (1:3, 1:1 og 3:1). Omrør hver blanding forsigtigt ved 10 omdrejninger i 1 time ved stuetemperatur.
- Epoxy-ethanol blandingen med ren epoxy harpiks og omrør forsigtigt ved 10 rpm i 4 timer ved stuetemperatur.
- Efter 4 timer skal epoxy harpiksen opdateres med frisk epoxy harpiks og omrøres forsigtigt ved 10 omdr./min. natten over ved stuetemperatur.
- Proeverne integreres i indlejringskapsler med frisk epoxy harpiks, og prøverne hærdes i en ovn ved 65 °C natten over.
- Ultramikrotomi
- Trim prøveblokkene groft under et dissekerende mikroskop for at få den korrekte retning.
- Trim de groft trimmede blokke fint med en glaskniv på en ultramæt for at opnå glatte overflader.
- Forbered 70 nm ultratynde sektioner fra de godt trimmede blokke med en diamantkniv. Hent de ultratynde sektioner med 200 mesh carbon-formvar-belagt kobber gitre.
- De ultratynde sektioner, der indeholder gitre med mættet uranylacetat fremstillet i dobbeltdestilleret H2O i 30 minutter, og gitteret vaskes 3 gange med dobbelt destilleret H2O (10 min. for hver vask).
- Kontrast desuden de ultratynde sektioner med Reynolds blycitrat19 (2,5%) i 5 min. og vaskes med kogt H2O forkølet til stuetemperatur 3 gange (10 min. for hver vask). Sæt flere natriumhydroxidpiller rundt om farvningsområdet for at forhindre CO 2-udfældning på sektionerne.2
- Overhold de ultratynde sektioner ved TEM ved 70 kV.
6. Muskelsammentrækning og kurare behandling
- For at udløse myotube sammentrækning, tilføje 25 mM CaCl2 i kulturmediet i trin 2.3. Bevægelsen af myotubes kan observeres i 1\u20122 min.
- Placer 6-brøndpladen på scenen af et omvendt mikroskop. Optag en film af myotube sammentrækning af levende celle mikroskopi.
- For at stoppe myotube sammentrækning, tilføje curare til kulturmediet (300 ng / ml). Optag derefter filmen som trin 6.2.
- Åbn filmfilen med bevægelsesvektoranalysesoftware, og klik derefter på knappen Bevægelsesanalyse for at analysere filmen.
BEMÆRK: Den myotubes sammentrækning er vist som tid-motion grafik. Filmene er farvekodede for at vise myotubes bevægelseshastighed. De farvekodede sparkly signaler angiver bevægelser myorør, hvor den røde farve viser den hurtigste bevægelseshastighed og blå farve viser den langsomste bevægelseshastighed.
Representative Results
Ved hjælp af vores differentieringsstrategi viste kulturen præ- og post-synaptiske komponenter i NMJ på dag 30. NMJ-komponenterne blev induceret og veludviklet i en enkelt brønd, og deres morfologi og placering i NMJ blev påvist ved IF-mikroskopi (figur 1). Rutediagrammet i figur 1A opsummerer tidsforløbet for NMJ-differentieringsprogressionen. Farvning af neurofilamenter (NF), synaptiske vesikler (SV2) og AChR (Figur 1B,C)angiver neuronerne. Enkeltfarlige billeder af NF og SV2 er vist i supplerende figur 1. Alfa-bungarotoxin farvning angiver AChR (Figur 1C). Det fusionerede billede viser de relative placeringer af en motorneurn og AChR i NMJ (Figur 1D,E). Det andet sæt af IF farvning angiver motor neuron af Tuj1 og Islet 1 (Figur 1G, H) og post-synaptic myotubes af myosin tunge kæde ( Figur1I). Schwann-cellerne blev også mærket af S-100-antistoffet i NMJ-kulturen (supplerende figur 2).
For yderligere at bekræfte identiteten af NMJ komponenter, vi brugte SEM til detaljeret morfologisk analyse. Ældre NMJ morfologi med ekspanderet axon terminaler, axoner og muskelfibre er vist i figur 2A,B. TEM blev udført for at afsløre den modne ultrastruktur af NMJ komponenter, herunder præ-synaptisk akkson terminal med synaptiske vesikler og post-synaptic del, som er adskilt af den synaptiske kløft (Figur 2C \u2012E). Junctional folder er angivet med den gule stiplede-line, som markerer krydset af neuron og muskelfibre (Figur 2C). De modne aksler, der indeholder synaptiske vesikler, vises i figur 2D,E (gule pile). De morfologiske resultater viser, at NMJ-komponenterne var godt induceret og modnet.
For at evaluere funktionen af in vitro NMJ udførte vi bevægelsesanalyse ved at stimulere den motoriske neuron med CaCl2 for at udløse myotubesammentrækninger. Resultaterne viste, at Ca2 + kan udløse muskelsammentrækninger. Sammentrækningerne kan afbrydes af curare. NMJ viste fremtrædende bevægelsessignaler, der forsvandt med curare behandling (Figur 3). Denne effekt bekræfter, at de motoriske neuron signaler blev sendt gennem NMJ at udløse muskelsammentrækning. Samlet set viste IF-mikroskopi-, SEM- og TEM-data den rumlige fordeling, morfologi og modenhed af NMJ-komponenterne i in vitro NMJ, der genereres af den ovenfor beskrevne protokol. Motion analyse valideret funktionen af in vitro NMJ, hvilket indebærer dens potentielle anvendelse til udvikling af terapeutiske strategier.
Figur 1: Flowdiagram for NMJ induktion og HVIS billeder af NMJ kultur. (A) Et rutediagram for NMJ-differentieringsprogressionen. (B\u2012F) Påvisning af NMJ-komponenter, neurofilamenter (NF), synaptiske vesikler (SV2) og AChR. De hvide pile i panel D angiver NMJ. (G\u2012K) Præ- og post-synaptiske komponenter i NMJ. Tuj1 og Islet1 angiver den motoriske neuron, og myosin tunge kæde (MYH) angiver myotube. a-BTX, alfa-bungarotoxin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SEM- og TEM-billeder af moden NMJ. (A) Den rumlige fordeling af NMJ komponenter viser axon terminal forankret på overfladen af muskelfiber (Mf). (B) En højere forstørrelse af NMJ viser axon terminalerne. ( C) Ultrastrukturen af en moden NMJ med præ-synaptisk akkson terminal (røde pilespidser) og synaptiske vesikler (Sv), synaptisk kløft (Sc) og post-synaptiske dele (røde pile). Junctional folder (jf) er angivet med den gule stiplede linje. Økse, økse. (D, E) De høje forstørrelsesbilleder viser de synaptiske vesikler i aksler (gule pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Myotubes sammentrækningsanalyse af in vitro NMJ. Myotubes sammentrækning blev udløst med 25 mM CaCl2 løsning (grøn linje). Sammentrækningerne blev hæmmet efter behandling med curare (gul linje). Se også supplerende film 1 og supplerende film 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: Den myotubes sammentrækning udløst af Ca+ +. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Movie 2: Den meget svagere sammentrækning af myotubes efter curare behandling er vist. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende figur 1: De enkelte farvningsbilleder af neurofilamenter (NF, hvide pile) i NMJ-kulturen. De enkelte farvning billeder af synaptiske vesikler (SV2, hvide pile) i NMJ kultur. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Schwann celler mærket af S-100 antistof i NMJ kultur. Klik her for at downloade dette tal.
| Myogendifferentieringsmedium (MDM) | MEM-alpha | 500 mL |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| Doxycyclin | 1μg/ml | |
| Ksr | 56mL (endelig til 10%) | |
| Pen/Strep | 2,5 mL | |
| Samlede | 560 mL | |
| 100mM 2-mercaptoethanol | 2-mercaptoethanol | 7μL |
| d.d. vand | 993μL | |
| Samlede | 1000μL | |
| NMJ medium | Neurobasal medium (NB) | 500 mL |
| kr. | 1x (lager i 50x) | |
| BDNF | 10ng/ml | |
| GDNF | 10ng/ml | |
| kr. | 1x (lager i 100x) | |
| kr. | 10ng/ml | |
| Pen/Strep | 2,5 mL | |
Tabel 1: Formel for medium.
Discussion
Tidligere undersøgelser har rapporteret metoder til NMJ dannelse in vitro med avanceredemetoder,der kræver langsigtet kultur8,10,,12,13,20. Disse resultater føre udviklingen af in vitro NMJ. De komplicerede metoder hindrede imidlertid nmj-undersøgelserne i at få adgang. Vores protokol undgår co-kultur til at generere NMJs effektivt og robust i en enkelt brønd. Tre celletyper i NMJ blev observeret i vores induktionssystem, herunder myotubes, motorneuroner og Schwann celler18. Desuden blev moden morfologi og funktion verificeret.
Baseret på vores tidligere undersøgelse, den oprindelige celletæthed er en kritisk faktor for NMJ dannelse, og forskellige celletætheder fremkalde forskellige antal NMJs i kulturen18. En lav celletæthed (< 1 x 104/cm2) inducerede et lavt antal neuroner, hvilket er ugunstigt for NMJ-formationen. Selv om det ville tage meget mere tid og ressourcer at forberede en højere tæthed af celler (> 1 x 105/cm2),anbefaler vi, at celletætheden være mellem 1,5 x 104/cm2 og 5 x 104/cm2 ved hjælp af vores protokol. NMJ genereret af denne protokol er en heterogen væv med flere celletyper, som er tættere på at efterligne fysiologiske forhold. Den myotubes findes at jævnt distribuere på en kultur parabol, men de motoriske neuroner vises tilfældigt, hvoraf fænomenet resulterer i ulige fordeling af NMJs i en kultur. Denne NMJ er velegnet til kvalitative undersøgelser i stedet for den analyse, der kræver homogene kultursystemer. Vi brugte også andre cellelinjer, eq., H9 (ES cellelinje)18 og A11 (iPS-cellelinje, data ikke vist) til at generere NMJ ved denne protokol. NMJ kan genereres med succes i morfologi og funktion. Kulturtilstanden skal dog optimeres til forskellige cellelinjer.
Den kemisk udløste myotubes sammentrækning og curare-afhængige hæmning bekræftet, at vores in vitro NMJ var funktionel og kunne potentielt anvendes til praktiske analyser. Spontane muskelsammentrækninger blev observeret tilfældigt ved 3\u20124 ugers kultur, men det kunne undgås ved at udvide kulturtiden til så længe som tomåneder 18.
Forskellige strategier er blevet offentliggjort for at generere in vitro NMJ af forskellige modning faser, men in vitro NMJ genereret i vores system viste den betydelige modenhed, som vi kan observere overgangen af gamma til epsilon underenheder af AChR under kulturen18. Modenhed er en vigtig overvejelse for sygdomsmodellering med in vitro NMJ21. Det kan konkluderes, at en in vitro NMJ med integrerede strukturelle komponenter, modenhed og funktion er til potentiel anvendelse til terapeutisk udvikling.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Sakurai for venligt at give 201B7MYOD. Den elektronmikroskopi undersøgelse blev støttet af Keiko Okamoto-Furuta og Haruyasu Kohda (Division of Electron mikroskopisk undersøgelse, Center for Anatomiske Studier, Graduate School of Medicine, Kyoto University). Det monoklonale antistof blev udviklet af HHMI/Columbia University, fremstillet af Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af National Institute Child Health and Human Development of the NIH, og vedligeholdes på Department of Biology, University of Iowa. Vi takker også Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa og Eriko Matsui for bevægelsesvektoranalyse. Dette arbejde blev støttet af midler fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, tilskud numre 16H05352 og 20H03642 (til MKS); iPS Cell Research Fund (til CYL og MKS) Mochida Memorial Foundation for Medicinsk og farmaceutisk forskning (til MKS); Takeda Science Foundation (til MKS); og et tilskud fra The Program for Intractable Diseases Research udnytter sygdomsspecifikke iPS-celler, som blev hjulpet af Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 til CYL og MKS, og 17935423 til MKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W.
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H.
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
