Summary
Här ger vi ett protokoll för att generera in vitro-NMJs från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Denna metod kan inducera NMJs med mogen morfologi och funktion i 1 månad i en enda brunn. De resulterande NMJs skulle kunna användas för att modellera relaterade sjukdomar, att studera patologiska mekanismer eller att skärmen läkemedelsföreningar för terapi.
Abstract
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en specialiserad synaps som överför aktionspotentialer från motor neuron till skelettmuskulatur för mekanisk rörelse. Arkitekturen av NMJEN strukturerar påverkan fungerar av neuronen, muskeln och den ömsesidiga växelverkan. Tidigare studier har rapporterat många strategier genom co-culturing motor nervceller och myotubes att generera NMJ in vitro med komplexa induktionsprocessen och lång kultur period men har kämpat för att rekapitulera mogna NMJ morfologi och funktion. Vårt in vitro NMJ induktionssystem är konstruerat genom att differentiera mänsklig iPSC i en enda kulturskål. Genom att byta myogenic och neurogenic induktionsmedium för induktion, den resulterande NMJ innehöll pre- och post- synaptiska komponenter, inklusive motor nervceller, skelettmuskulatur och Schwann celler i en månad kultur. Den funktionella analysen av NMJ visade också att myotubes kontraktion kan utlösas av Ca++ sedan hämmas av curare, en acetylkolin receptor (AChR) hämmare, där den stimulerande signalen överförs genom NMJ. Denna enkla och robusta metod framgångsrikt härlett den komplexa strukturen av NMJ med funktionell anslutning. Denna in vitro mänskliga NMJ, med dess integrerade strukturer och funktion, har lovande potential för att studera patologiska mekanismer och sammansatta screening.
Introduction
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en specialiserad synaps som överför signaler från motoriska nervceller till skelettmuskulaturen för att kontrollera frivilliga muskelrörelser1,2. Denna synaps består av pre- och postsynaptiska delar. I den presynaptiska delen frigör den motoriska neuronen acetylkolin (ACh) från synaptiska vesiklar genom exocytos. ACh frigörs från synaptiska vesiklar att korsa synaptiska spalten och att binda till AChR på den post-synaptiska delen att utlösa en åtgärd potential för muskelkontraktion3,4. Varje fel i denna känsliga struktur kan orsaka NMJ sjukdomar, inklusive spinal muskelatrofi (SMA), medfödda myasthenic syndrom (CMS), myasthenia gravis (MG)5,6,7, etc. Dessa sjukdomar skadar kraftigt kvaliteten på patienternas liv och har tyvärr inga effektiva behandlingsmetoder på grund av bristen på förståelse för den patologiska mekanismen. I denna studie, Vi syftade till att generera in vitro mänskliga NMJ från mänskliga iPSCs för korrekt sjukdom modellering och för terapeutiska föreningar screening.
Tidigare studier har visat möjligheten att generera in vitro NMJ genom samkultur strategier. De motoriska nervceller och skelett myotubes genereras respektive. De två celltyperna kan genereras från human- eller mus primärvävnadskulturer eller induceras från stamceller8,9,10,11 och sedan samkulturerade för NMJ-bildning. De ytterligare tillämpningarna omfattar att sammanfoga det samkulturerade NMJ till mikrofluidiska 3D-enheter och att använda optogenetiska enheter för kvantifierbara funktionsanalyser12,13. Emellertid, dessa strategier tar en lång kultur period och kräver kamp för att få de primära komponenterna i NMJ, antingen motor neuron eller skelettet myotube samtidigt. Ännu en viktig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan inte genereras i dessa kultursystem. Det avancerade odlingssystemet som innehåller myotube, motor neuron och Schwann cell är önskvärt eftersom det kan erbjuda en tillförlitlig och robust modell för NMJ studier.
Myogenic Differentiering 1 (MYOD1) är en välkänd myogenic regulator för myogenesis14. Den effektiva myogenic differentiering metod som tillämpas MYOD1 att driva iPSC i myotubes byggdes i en tidigare studie15. Därför, Vi inducerade myotubes genom överuttrycker MYOD1 i iPSCs15, och hög effektivitet av myogenic differentiering visades. Intressant, neuron celler dök upp tillsammans med myotubes spontant efter dag 10. Utseendet på neuronceller i myogen kultur har lett oss att utveckla strategin för att generera in vitro NMJ i en enda maträtt. Här ger vi en strategi för att generera NMJs genom att överuttrycka MYOD1 i mänskliga iPSCs för myogenic och motor neuron induktion i samma kultur skålen. Motorneverna induceras spontant med flera neurotrofa faktorer (GDNF, BDNF, NT3 etc.) 8, och under tiden kan Schwann cellerna också induceras16,17. Genom interaktionerna mellan myotubes, motor nervceller och Schwann cellerna, den mogna NMJ bildas18. Denna metod kan generera funktionella NMJ effektivt, möjliggör den potentiella studie av patologiska mekanismer och terapeutiska sammansatta screening.
Protocol
1. Beredning av extracellulär matris (ECM)-belagda plattor
- Späd ECM (se Tabell över material) med iskall 1x PBS till en slutkoncentration på 2%.
- Tillsätt 1 mL ECM till 49 mL av 1x PBS i ett 50 mL plaströr. Blanda väl genom pipettering upp och ner flera gånger.
- Placera 1 coverslip i varje brunn av en 6-brunnsplatta. Tillsätt 1,5 mL på 2 % ECM i varje brunn.
- Inkubera brunnsplattan med 2% ECM i 2 h vid 37 °C.
- Aspirera ECM från brunnsplattan och förvara plattan vid 4 °C före användning.
2. Differentiering av iPSCs mot NMJ
- Frö 4 x 105 av iPSCs per brunn på 6-brunnsplattan som bereds i avsnitt 1. Se till att så cellerna på täcket förinsatta i brunnen.
OBS: I denna studie, den 201B7MYOD iPS cellinje, en gåva från Dr Sakurai's Lab, användes15.- Ta bort mediet från iPSCs på 6 cm kultur skålen och tvätta iPSCs gång med 1x PBS.
- Tillsätt 1 mL cellavlossningslösning till skålen och inkubera i 10 min vid 37 °C.
- Tillsätt 3 mL av primat embryonalt stam (ES) cellmedium till skålen och pipetten 3 gånger försiktigt.
- Samla upp supernatanten, som innehåller fristående iPSCs, i ett 50 mL plaströr och centrifug vid 160 x g vid 4 °C i 5 min.
- Försiktigt aspirera supernatanten, resuspend iPSCs i 3 mL primate ES-cellmedium med 10 μM Y27632, och räkna cellens tal med hjälp av en hemocytometer.
- Späd iPSC-enheterna med primat ES-cellmedium och 10 μM Y27632 till en koncentration på 2 x 105 celler/mL. Lägg till 2 mL iPSCs på täcket som förinsätts i den brunn som beskrivs i avsnitt 1.
- Induktion av iPSCs till NMJ
- På dag 1, 24 h efter seedning av iPSCs till 6-brunnsplattan, ta bort odlingsmediet och ersätta det med 2 mL färskt primater ES cellmedium som innehåller 1 μg/mL doxycyklin till varje brunn.
- Byt medium med 2 mL myogen differentieringsmedium (MDM) (Tabell 1) som innehåller 1 μg/mL doxycyklin (slutkoncentration) till varje brunn. Uppdatera mediet varje dag från dag 2 till dag 10.
- Från dag 11, växla medium till 2 mL av NMJ medium (Tabell 1) till varje brunn. Uppdatera mediet var 3\u20124 dagar därefter till dag 30.
- Observera den differentierade NMJ genom fas inverterad mikroskopi dag 30. NMJ kan användas för följande analys.
3. Immunofluorescens (IF) färgning
- På dag 30 aspirerar odlingsmediet från 6-brunnsplattan. Fixera NMJ-kulturen genom att lägga till 2 mL av 4% paraformaldehyd till varje brunn i 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta proverna 3 gånger genom att tillsätta 2 mL av 1x PBS till varje brunn (3 min för varje tvätt).
- Permeabilisera proverna med 0,1% Triton/PBS i 10 min.
- Upprepa steg 3.2.
- Blockera proverna med 0,5% BSA för 1 h vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.2.
- Inkubera proverna med de primära antikropparna vid 4 °C över natten. Utspädning av antikroppar är följande: Holme 1 (1 μg/mL), myosin heavy chain (MYH) (1/300), neurofilament (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), synaptisk vesikelprotein 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj1 (1/1000).
- Upprepa steg 3.2.
- Inkubera proverna med de sekundära antikropparna vid rumstemperatur i 1 h. Koncentrationen av de sekundära antikropparna som används är följande: anti-mouse IgG 488 konjugerad (0,1 μg/mL), anti-kanin IgG 488 konjugerad (0,1 μg/mL).
- Upprepa steg 3.2.
- Inkubera proverna med aBTX-647 (0,5 μg/mL) för AChR-färgning och med DAPI (1 μg/mL) för nucleusfärgning.
- Upprepa steg 3.2.
- Plocka upp täckplattan med ett par trikåer från 6-brunnsplattan och montera den i 50% glycerol/PBS-lösning på ett mikroskopsglas.
4. Svepelektronmikroskopi (SEM)
- Fixera NMJ-kulturen med 4% paraformaldehyd och 1% glutaraldehyd beredd i 0,1 M kaliumfosfatbuffert vid rumstemperatur i 1 h.
- Tvätta proverna 3 gånger genom att puttra dem i 0,1 M kaliumfosfatbuffert vid rumstemperatur (10 min för varje tvätt).
- Dehydrate proverna med stigande koncentrationer av etanol (50%, 70%, 90%, 95% och 100% två gånger). Sänk in proverna i varje koncentration av etanol under 10 min.
- Torka proverna med en kritisk punkttork (-30 °C, 0.1 Torr).
- Coat proverna med Pt (platina) jon coater (30 mA i 3 min; tjocklek av Pt är ca 20 nm).
- Observera proverna genom SEM vid 5 kV.
5. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Använd en cellskrapa för att skörda vävnaden från NMJ-odlingsplattan. Forma vävnaden till en liten pellet (3 mm3) med ett rakblad och limma genom gelation för att bilda en gel-inslagna bit. Fixera den gelinslagna biten med 2% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd framställd i 0,1 M kaliumfosfatbuffert vid 4 °C över natten.
- Tvätta proverna 3 gånger genom att puttra dem i 0,1 M kaliumfosfatbuffert (15 min för varje tvätt) vid rumstemperatur.
- Postfix proverna med 1% osmium tetroxid beredd i dubbeldestillerad H2O för 1 h vid rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: Detta steg måste göras i en kemisk huva. - Upprepa steg 5.2.
- Dehydrate proverna med stigande koncentrationer av etanol (50%, 70%, 90%, 95% och 100% två gånger). Sänk in proverna i varje koncentration av etanol under 10 min.
- Aspirera den 100% etanol. Infiltrera proverna med stigande volymförhållanden av epoxiharts till 100% etanolblandningar (1:3, 1:1 och 3:1). Agitera varje blandning försiktigt vid 10 rpm i 1 h vid rumstemperatur.
- Ersätt epoxi-etanolblandningen med ren epoxiharts och agitera försiktigt vid 10 rpm i 4 h vid rumstemperatur.
- Efter 4 h, uppdatera epoxihartsen med färsk epoxiharts och agitera försiktigt vid 10 rpm över natten vid rumstemperatur.
- Bädda in proverna i inbäddningskapslar med färsk epoxiharts och bota proverna i en ugn vid 65 °C över natten.
- Ultramikromin
- Grovtrimning av provblocken under ett dissekerande mikroskop för korrekt orientering.
- Fintrimning av de grovtrimmade blocken med en glaskniv på en ultramicrotom för att erhålla släta ytor.
- Förbered 70 nm ultratunna sektioner från de vältrimmade blocken med en diamantkniv. Hämta ultratunna sektionerna med 200 mesh kolformvarbelagda koppargaller.
- Fläcka de ultratunna sektionerna som innehåller galler med mättat uranylacetat framställt i dubbeldestillerat H2O i 30 min och tvätta gallren 3 gånger med dubbeldestillerad H2O (10 min för varje tvätt).
- Vidare kontrastera ultratunna sektionerna med Reynolds blycitrat19 (2,5%) i 5 min och tvätta med kokt H2O förkyld till rumstemperatur 3 gånger (10 min för varje tvätt). Sätt flera natriumhydroxidpellets runt färgningsområdet för att förhindra CO2-utfällning på sektionerna.
- Observera ultratunna sektionerna av TEM vid 70 kV.
6. Muskelkontraktion och curarebehandling
- För att utlösa myotube-kontraktionen, lägg till 25 mM CaCl2 i odlingsmediet i steg 2.3. Förflyttning av myotubes kan observeras i 1\u20122 min.
- Placera 6-brunnsplattan på scenen av ett inverterat mikroskop. Spela in en film av myotube sammandragning av levande cell mikroskopi.
- För att stoppa myotube-sammandragningen, lägg till curare till odlingsmediet (300 ng/mL). Spela sedan in filmen som steg 6.2.
- Öppna filmfilen med rörelsevektoranalys programvara sedan klicka på motion analysis knappen för att analysera filmen.
OBS: Den myotubes kontraktion visas som tid-motion grafik. Filmerna är färgkodade för att visa förflyttningshastigheten på myotubes. De färgkodade glittriga signalerna anger rörelserna hos myotubes där den röda färgen visar den snabbaste rörelsehastigheten och blå färg visar den långsammaste rörelsehastigheten.
Representative Results
Med hjälp av vår differentieringsstrategi visade kulturen pre- och postsynaptiska komponenter i NMJ dag 30. NMJ-komponenterna var inducerade och välutvecklade i en enda brunn, och deras morfologi och platser i NMJ visades av IF-mikroskopi (Figur 1). Flödesdiagrammet i figur 1A sammanfattar NMJ-differentieringsprogressionens tidsförlopp. Färgningen av neurofilament (NF), synaptiska vesiklar (SV2) och AChR (Figur 1B,C) anger nervcellerna. De enda färgningsbilderna av NF och SV2 visas i Tilläggsfigur 1. Alfa-bungarotoxinfärgningen indikerar AChR (bild 1C). Den sammanslagna bilden visar de relativa platserna för en motorisk neuron och AChR i NMJ (Bild 1D,E). Den andra uppsättningen OM-färgning anger motornerverna genom Tuj1 och Holme 1 (Bild 1G,H) och postsynaptiska mytuber genom myosin tung kedja (Bild 1I). Schwann-cellerna var också märkta av S-100-antikropp i NMJ-kulturen (Supplementary Figure 2).
För att ytterligare bekräfta identiteterna på NMJ komponenterna, använde vi SEM för detaljerad morfologisk analys. Mogen NMJ morfologi med expanderade axon terminaler, axoner och muskelfibrer visas i figur 2A,B. TEM utfördes för att avslöja den mogna ultrastrukturen hos NMJ-komponenterna inklusive presynaptisk axonterminal med synaptiska vesiklar och eftersynapsdelen, som separeras av den synaptiska spalten (Figur 2C\u2012E). Junctional veck indikeras av den gula streckade-linjen, som markerar korsningen av neuron och muskelfibrer (Figur 2C). De mogna axonterminalerna som innehåller synaptiska vesiklar visas i figur 2D,E (gula pilar). De morfologiska resultaten visar att NMJ komponenterna var väl inducerad och mognat.
För att utvärdera funktionen av in vitro NMJ, vi utfört rörelseanalys genom att stimulera motor neuron med CaCl2 att utlösa myotube sammandragningar. Resultaten visade att Ca2+ kan utlösa muskelsammandragningar. Värkarna kan avbrytas av curare. NMJ visade framträdande rörelsesignaler som försvann med curarebehandling (Figur 3). Denna effekt bekräftar att motorneuron signaler överfördes genom NMJ att utlösa muskel kontraktion. Sammantaget visade IF-mikroskopi- SEM- och TEM-data den rumsliga fördelningen, morfologin och mognaden hos NMJ-komponenterna i in vitro NMJ som genereras av det protokoll som beskrivs ovan. Rörelseanalys validerade funktionen av in vitro NMJ, vilket innebär dess potentiella tillämpning på att utveckla terapeutiska strategier.
Bild 1: Flödesdiagram för NMJ induktion och OM-bilder av NMJ-kultur. (A) Ett flödesdiagram för NMJ differentieringsprogression. (B\u2012F) Påvisande av NMJ-komponenter, neurofilament (NF), synaptiska vesiklar (SV2) och AChR. De vita pilarna på panel D anger NMJ. (G\u2012K) För- och eftersynaptiska komponenter i NMJ. Tuj1 och Islet1 anger motor neuron, och myosin tunga kedjan (MYH) anger myotube. a-BTX, alfa-bungarotoxin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: SEM och TEM bilder av mogna NMJ. (A) Den rumsliga fördelningen av NMJ komponenter visar axon terminal förankrade på ytan av muskelfiber (Mf). (B) En högre förstoring av NMJ visar axonterminalerna. (C) Ultrastrukturen hos en mognadsfördelade NMJ med presynaptisk axonterminal (röda pilspetsar) och synaptiska vesiklar (Sv), synaptisk spalt (Sc) och eftersynapsdelar (röda pilar). Junctional veck (jf) anges med den gula streckade linjen. Ax, axon. (D, E) De höga förstoringsbilderna visar de synaptiska vesiklarna i axonterminaler (gula pilar). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Myotubes kontraktionsanalys av in vitro NMJ. Myotubes kontraktion utlöstes med 25 mM CaCl2 lösning (grön linje). Sammandragningarna hämmades efter att ha behandlats med curare (gul linje). Vänligen se också Kompletterande Film 1 och Kompletterande Film 2. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Film 1: Den myotubes kontraktion utlöses av Ca++. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande Film 2: Den mycket svagare sammandragning av myotubes efter curare behandling visas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande figur 1: De enda färgning bilder av neurofilaments (NF, vita pilar) i NMJ kultur. Den enda färgning bilder av synaptiska vesicles (SV2, vita pilar) i NMJ kultur. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: De Schwann-celler som S-100-antikroppen märkt i NMJ-kulturen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
| Myogent differentieringsmedium (MDM) | MEM-alfa | 500mL |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| Doxycyklin | 1μg/mL | |
| Ksr | 56mL (slutlig till 10%) | |
| Penna/Strep | 2,5 mL | |
| Totala | 560mL | |
| 100mM 2-merkaptoetanol | 2-merkaptoetanol | 7μL |
| d.d. vatten | 993μL | |
| Totala | 1000μL | |
| NMJ medel | Neurobasalt medium (NB) | 500mL |
| B27 | 1x (lager i 50x) | |
| BDNF | 10ng/mL | |
| GDNF | 10ng/mL | |
| N2 | 1x (lager i 100x) | |
| NT3 | 10ng/mL | |
| Penna/Strep | 2,5 mL | |
Tabell 1: Formel av medium.
Discussion
Tidigare studier har rapporterat metoder för NMJ-bildning in vitro med sofistikerade metoder som kräver långvarigkultur 8,10,12,13,20. Dessa prestationer leder utvecklingen av in vitro NMJ. Men hindrade de komplicerade metodikerna åtkomsten av NMJ-studier. Vårt protokoll undviker samkultur för att generera NMJs effektivt och robust i en enda brunn. Tre celltyper i NMJ observerades i vårt induktionssystem, inklusive myotubes, motor nervceller och Schwann cellerna18. Dessutom var mogna morfologi och funktion verifieras.
Baserat på vår tidigare studie är den initiala celltätheten en kritisk faktor för NMJ-bildning, och olika celltätheter framkallar olika antal NMJs i kulturen18. En låg celltäthet (< 1 x 104/cm2) inducerade ett lågt antal nervceller, vilket är ogynnsamt för NMJ-bildning. Även om det skulle ta mycket mer tid och resurser för att förbereda en högre densitet av celler (> 1 x 105/cm2), rekommenderar vi att celltätheten vara mellan 1,5 x 104/cm2 och 5 x 104/cm2 med hjälp av vårt protokoll. DEN NMJ som genereras av detta protokoll är en heterogen vävnad med flera celltyper som är närmare att efterlikna fysiologiska tillstånd. Myotubesna finnas för att jämnt fördela på en kulturskål men de motoriska neuronerna visas slumpmässigt, av som fenomen resulterar i ojämnt fördelning av NMJs i en kultur. Detta NMJ är passande för kvalitativa studier i stället för analysen som kräver homogena kultursystem. Vi använde också andra cellinjer, eq., H9 (ES-cellinje)18 och A11 (iPS-cellinje, data som inte visas) för att generera NMJ av detta protokoll. Den NMJ kan genereras framgångsrikt i morfologi och funktion. Odlingsvillkoret behöver ändå optimeras för olika cellinjer.
Den kemiskt utlöste myotubes kontraktion och curare-beroende hämning bekräftade att vår in vitro NMJ var funktionell och skulle kunna tillämpas för praktiska analyser. Spontana muskelsammandragningar observerades slumpmässigt vid 3\u20124 veckor av kultur, men det kunde undvikas genom att förlänga kulturtiden till så länge som två månader18.
Olika strategier har publicerats för att generera in vitro NMJ av olika mognadsstadium, men in vitro NMJ genereras i vårt system visade den betydande mognad, som vi kan observera övergången av gamma till epsilon underenheter av AChR under kulturen18. Mognad är ett viktigt övervägande för sjukdomsmodellering med in vitro NMJ21. Sammanfattningsvis är en in vitro NMJ med integrerade strukturella komponenter, mognad och funktion av potentiell användning för terapeutisk utveckling.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Sakurai för vänligt tillhandahålla 201B7MYOD. Elektronmikroskopistudien stöddes av Keiko Okamoto-Furuta och Haruyasu Kohda (Avdelningen för elektronmikroskopisk studie, Centrum för anatomiska studier, Forskarskolan i medicin, Kyoto University). Den monoklonala antikroppen har utvecklats av HHMI / Columbia University, som erhållits från Developmental Studies Hybridoma Bank, skapad av National Institute Child Health och mänsklig utveckling av NIH, och underhålls vid institutionen för biologi, University of Iowa. Vi tackar också Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa och Eriko Matsui för rörelse vektor analys. Detta arbete stöddes av finansiering från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, bidragsnummer 16H05352 och 20H03642 (till MKS); iPS Cell Research Fund (till CYL och MKS); Mochida Memorial Foundation för medicinsk och farmaceutisk forskning (till MKS); Takeda Science Foundation (till MKS); och ett bidrag från Programmet för svårbehandlade sjukdomar Forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler, som fick hjälp av Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 till CYL och MKS, och 17935423 till MKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
