Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

कस्टम-निर्मित डिलीवरी सिस्टम का उपयोग करके चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया की इन विट्रो और विवो डिलीवरी

Published: July 2, 2020 doi: 10.3791/61413
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Geisel School of Medicine, Dartmouth College

Summary

यह प्रोटोकॉल एक परिष्कृत वितरण और निगरानी प्रणाली का उपयोग करके चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के सटीक वितरण के लिए आवश्यक तकनीकों और पद्धति को प्रस्तुत करता है।

Abstract

हाइपरथर्मिया का उपयोग लंबे समय से कैंसर के उपचार में किया जाता रहा है। तकनीकों में गर्म लोहे की छड़ों के इंट्रा-ट्यूमरल सम्मिलन से लेकर व्यवस्थित रूप से वितरित ट्यूमर एंटीबॉडी-लक्षित चुंबकीय नैनोकणों तक, 39 डिग्री सेल्सियस (बुखार-स्तर) से 1,000 डिग्री सेल्सियस (इलेक्ट्रोकेटरी) तक के तापमान और सेकंड से घंटों तक उपचार के समय तक भिन्न होते हैं। तापमान-समय संबंध (थर्मल खुराक) उच्च थर्मल खुराक के साथ प्रभाव को निर्धारित करता है जिसके परिणामस्वरूप ऊतक पृथक्करण और कम थर्मल खुराक होती है जिसके परिणामस्वरूप रक्त प्रवाह में वृद्धि, दवाओं के संचय और प्रतिरक्षा उत्तेजना जैसे उप-घातक प्रभाव होते हैं। सबसे आशाजनक वर्तमान चिकित्सा उपचारों में से एक चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया (एमएनपीएच) है। इस तकनीक में चुंबकीय नैनोकणों को सक्रिय करना शामिल है, जिन्हें गैर-इनवेसिव, गैर-विषाक्त वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र के साथ व्यवस्थित या इंट्राट्यूमर रूप से वितरित किया जा सकता है। चुंबकीय नैनोकणों का आकार, निर्माण और जुड़ाव और चुंबकीय क्षेत्र की आवृत्ति और क्षेत्र की ताकत प्रमुख हीटिंग निर्धारक हैं। हमने बड़े और छोटे पशु मॉडल और सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया देने के लिए परिष्कृत उपकरण और तकनीक विकसित की है। यह दृष्टिकोण, कई स्थानों में निरंतर, वास्तविक समय तापमान निगरानी का उपयोग करके, गैर-लक्ष्य ऊतक हीटिंग को सीमित करते हुए लक्ष्य ऊतक (ट्यूमर) या कोशिकाओं को अच्छी तरह से परिभाषित थर्मल खुराक के वितरण की अनुमति देता है। कई साइटों में तापमान का सटीक नियंत्रण और निगरानी, और उद्योग मानक एल्गोरिथ्म (43 डिग्री सेल्सियस / सीईएम 43 पर संचयी समकक्ष मिनट) का उपयोग, थर्मल खुराक के सटीक निर्धारण और परिमाणीकरण की अनुमति देता है। हमारी प्रणाली, जो विभिन्न प्रकार के तापमान, थर्मल खुराक और जैविक प्रभावों की अनुमति देती है, वाणिज्यिक अधिग्रहण और इनहाउस इंजीनियरिंग और जीव विज्ञान के विकास के संयोजन के माध्यम से विकसित की गई थी। इस प्रणाली को इस तरह से अनुकूलित किया गया है जो एक्स विवो, इन विट्रो और विवो तकनीकों के बीच तेजी से रूपांतरण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक चुंबकीय नैनोपार्टिकल थेरेपी (एमएनपी) हाइपरथर्मिया देने के लिए एक प्रभावी तकनीक और प्रणाली को कैसे डिजाइन, विकसित और कार्यान्वित किया जाए।

Introduction

हाइपरथर्मिया का उपयोग ऐतिहासिक रूप से कैंसर चिकित्सा में किया गया है, या तो अकेले या अन्य उपचारों के साथ संयोजन में। यद्यपि इसका उपयोग का एक लंबा इतिहास है, इस उपचार को वितरित करने के लिए सबसे फायदेमंद तरीका अभी भी बहस की जा रही है और रोग स्थल और स्थान पर निर्भर है। हाइपरथर्मिया वितरण के तरीकों में माइक्रोवेव, रेडियोफ्रीक्वेंसी, केंद्रित अल्ट्रासाउंड, लेजर और धातु नैनोकणों (जैसे सोना या लौह ऑक्साइड) 1,2,3,4 शामिल हैं। प्रसव के इन तरीकों से बुखार के स्तर से लेकर सैकड़ों डिग्री सेल्सियस तक उपचार के तापमान की एक श्रृंखला हो सकती है। हाइपरथर्मिया का जैविक प्रभाव मुख्य रूप से उपयोग किए गए तापमान और उपचार की अवधि पर निर्भर करताहै। इस पांडुलिपि और उद्देश्य के लिए, हम चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया (एमएनपीएच) पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। यह विधि गैर विषैले, एफडीए अनुमोदित, लौह ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करके केंद्रित, स्थानीयकृत, अच्छी तरह से निगरानी और नियंत्रित तापमान परिवर्तनों की अनुमति देती है।

अन्य हाइपरथर्मिया तौर-तरीकों का एक गड्ढा सटीक सेलुलर लक्ष्यीकरण की कमी है; हाइपरथर्मिया में स्वाभाविक रूप से उच्च चिकित्सीय अनुपात नहीं होता है, इसलिए, सावधानीपूर्वक थर्मोमेट्री और लक्ष्यीकरणआवश्यक है। एमएनपीएच एमएनपी के प्रणालीगत या इंट्राट्यूमरल इंजेक्शन की अनुमति देता है, गर्मी केवल वहां उत्पन्न होती है जहां एमएनपी स्थित होते हैं, इस प्रकार उपचार को सीधे ट्यूमर को लक्षित किया जाता है। एमएनपीएच प्रभावी हो सकता है जब चुंबकीय नैनोकणों सेल के अंदर या बाहर स्थित होते हैं। कैंसर थेरेपी के लिए, एमएनपीएच का सामान्य अवलोकन यह है कि चुंबकीय नैनोकणों को इंजेक्ट किया जाता है (इंट्राट्यूमरल या अंतःशिरा रूप से), फिर एक वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र लागू किया जाता है, जिससे नैनोपार्टिकल चुंबकीय ध्रुव लगातार फिर से संरेखित होते हैं, जिससे नैनोकणों से जुड़ी कोशिकाओं और ऊतक का स्थानीयकरण होता है 7,8 . नैनोकणों की मात्रा और वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र (एएमएफ) की आवृत्ति / ताकत को समायोजित करके, ऊतक के भीतर उत्पन्न तापमान को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करना संभव है।

यह उपचार शरीर की सतह के पास ट्यूमर में अच्छी तरह से काम करता है, क्योंकि गहरे ट्यूमर को मजबूत एएमएफ की आवश्यकता होती है इसलिए एडी करंट हीटिंग का खतरा बढ़जाता है। हाइपरथर्मिया को मोनोथेरेपी के रूप में चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाने के सबूत हैं, हालांकि, अक्सर हाइपरथर्मिया को विकिरण चिकित्सा या कीमोथेरेपी के साथ जोड़ा जाता है, जिससे अधिक लक्षित कैंसर विरोधी प्रभाव10,11,12 होता है। विकिरण चिकित्सा के साथ संयोजन में काम करने वाले हाइपरथर्मिया के नैदानिक साक्ष्य की समीक्षा पिछले प्रकाशन13 में की गई है। हमारी प्रयोगशाला ने एमएनपीएच विधि12,14,15 का उपयोग करके चूहों से सूअरों और सहज कैनाइन कैंसर तक विभिन्न प्रकार के जानवरों का सफलतापूर्वक इलाज किया है। यह प्रोटोकॉल स्थानीयकृत हाइपरथर्मिया उपचार के प्रभावों की जांच में रुचि रखने वालों के लिए डिज़ाइन किया गया है, या तो अकेले या अन्य उपचारों के साथ संयोजन में।

हाइपरथर्मिया में सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक वास्तविक समय में, थर्मल खुराक को लक्ष्य / ट्यूमर ऊतक तक पहुंचाया जा रहा है और समझने में सक्षम है। खुराक की गणना और तुलना करने का एक मानक तरीका 43 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग के संचयी समकक्ष मिनटों के प्रदर्शन के माध्यम से है; यह एल्गोरिथ्म वितरण प्रणाली, अधिकतम और न्यूनतम तापमान (एक विशिष्ट सीमा के भीतर) और गर्मी अप / कूल डाउन पैरामीटर 5,16 से स्वतंत्र खुराककी तुलना के लिए अनुमति देता है। सीईएम गणना 39-57 डिग्री सेल्सियस 5 के बीच तापमान के लिए सबसे अच्छा काम करतीहै। उदाहरण के लिए, हमारे द्वारा किए गए कुछ अध्ययनों में, हमने सीईएम 43 30 (यानी, 43 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) की थर्मल खुराक चुनी है। इस खुराक को चुनने से हमें विट्रो में एक सुरक्षित, प्रभावी, इम्यूनोजेनेटिक प्रभावों को देखने की अनुमति मिली, दोनों अकेले, और विकिरण17 की एकल खुराक के साथ संयोजन में।

चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के साथ, कई कारक हैं जिन्हें उचित वितरण प्रणाली के निर्माण में विचार करने की आवश्यकता है। इंस्ट्रूमेंटेशन डिज़ाइन में महत्वपूर्ण सुरक्षा कारक शामिल हैं, जैसे कि चुंबकीय क्षेत्र वितरण उपकरण को उच्च शक्ति पर संचालित होने पर भी ठंडा रहने के लिए चिलर का उपयोग, और असफल-सुरक्षित प्रक्रियाएं जो सिस्टम को चालू होने से रोकती हैं यदि सभी तापमान, शक्ति मूल्यांकन और नियंत्रण प्रणाली सक्रिय नहीं हुई हैं। इसके अतिरिक्त, महत्वपूर्ण जैविक कारक हैं जिन्हें विवो और इन विट्रो स्थितियों दोनों के लिए विचार करने की आवश्यकता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करते समय, विकास मीडिया में इलाज करना और शारीरिक परिवर्तनों से बचने के लिए लगातार व्यवहार्य तापमान पर बनाए रखना आवश्यक है जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। व्यक्तिगत नैनोपार्टिकल प्रकारों के लिए, एएमएफ आधारित हीटिंग मापदंडों की गणना करते समय विशिष्ट अवशोषण दर (एसएआर) को जानना महत्वपूर्ण है। इसी तरह, कोशिकाओं और ऊतकों में एमएनपी / एफई एकाग्रता को जानना महत्वपूर्ण है, जो वांछित हीटिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। विवो विधियों में विस्तार पर और भी अधिक ध्यान देने की आवश्यकता होती है क्योंकि जानवर को उपचार के दौरान संज्ञाहरण के तहत बनाए रखा जाना चाहिए और पशु के मुख्य शरीर के तापमान को पूरे उपचार के दौरान सामान्य स्तर पर बनाए रखा जाना चाहिए। जानवर के शरीर के तापमान को गिरने की अनुमति देना, जैसा कि संज्ञाहरण के तहत होता है, उपचार किए जा रहे ऊतक की थर्मल खुराक के संबंध में समग्र परिणामों को प्रभावित कर सकता है।

इस पांडुलिपि में, हम एक बहुमुखी चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया प्रणाली को डिजाइन और निर्माण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों पर चर्चा करते हैं, साथ ही महत्वपूर्ण उपयोग कारकों पर भी विचार करने की आवश्यकता होती है। वर्णित प्रणाली चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के मजबूत, सुसंगत, जैविक रूप से उपयुक्त, सुरक्षित और अच्छी तरह से नियंत्रित वितरण के लिए अनुमति देती है। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे द्वारा किए जाने वाले एमएनपीएच अध्ययनों में अक्सर विकिरण, कीमोथेरेपी और इम्यूनोथेरेपी जैसे अन्य उपचार शामिल होते हैं। इन परिणामों को सार्थक होने के लिए, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि वितरित गर्मी अन्य तौर-तरीकों (या इसके विपरीत) और जानवर की भलाई की प्रभावकारिता और / या सुरक्षा-विषाक्तता को कैसे प्रभावित कर सकती है। इस कारण से और पहले उल्लिखित डोसिमेट्री और चिकित्सीय स्थितियों के लिए, चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया खुराक सटीकता और निरंतर कोर और लक्ष्य तापमान माप पर सख्त ध्यान देना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सुरक्षित और प्रभावी चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के वितरण के लिए एक सीधी, सुसंगत विधि और विवरण प्रदान करना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

डार्टमाउथ कॉलेज पशु देखभाल और उपयोग कार्यक्रम अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर (आईएएएएलएसी) द्वारा मान्यता प्राप्त है और सभी यूडीएसए और एनआईएच (प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय) दिशानिर्देशों और नियमों का पालन करता है। विवो अध्ययनों में सभी को डार्टमाउथ कॉलेज संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इच्छामृत्यु प्रक्रिया जानवरों की इच्छामृत्यु के लिए 2020 एवीएमए दिशानिर्देशों का पालन करती है।

1. सिस्टम का इंस्ट्रूमेंटेशन/ डिजाइन

  1. कस्टम एएमएफ एंटीना (कॉइल) को एक बंद लूप के रूप में डिज़ाइन करें, वांछित चुंबकीय क्षेत्र बनाने के लिए आकार चुनें। वांछित क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए संगत कॉइल डिजाइन करने के लिए पावर जनरेटर पसंद से प्रेरकत्व सूत्रों और विशेषताओं का उपयोग करें। इन विट्रो और विवो प्रयोगों के लिए विभिन्न डिजाइनों का उपयोग करें।
  2. सुनिश्चित करें कि एएमएफ एंटीना प्रेरकत्व पावर जनरेटर की स्वीकार्य सीमा के भीतर आता है। एंटीना को पावर जनरेटर से मिलान (ट्यून) करने के लिए कैपेसिटर जोड़ें या घटाएं।
  3. इन विट्रो प्रयोगों के लिए, एक 14-टर्न हेलिकल कॉइल, आंतरिक व्यास 2 सेमी और लंबाई 14 सेमी डिजाइन करें, जिसमें 1.5 एमएल ट्यूब हो सकते हैं, जिससे एक साथ कई नमूनों के उपचार की अनुमति मिलती है। एक विनाइल बहुलक के साथ कॉइल को इन्सुलेट करें और ट्यूबों से कॉइल को अलग करने के लिए पॉलीस्टाइनिन स्पेसर का उपयोग करें। डिजाइन विनिर्देश और विचारों का विवरण पूरक फाइल 1 में मौजूद है।
  4. विवो प्रयोगों में, मालिकाना डिजाइन जानकारी के साथ एक निर्माता से एक कस्टम निर्मित पूरे शरीर पेचदार कुंडल प्राप्त करें। 8 मिमी वर्ग टयूबिंग का उपयोग करें (क्योंकि यह कॉइल के बोर के भीतर एक अधिक समान क्षेत्र बनाता है), और लक्षित उपचार क्षेत्र में एक कंसंट्रेटर। कंसंट्रेटर को 5.0 सेमी लंबा बनाएं, जिसमें कुल 5 मोड़ हों, जिसके परिणामस्वरूप 3.6 सेमी आंतरिक व्यास, 5.2 सेमी बाहरी व्यास हो, और इसका स्थान लक्षित उपचार क्षेत्र में हो। कॉइल को पॉली कार्बोनेट शेल के साथ घेर लें।
  5. समायोज्य शक्ति और आवृत्ति के साथ एक एएमएफ जनरेटर का उपयोग करें, जिसे बिजली स्रोत के रूप में 10 किलोवाट या उससे अधिक रेट किया गया है। प्रेरकत्व शक्ति स्रोत और एंटीना / कॉइल्स से 0.62 से 1.18 μHenries (μH) की सीमा से मेल खाता है, जिससे 30-300 kHz के बीच आवृत्तियों की अनुमति मिलती है। केन्द्रापसारक बूस्ट पंप के माध्यम से पुनर्नवीनीकरण पानी का उपयोग करके जनरेटर को ठंडा करें, दबाव 50 पीएसआई तक विनियमित हो।
  6. कॉइल्स को 5.6 टन शीतलन क्षमता वाले चिलर के साथ ठंडा करें जो एएमएफ एंटीना के माध्यम से पानी से पतला 25% एथिलीन ग्लाइकोल-आधारित गर्मी हस्तांतरण द्रव पंप करता है। चिलर का तापमान इस तरह सेट करें कि एंटीना नमूने को गर्म या ठंडा न करे।
  7. पशु नियंत्रण के लिए, एक ट्यूबलर धारक का निर्माण करें जिसे कुंडल के केंद्र में धारक और कॉइल सतह के बीच 0.5 सेमी हवा के अंतर के साथ निलंबित किया जा सकता है। एक समायोज्य वातानुकूलित एयर पंप कनेक्ट करें जो कॉइल के चारों ओर शेल के माध्यम से हवा को प्रसारित करता है और इसे सामान्य पशु कोर तापमान बनाए रखने के लिए सेट करता है। संज्ञाहरण मशीन को जानवर के सिर के पास ट्यूबलर पशु धारक से कनेक्ट करें ताकि संज्ञाहरण की उचित डिलीवरी सुनिश्चित हो सके।
  8. सेल नियंत्रण के लिए, एक उपकरण बनाएं जो स्पेसर के माध्यम से पानी के स्नान से पानी को प्रसारित करता है जहां ट्यूब रखे जाते हैं। इस पानी के स्नान का तापमान इस तरह सेट करें कि ट्यूब 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी से घिरे हों।
  9. ट्यूमर, जानवर के कोर और पशु पर्यावरण के भीतर तापमान की निगरानी के लिए या इन विट्रो अध्ययनों के लिए फाइबर ऑप्टिक जांच का उपयोग करें, सेल पेलेट के तापमान और ट्यूबों के आसपास के पानी की निगरानी करें।
  10. सभी प्रयोगों के लिए चुंबकीय लौह ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करें जो आकार में 100 एनएम हैं।
    नोट: एकाग्रता और विशिष्ट अवशोषण दर (एसएआर) दो विशेषताएं हैं जिन्हें नैनोकणों को चुनते समय माना जाना चाहिए, क्योंकि वे सीधे संभावित हीटिंग और थर्मल खुराक18 को प्रभावित करते हैं।

2. विट्रो में हाइपरथर्मिया

  1. आरपीएमआई मीडिया में 10% एफबीएस और 1% पेन / स्ट्रेप के साथ कल्चर बी 16 एफ 10 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाएं। प्लेट 150, 000 कोशिकाएं / 6-वेल प्लेटों में, पूर्ण माध्यम के 2 एमएल के साथ।
  2. प्रत्येक कुएं के लिए उपयुक्त उपचार निर्धारित करें, यानी, एमएनपी के बिना कोशिकाएं और कोई एएमएफ नहीं, एमएनपी और बिना एएमएफ वाली कोशिकाएं, एमएनपी और एएमएफ के बिना कोशिकाएं, एमएनपी और एएमएफ वाली कोशिकाएं।
    नोट: इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि हाइपरथर्मिया को किसी अन्य चिकित्सा के साथ जोड़ते समय उचित नियंत्रण हैं। एएमएफ एक मानक अनुसंधान बेंच प्रयोगशाला में किया जाता है जो आवश्यक शक्ति और शीतलन क्षमताओं के साथ रेट्रोफिट होता है।
  3. चढ़ाना के बाद 24 घंटे, पिछले चरण में निर्धारित उपयुक्त कुओं में एमएनपी जोड़ें। 3 मिलीग्राम आयरन / एमएल की एकाग्रता में एमएनपी जोड़ें। सुनिश्चित करें कि एमएनपी पूरे कुएं में वितरित किए जाते हैं, या तो स्टॉक मीडिया / एमएनपी समाधान बनाकर (पुराने मीडिया को हटाकर, इस समाधान को जोड़कर) या समरूप वितरण के लिए सीधे और धीरे-धीरे घूमने वाली प्लेटों को जोड़कर।
  4. एमएनपी को जोड़ने के 48 घंटे बाद उपचार शुरू करें, जब कुएं ~ 80% कंफ्लुएंट होते हैं, मीडिया को हटाकर और ताजा मीडिया के साथ कुओं को धोकर। मीडिया को हटा दें।
  5. उपचार किए गए प्रत्येक स्वास्थ्य के लिए 0.5 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें, और धीरे से घुमाएं। यह जांचने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि कोशिकाएं अलग हैं।
  6. कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक कुएं में 1 एमएल मीडिया जोड़ें। कुएं से सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें (~ 1 x 106 कोशिकाएं)। प्रत्येक कुएं के लिए एक स्पष्ट रूप से लेबल की गई अलग ट्यूब का उपयोग करें।
  7. कोशिकाओं को गोली चलाने की अनुमति देने के लिए 2-3 मिनट के लिए 60 x g पर ट्यूब स्पिन करें। मीडिया में गोली को बनाए रखें।
  8. कुंडल के भीतर पानी से भरे स्पेसर में ट्यूब रखें। पानी के स्नान का तापमान इस तरह सेट करें कि मीडिया और सेल पेलेट 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाए। अलग-अलग फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच का उपयोग करके ट्यूब और पानी के स्नान के भीतर तापमान की निगरानी करें।
  9. चिलर चालू करें, जांचें कि शीतलक कॉइल के माध्यम से बह रहा है। पावर स्रोत चालू करें और वांछित फ़ील्ड के लिए अधिकतम प्रतिशत समायोजित करें। 14-टर्न सोलनॉइड कॉइल को संचालित करें, जो 10 किलोवाट जनरेटर द्वारा संचालित है, 165 kHz और 23.87 kA / m (300 Oe) पर।
  10. ट्यूबों में से एक में एक अलग फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच रखें। पहले से निर्धारित प्रोटोकॉल थर्मल खुराक तक कोशिकाओं का इलाज करें। एक उदाहरण 43 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट (30 का सीईएम 43) है।
  11. मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें जो उनकी ट्यूबों में हैं और नई 6 अच्छी प्लेटों में फिर से प्लेट करें। स्पष्ट रूप से नई प्लेटों को लेबल करें। लक्ष्य एकत्र की गई सभी कोशिकाओं (~ 1 x 106 कोशिकाओं) को फिर से प्लेट करना है।
    नोट: नई 6 अच्छी प्लेटों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि सुसंस्कृत की जा रही कोशिकाओं को उपचार प्राप्त हो। यदि पुरानी प्लेटों का उपयोग किया जाता है, तो अभी भी प्लेटों पर कोशिकाएं बची हो सकती हैं जिन्हें सफलतापूर्वक ट्रिप्सिनाइज्ड नहीं किया गया था।
  12. यदि आवश्यक हो, तो अगली प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए, आरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को लाइस करें।

3. विवो में हाइपरथर्मिया

  1. कोशिका संस्कृति और टीकाकरण
    1. आरपीएमआई मीडिया में 10% एफबीएस और 1% पेन / स्ट्रेप के साथ कल्चर बी 16 एफ 10 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाएं। उन प्लेटों / व्यंजनों का उपयोग करें जो वांछित संख्या में जानवरों के टीकाकरण के लिए पर्याप्त कोशिकाएं प्रदान करेंगे। उदाहरण के लिए, 100, 000 कोशिकाओं पर चढ़ाए गए 10, 100 मिमी व्यंजन 48 घंटे के भीतर 20 चूहों के इंजेक्शन के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के साथ संयोजन किया जाएगा।
    2. ट्रिप्सिनाइज कोशिकाएं और शुद्ध आरपीएमआई मीडिया (कोई एफबीएस या पेन / स्ट्रेप नहीं) का उपयोग करके एकत्र करें।
    3. कोशिकाओं की गणना करें और टीकाकरण की मात्रा और माउस संख्या के आधार पर कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता के लिए एक समाधान बनाएं।
    4. वाष्पीकृत आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन का उपयोग करके 6 सप्ताह की मादा सी 57 बीएल / 6 चूहों को एनेस्थेटाइज करें। जानवरों को प्रेरित होने तक 5% आइसोफ्लुरेन और 95% ऑक्सीजन के साथ एक प्लेक्सीग्लास बॉक्स में रखें। एक बार प्रेरित होने के बाद, जानवर को हटा दें और चरण 3.1.5-3.1.7 और 3.3.3-3.3.6 को पूरा करने के लिए 2% आइसोफ्लुरेन पर फेस शंकु का उपयोग करें।
      नोट: उपचार के दौरान संज्ञाहरण के लिए एक अंतर्निहित संज्ञाहरण नियंत्रण का उपयोग करें। माउस संज्ञाहरण के लिए मानक संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करें। पशु प्रयोग से पहले उचित आईएसीयूसी अनुमोदन सुनिश्चित करें। संज्ञाहरण के बाद, जानवर को पिंजरे में वापस करें और कोई जटिलता न सुनिश्चित करने के लिए वसूली की निगरानी करें।
    5. राइटिंग रिफ्लेक्सिस के लिए प्रतिक्रिया की कमी की जांच करें।
    6. इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके दाएं फ्लैंक को शेव करें।
    7. इंजेक्शन क्षेत्र को अल्कोहल वाइप से साफ करें। 1-2 x 106 कोशिकाओं को इंजेक्ट करें, 28 ग्राम सुई के साथ 100 μL ग्लास सिरिंज का उपयोग करके, एनेस्थेटाइज्ड के मुंडा दाएं फ्लैंक पर इंट्राडर्मल रूप से 50 μL मीडिया में फैल ते हैं।
  2. ट्यूमर वृद्धि / नैनोपार्टिकल इंजेक्शन
    1. कैलिपर्स (लंबाई, चौड़ाई और गहराई) का उपयोग करके 3 आयामों में ट्यूमर को मापें, और (लंबाई x चौड़ाई x गहराई x π)/6 द्वारा वॉल्यूम की गणना करें।
    2. जब ट्यूमर की मात्रा 120 मिमी3 (+/- 20 मिमी 3) तक पहुंचजाती है, तो जानवरों को अध्ययन पर रखें। अध्ययन को डिजाइन करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि संयोजन चिकित्सा समूहों (यानी, नियंत्रण, एमएनपीएच, विकिरण और संयोजन) सहित उचित नियंत्रण और उपचार समूह हैं।
    3. एनेस्थेटाइज चूहों को जो 3.1.4 में वर्णित एमएनपी प्राप्त करेंगे।
    4. अल्कोहल वाइप के साथ क्षेत्र को साफ करें। एएमएफ उपचार से 3 घंटे पहले ट्यूमर में एमएनपी इंजेक्ट करें। एक मात्रा को इंजेक्ट करें ताकि खुराक 7.5 मिलीग्राम आयरन / सेमी3 ट्यूमर हो।
      नोट: प्रयोगशाला से अप्रकाशित डेटा से पता चलता है कि अधिकतम एमएनपी अपटेक 3-6 घंटे पर होता है।
  3. AMF उपचार
    1. माउस को एनेस्थेटाइज करें और कोर तापमान बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड पर रखें।
    2. राइटिंग रिफ्लेक्सिस के लिए प्रतिक्रिया की कमी की जांच करें। माउस पर कान टैग या किसी अन्य धातु वस्तुओं को हटा दें।
    3. धीरे से माउस के मलाशय में एक लुबेड फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच रखें।
    4. सुई को हटाते हुए ट्यूमर में कैथेटर रखें। कैथेटर को ऐसे काटें कि वह ट्यूमर से ज्यादा न चिपके।
      नोट: फाइबरऑप्टिक तापमान कैथेटर को रखा जाता है और हटा दिया जाता है जबकि चूहे सामान्य संज्ञाहरण के तहत होते हैं यानी, कैथेटर केवल ट्यूमर हीटिंग प्रक्रिया के दौरान होते हैं। प्रक्रिया के समय चूहों को एनएसएआईडी एनाल्जेसिया दवा, केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) की एक चमड़े के नीचे की खुराक दी जाती है। हमने कैथेटर के प्लेसमेंट से जुड़ी छोटी या दीर्घकालिक असुविधा या रुग्णता नहीं देखी है।
    5. कैथेटर में 3-सेंसर फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच डालें। कैथेटर फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच सेंसर की रक्षा करता है।
    6. रेक्टल और इंट्राट्यूमरल जांच को जानवर की पूंछ पर टेप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे जगह में बने रहें।
    7. माउस को 50 एमएल ट्यूब में रखें, नीचे की ओर जाएं। ट्यूब में सिर के पास एक छेद होना चाहिए जहां संज्ञाहरण जोड़ा जाएगा और वितरित किया जाएगा।
    8. ट्यूब को कुंडल सेट के भीतर रखें और संज्ञाहरण को फिर से कनेक्ट करें।
    9. पर्यावरण के तापमान को मापने के लिए ट्यूब में एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच को ढीला रखें।
    10. चिलर चालू करें, और सुनिश्चित करें कि शीतलक प्रसारित किया जा रहा है।
    11. जांचें और सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर सॉफ्टवेयर विभिन्न तापमानों को प्रदर्शित कर रहा है और वास्तविक समय में सीईएम 43 गणना प्रदर्शित करने की अनुमति देने के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करें। आवश्यक सीईएम 43 पहले से निर्धारित खुराक है।
      नोट: चुंबक चालू होने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोई धातु आइटम जानवर से जुड़ा नहीं है, क्योंकि ये तेजी से गर्म होंगे। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि कमरे में हर किसी के पास पेसमेकर नहीं है और उनके लिए वहां होना सुरक्षित है।
    12. कम शक्ति प्रतिशत पर चुंबक चालू करें।
    13. सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच तापमान परिवर्तन रिकॉर्ड कर रहे हैं। क्षेत्र बढ़ने पर एएमएफ सक्रिय होने के बाद तापमान में वृद्धि होगी। सुनिश्चित करें कि जानवर का मुख्य तापमान 38 डिग्री सेल्सियस पर रहता है। वातानुकूलित एयर जैकेट का उपयोग करके कोर तापमान को नियंत्रित करें।
    14. अंतर्निहित नियंत्रण डायल का उपयोग करके जनरेटर पर शक्ति बदलकर चुंबकीय क्षेत्र की ताकत को समायोजित करें, जो बदले में ट्यूमर में तापमान के स्तर को नियंत्रित करता है।
    15. वांछित खुराक के बाद एएमएफ को बंद कर दें, जैसा कि पहले उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया गया था (उदाहरण के लिए सीईएम 43 40), ट्यूमर के भीतर हासिल किया जाता है।
    16. एक बार एएमएफ बंद हो जाने के बाद, ट्यूब को कुंडल से हटा दें।
    17. ट्यूब से माउस निकालें, विभिन्न जांच और कैथेटर निकालें। यदि आवश्यक हो, तो जानवर को एक नए धातु कान टैग के साथ टैग करें।
    18. एक बार उपचार पूरा हो जाने के बाद, चिलर को बंद कर दें।
    19. एनेस्थीसिया से जानवरों को पुनर्प्राप्त करें ताकि कोई जटिलता न हो। सामान्य स्थिति में लौटने के लिए उनके व्यवहार की निगरानी करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इन विट्रो अध्ययन
कोशिकाएं केवल वांछित तापमान और थर्मल खुराक प्राप्त करेंगी और बनाए रखेंगी यदि चुंबकीय नैनोकणों / लोहे और एएमएफ की मात्रा और एकाग्रता उचित रूप से मेल खाती है। विट्रो (और विवो में) कोशिकाओं को गर्म करने के लिए चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग करते समय, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आंतरिक चुंबकीय नैनोकणों के साथ कोशिकाओं में हाइपरथर्मिया प्राप्त करने के लिए, इंट्रासेल्युलर एमएनपी / एफई का एक विशिष्ट स्तर आवश्यक होगा, और एमएनपी लोडेड कोशिकाओं की संख्या और निकटता, एक दूसरे के लिए आवश्यक होगी। यदि लक्ष्य कोशिकाओं / ऊतक में एमएनपी / एफई का स्तर हीटिंग प्रभाव प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, तो वांछित तापमान और प्रभाव प्राप्त करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र आवृत्ति और ताकत को समायोजित किया जा सकता है। यदि ठीक से चढ़ाया जाता है, तो विभिन्न खुराक और समय के बीच आनुवंशिक और आणविक अंतर को देखते हुए आगे के अध्ययन का पीछा किया जा सकताहै। चित्रा 1 इन विट्रो विधियों के एक योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है।

इन इन विट्रो विधियों का उपयोग सेलुलर एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच के लिए किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला के एक हालिया उदाहरण ने सीईएम 43 30 एमएनपीएच उपचार, एक 8 जी विकिरण उपचार और संयोजन के बाद इम्यूनोजेनेटिक मतभेदों को निर्धारित किया। हम प्रभावों के पीछे तंत्र में बेहतर समझ हासिल करने के लिए प्रतिरक्षा और साइटोटोक्सिक मार्गों में अभिव्यक्ति में समानता और अंतर की पहचान करने में सक्षम थे, और वे सहक्रियात्मकरूप से कैसे गठबंधन करते हैं। प्रत्येक प्रयोग विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय और गर्म नियंत्रण नमूनों का उपयोग करता है। हाइपरथर्मिया उपचार प्राप्त करने वालों की तुलना में नियंत्रण में अलग-अलग एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर होंगे।

विवो अध्ययन में
विवो अध्ययनों में अतिरिक्त विचार हैं। लक्ष्य थर्मल खुराक के बावजूद इलाज किए जा रहे जानवर में शारीरिक रूप से स्वीकार्य कोर तापमान बनाए रखना बिल्कुल आवश्यक है। यह संज्ञाहरण के तहत कृन्तकों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि कोर तापमान जल्दी से खो सकता है (हीटिंग पैड जैसे कोर तापमान मॉड्यूलेटिंग तकनीक अक्सर आवश्यक होती है)। ट्यूमर में एक विशिष्ट थर्मल खुराक प्राप्त करने की कोशिश करते समय, सामान्य से कम शरीर के तापमान को एएमएफ-एमएनपीएच को बहुत दूर धकेलने की आवश्यकता हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-लक्ष्य ऊतक में अस्वीकार्य प्रभाव पड़ता है (गैर-लक्ष्य ऊतक एडी वर्तमान हीटिंग एक ऐसी संभावना है)। यहां तक कि कोर शरीर के तापमान में मामूली विचलन ट्यूमर या सामान्य ऊतक में अवांछनीय शारीरिक जटिलताओं को जन्म दे सकता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हालांकि दोहराने लायक, सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हीटिंग के लिए, एमएनपी / एफई ऊतक एकाग्रता, एएमएफ आवृत्ति, और क्षेत्र शक्ति तापमान निगरानी मापदंडों और लक्ष्य ऊतक आकार और गहराई के बीच एक मिलान प्राप्त करना आवश्यक है। औसत दर्जे के हीटिंग की अनुमति देने के लिए ट्यूमर के भीतर एमएनपी की आधारभूत एकाग्रता होनी चाहिए। गर्मी का स्तर / क्षमता न केवल एमएनपी ऊतक एकाग्रता (मिलीग्राम एफई / जी ऊतक) और ट्यूमर के भीतर उनके सापेक्ष वितरण पर निर्भर करती है, बल्कि एएमएफ की आवृत्ति और बाद में क्षेत्र की ताकत भी। उपरोक्त में से किसी में भी परिवर्तन ऊतक के भीतर प्राप्य तापमान की विभिन्न श्रेणियों को जन्म दे सकता है। कई वर्षों के अनुभव के माध्यम से, हमने प्रीक्लिनिकल ट्यूमर उपचार के लिए उपयोग की जाने वाली एकाग्रता और सुरक्षित और प्रभावी सक्रियण की अनुमति देने के लिए एएमएफ प्रणाली की आवृत्ति और क्षेत्र की ताकत को अनुकूलित किया है। क्योंकि सभी ऊतक साइटों में तापमान / थर्मल खुराक को मापना असंभव है, रणनीतिक साइटों में जितना संभव हो उतने फाइबर ऑप्टिकल तापमान जांच रखना भी आवश्यक है जो वास्तविक समय प्रभावकारिता और सुरक्षा मूल्यांकन की अनुमति देता है, जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है। ये जांच पूरे प्रयोग में तापमान की रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है, जिससे प्रयोग के सटीक डोसिमेट्री और थर्मल इतिहास की अनुमति मिलती है। चित्रा 3 एक इन विवो प्रयोग के दौरान उत्पन्न वक्रों को प्रदर्शित करता है, तापमान की बारीकी से निगरानी करने और वांछित सीमा के भीतर ट्यूमर के तापमान को बनाए रखने के लिए सिस्टम को समायोजित करने की क्षमता पर प्रकाश डालता है। चित्रा 4 विवो विधियों में सारांशित करता है।

इन विवो विधियों में ये, इन विट्रो विधियों के समान, विभिन्न कैंसर प्रकार, विभिन्न हाइपरथर्मिया खुराक और विभिन्न संयोजन उपचारों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला में पिछले अध्ययनों ने हाइपरथर्मिया और कीमोथेरेपी12 के संयोजन की जांच की है। हमने प्रभावकारिता और आणविक तंत्र के निर्धारण के लिए कई हाइपरथर्मिया और विकिरण प्रयोगों को भी पूरा किया है। इन प्रयोगों के लिए नियंत्रण चूहों को हाइपरथर्मिया की वास्तविक पीढ़ी को छोड़कर सभी प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है। चित्रा 5 में दो ज्वालामुखी भूखंड शामिल हैं जो इन विट्रो और विवो एमएनपी हाइपरथर्मिया उपचार (एमएनपीएच) के बाद अलग-अलग व्यक्त जीन प्रदर्शित करते हैं। ये आंकड़े उदाहरण हैं कि हम हाइपरथर्मिया प्रभावों की निगरानी के लिए आणविक तकनीकों का उपयोग कैसे करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो एमएनपी हाइपरथर्मिया योजनाबद्ध। यह योजनाबद्ध इन विट्रो चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के लिए विधि को प्रदर्शित करता है। हीटिंग सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को पर्याप्त एमएनपी अपटेक के लिए पर्याप्त कण और समय प्रदान किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: तापमान की निगरानी के लिए कैथेटर का प्लेसमेंट। यह आंकड़ा कैथेटर के प्लेसमेंट को दर्शाता है जो ट्यूमर और / या ट्यूमर क्षेत्र में विभिन्न स्थानों पर तापमान रिकॉर्ड करने के लिए फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच को घर देता है। यह आंकड़ा ref.19 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माउस ट्यूमर के उपचार के दौरान वास्तविक समय तापमान की निगरानी। यह ग्राफ वास्तविक समय के तापमान रीडिंग को प्रदर्शित करता है जो एक इनविवो प्रयोग के दौरान कोर शरीर के तापमान, पर्यावरणीय तापमान और ट्यूमर के भीतर कई तापमानों की निगरानी करने की अनुमति देता है। ट्यूमर के भीतर तापमान का नियंत्रण आंकड़े के ज़ूम किए गए हिस्से पर न्यूनतम बड़े पैमाने पर भिन्नताओं के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विवो एमएनपी हाइपरथर्मिया योजनाबद्ध में। यह योजनाबद्ध विवो चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के लिए विधि को प्रदर्शित करता है। पर्याप्त नैनोकणों के इंजेक्शन के साथ-साथ वितरण और अवशोषण के लिए पर्याप्त समय, वांछित थर्मल खुराक देने की क्षमता सुनिश्चित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विभेदक जीन अभिव्यक्ति। इन विट्रो (ए) और विवो (बी) एमएनपी हाइपरथर्मिया उपचार के बाद विभेदक जीन अभिव्यक्ति। ये ज्वालामुखी भूखंड इन विट्रो और विवो एमएनपीएच विधियों दोनों के लिए वाई-अक्ष पर महत्व के साथ लॉग 2 एक्स-अक्ष पर आनुवंशिक परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक सर्कल एक अलग जीन का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें 20 सबसे महत्वपूर्ण अंतर व्यक्त जीन लेबल किए जाते हैं। जीन एक्स-अक्ष पर शून्य से जितना अधिक होता है, गुना परिवर्तन उतना ही अधिक होता है, और जीन वाई-अक्ष पर जितना अधिक होता है, पी-मान उतना ही कम होता है। हालांकि दोनों में एक ही थर्मल खुराक थी, विवो हाइपरथर्मिया में इन विट्रो की तुलना में अधिक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन हुए। ये भूखंड जैविक डेटा के उदाहरण हैं जिन्हें वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है। इन विट्रो ज्वालामुखी प्लॉट को रेफरी.17 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रणाली का डिजाइन और कार्यान्वयन विट्रो और विवो चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया प्रयोगों में सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संचालन करने की क्षमता प्रदान करता है। यह महत्वपूर्ण है कि सिस्टम को इस तरह से डिज़ाइन किया गया है कि एएमएफ आवृत्ति और क्षेत्र की ताकत चुंबकीय नैनोपार्टिकल प्रकार, एकाग्रता और वांछित ऊतक स्थान और तापमान से पर्याप्त रूप से मेल खाती है। इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय में तापमान की सटीक निगरानी सुरक्षा और सटीक थर्मल खुराक (43 डिग्री सेल्सियस / सीईएम पर संचयी समकक्ष मिनट) की गणना के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 1 में प्रदर्शित जांच का प्लेसमेंट, थर्मल खुराक और कोर शरीर के तापमान की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देता है जैसा कि चित्रा 2 में देखा गया है।

चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के सटीक वितरण में पहला कदम जानवरों और ऑपरेटरों के लिए एक सुरक्षित प्रणाली का निर्माण कर रहा है। सिस्टम के सभी घटकों को परिचालन और वितरण के दृष्टिकोण से भी अच्छी तरह से समझा जाना चाहिए। इस स्थिति में, इसका मतलब है कि एएमएफ एडी धाराओं की क्षमता को समझना और यह जानना कि चुंबकीय कण कहां स्थित हैं। एंटेना, या कॉइल, क्षेत्र के आकार और ताकत में एक महत्वपूर्ण कारक हैं, और कॉइल ओवरहीटिंग20 को रोकने के लिए उपयोग की जाने वाली शीतलन प्रणाली महत्वपूर्ण है। कंडक्टर के बाहर की क्षेत्र शक्ति सीधे कंडक्टर के माध्यम से बहने वाली वर्तमान शक्ति के समानुपाती होती है। कंडक्टर के आसपास के अंतरिक्ष में किसी भी बिंदु पर चुंबकीय क्षेत्र की ताकत आसपास के क्षेत्र में कंडक्टर द्वारा उत्पादित क्षेत्रों का वेक्टर योग है। बायोट-सावर्ट व्युत्क्रम वर्ग नियम21 के अनुसार, चुंबकीय क्षेत्र वर्तमान प्रवाह के समकोण पर उत्पन्न होता है और चालक से दूरी के कार्य के रूप में ताकत तेजी से घट जाती है। इस प्रकार, कॉइल के भीतर अधिक समान क्षेत्र के लिए विवो हाइपरथर्मिया में स्क्वायर ट्यूबिंग का उपयोग किया जाता है। संभावित चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक प्रणाली के लिए आवश्यक ताकत और मात्रा के साथ एक चुंबकीय क्षेत्र बनाने के लिए एक उच्च विद्युत प्रवाह की आवश्यकता होती है। इसलिए, एंटीना डिजाइन महत्वपूर्ण विद्युत शक्ति स्तरों को समायोजित करने में सक्षम होना चाहिए। इसके अलावा, एएमएफ एंटेना को डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि उनका प्रेरकत्व बिजली जनरेटर की स्वीकार्य सीमा के भीतर आए। आमतौर पर उपयोग की जाने वाली आवृत्तियों पर, अधिकांश वर्तमान प्रवाह एंटीना कंडक्टर की सतह पर होता है, जिसका अर्थ है कि सतह प्रतिरोधक हीटिंग को प्रभावित करती है जिसे सतह दोषों को समाप्त करके कम किया जा सकता है। इस प्रतिरोधक हीटिंग का मतलब यह भी है कि कॉइल और पर्यावरण को गर्म न करने के लिए एक कॉइल कूलिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है।

हमारे सिस्टम डिजाइन की एक सीमा यह है कि यह आवृत्तियों और चुंबकीय क्षेत्रों की कुल श्रृंखला की अनुमति नहीं देता है, लेकिन यह उन क्षेत्रों को उत्पन्न करने की अनुमति देता है जो कोशिकाओं, कृन्तकों और बड़े जानवरों के लिए उपयुक्त हैं। विशेष रूप से, किसी भी प्रेरण हीटिंग सिस्टम से उपलब्ध अधिकतम क्षेत्र शक्ति सीधे एंटीना (कॉइल) में वर्तमान प्रवाह से संबंधित है। एएमएफ जनरेटर को किलोवाट में रेट किया जाता है, जिसकी गणना उपलब्ध वर्तमान (एम्पीयर) द्वारा उपलब्ध वोल्टेज को गुणा करके की जाती है। इसलिए, 500 वी सीमा के साथ 10 किलोवाट प्रणाली में अधिकतम 20 ए का एम्परेज होगा। कॉइल्स डिज़ाइन यह निर्धारित करेगा कि कौन सी सीमा पहले पहुंच गई है, और इस प्रकार सिस्टम सीमा। किसी भी धारा द्वारा बनाई गई चुंबकीय क्षेत्र की ताकत कंडक्टर से दूरी के कार्य के रूप में तेजी से घट जाती है। इसलिए, एक छोटे व्यास के कुंडल के समान ज्यामिति के साथ एक बड़ा व्यास कॉइल, एक ही प्रणाली पर चलता है, कॉइल के केंद्र में कम क्षेत्र की ताकत होगी। इस प्रकार, आवश्यक चुंबकीय क्षेत्र का आकार और ताकत एएमएफ जनरेटर की क्षमता से सीमित है। एक बड़े कुंडल का निर्माण और अधिक शक्ति का उपयोग करने से अतिरिक्त चिंताएं होती हैं, मुख्य रूप से एडी करंट हीटिंग।

उपयोगकर्ताओं, जानवरों और सिस्टम की सुरक्षा के लिए इस प्रणाली का उपयोग करते समय कई सुरक्षा चिंताओं को संबोधित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, संज्ञाहरण के उपयोग के दौरान पर्याप्त कमरे के वेंटिलेशन को बनाए रखा जाना चाहिए। दूसरा, कॉइल से जुड़े सभी क्षेत्रों को धातु और या कंडक्टर से स्पष्ट होना चाहिए जिसमें उच्च खारा मिश्रण शामिल है। एएमएफ के आसपास काम करते समय उपयोगकर्ताओं को अंगूठी और अन्य गहने हटाने चाहिए, और नमूने में किसी भी प्रकार की धातु नहीं होनी चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि पेसमेकर या अन्य प्रत्यारोपित उपकरणों या वस्तुओं वाले लोगों को एएमएफ के आसपास काम करने से पहले अपने डॉक्टर से परामर्श करना चाहिए। सिस्टम की रक्षा के लिए, एक असफल-सुरक्षित प्रणाली का उपयोग किया जाना चाहिए जो यह सुनिश्चित करता है कि बिजली लागू होने से पहले जनरेटर और कॉइल कूलिंग की जरूरतों को पूरा किया जाए। इसके अतिरिक्त, अनपेक्षित हीटिंग का पता लगाने के लिए एक थर्मल कैमरा अवलोकन का उपयोग किया जाना चाहिए।

इन विट्रो अध्ययनों के लिए, पालन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं में लोहे की एकाग्रता, कोशिकाओं की एकाग्रता, एएमएफ पैरामीटर और थर्मल खुराक मूल्यांकन हैं। चुंबकीय नैनोकणों को सतह पर तैरने वाले, कोशिकाओं या दोनों में रखकर चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया के साथ कोशिकाओं का इलाज / गर्म किया जा सकता है। चुंबकीय नैनोपार्टिकल हीटिंग की मात्रा चुंबकीय नैनोकणों / एफई के स्तर पर निर्भर करेगी। यदि इच्छा केवल आंतरिक लोहे के साथ कोशिकाओं का इलाज करने की है, तो हमारा अनुभव यह है कि व्यक्तिगत कैंसर कोशिकाएं केवल सीमित संख्या में चुंबकीय नैनोकणों को उठाएंगी और यहां तक कि जब उत्थान इष्टतम होता है, तो कोशिकाओं को सेल हीटिंग स्थिति बनाने के लिए एकत्रित / पेलेट किया जाना चाहिए, यहां तक कि अनुकूलित एएमएफ के साथ भी। जैविक रूप से प्रासंगिक स्तरों पर मीडिया और कोशिकाओं के तापमान को बनाए रखना (जब गर्म नहीं किया जा रहा है) सच्चे हीटिंग के सटीक माप के लिए भी महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित 14-टर्न सोलनॉइड कॉइल एक थर्मली नियंत्रित पानी के स्तंभ में नमूनों को डुबोकर जैविक रूप से प्रासंगिक तापमान को बनाए रखने की अनुमति देता है।

विवो अध्ययनों में, पशु कोर तापमान को बनाए रखना और ट्यूमर के भीतर तापमान को सटीक रूप से मापना महत्वपूर्ण कारक हैं। यह पशु नियंत्रण प्रणाली और कॉइल का डिजाइन कॉइल / पावर सेटिंग्स के कारण जानवर के वातावरण में थर्मल बहाव को समाप्त करता है और सामान्य कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करता है। सार्थक प्रयोग परिणामों के लिए शरीर के कोर तापमान को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। रेक्टल जांच जानवर के मुख्य तापमान की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देती है। संज्ञाहरण के तहत, एक जानवर का मुख्य तापमान स्वाभाविक रूप से कम हो जाता है। इस स्थिति को संबोधित करने के लिए, हमने एक पर्यावरणीय हीटिंग सिस्टम विकसित किया जो पशु नियंत्रण पोत के चारों ओर गर्म हवा प्रदान करता है, जिससे कोर तापमान सामान्य सीमा में रहता है। हाइपरथर्मिया उपचार परिणामों की सटीक व्याख्या सुनिश्चित करने और पर्यावरणीय कारकों के उन्मूलन के लिए सामान्य कोर तापमान बनाए रखना आवश्यक है। ट्यूमर में कई साइटों में तापमान निगरानी जांच का प्लेसमेंट तापमान और थर्मल खुराक का सटीक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि ट्यूमर के भीतर चुंबकीय नैनोकणों को सजातीय रूप से वितरित करना असंभव नहीं तो बेहद मुश्किल है, कई साइटों में हीटिंग मापदंडों को जानना एक सुसंगत और सटीक ऊतक / ट्यूमर थर्मल खुराक प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन विट्रो और विवो अध्ययनों में एकाग्रता परिवर्तनशील है। यह भिन्नता इसलिए है क्योंकि सेल संस्कृति में कम सीमाएं हैं, जिसमें कोशिकाओं की एमएनपी तक अधिक पहुंच है, इसलिए कम एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है। विवो में, ट्यूमर की विषम प्रकृति और जटिल 3 डी आकृति विज्ञान के कारण एक उच्च एकाग्रता आवश्यक है। इसलिए, विवो और इन विट्रो में कणों की समान सांद्रता का उपयोग करने से कोशिकाओं द्वारा बहुत कम लिया जाएगा।

यह पांडुलिपि चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया उपचार के लिए एक प्रभावी और लचीला वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र जनरेटर और कॉइल सिस्टम विकसित करने के लिए आवश्यक मापदंडों और इंस्ट्रूमेंटेशन का वर्णन करती है। इस प्रणाली का उपयोग इन विट्रो और विवो अध्ययन दोनों के लिए किया जा सकता है। लक्षित हाइपरथर्मिया और सामान्य ऊतक के संयम के लिए प्रभावी है, जो इसे अन्य एएमएफ-एमएनपी हाइपरथर्मिया सिस्टम की तुलना में आकर्षक बनाता है। इन हाइपरथर्मिया उपचारों को विभिन्न खुराक के प्रभावों की जांच करने के लिए बदला जा सकता है, जिसमें विभिन्न प्रकार के नैनोकणों या नैनोकैरियर और सहायक उपचार होते हैं। चूंकि ऊतक हीटिंग, विशेष रूप से चुंबकीय नैनोपार्टिकल हीटिंग, इतने सारे चर से प्रभावित हो सकता है, इसलिए जांच में मापदंडों को समझना आवश्यक है। यदि इन मानदंडों को पूरा किया जाता है तो चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया स्वतंत्र और सहायक ट्यूमर नियंत्रण सहित कई आणविक, सेलुलर और नैदानिक स्थितियों को संबोधित कर सकता है। यद्यपि यहां वर्णित विधियों को महत्वपूर्ण प्रयास की आवश्यकता होती है, यदि दिशानिर्देशों का पालन किया जाता है, तो एमएनपी हाइपरथर्मिया की पूरी क्षमता का एहसास किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को अनुदान संख्याओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था: एनसीआई पी 30 सीए023108 और एनसीआई यू 54 सीए 151662।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.25% Trypsin Corning 45000-664 available from many companies
1.5 mL tubes Eppendorf Eppendorf 22363204 available from many companies
B16F10 murine melanoma cells American Type Culture Collection CRL-6475
C57/Bl6 mice Charles river 027C57BL/6 6-week-old female mice
Chiller Thermal Care NQ 5 series chiller that cools the coil
Coolant fluid Dow Chemical Company Dowtherm SR-1 antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum Hyclone SH30071 available from many companies
fiber optic probes, software and chassis FISO FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera Flir infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles micromod Partikeltechnologie GmbH Bionized NanoFerrite dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid Fluxtrol custom built
penicillin/streptomycin Corning 45000-652 available from many companies
RF generator Huttinger TIG 10/300 power source
RPMI media Corning 45000-396 available from many companies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
  2. Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
  3. Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
  4. Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
  5. Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
  6. Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
  7. Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
  8. Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
  9. Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
  10. Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
  11. Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
  12. Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
  13. Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
  14. Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
  15. Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
  16. Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
  17. Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
  18. Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
  19. Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
  20. Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
  21. Maxwell, J. C. On physical lines of force. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 21 (139), 161-175 (1861).

Tags

चिकित्सा अंक 161 हाइपरथर्मिया वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र चुंबकीय नैनोपार्टिकल मुराइन मेलेनोमा सेल कल्चर थर्मल खुराक
कस्टम-निर्मित डिलीवरी सिस्टम का उपयोग करके चुंबकीय नैनोपार्टिकल हाइपरथर्मिया की इन विट्रो और विवो डिलीवरी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duval, K. E. A., Petryk, J. D.,… More

Duval, K. E. A., Petryk, J. D., Hoopes, P. J. In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System. J. Vis. Exp. (161), e61413, doi:10.3791/61413 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter