Summary
Denne protokollen presenterer teknikker og metodikk som er nødvendige for nøyaktig levering av magnetisk nanopartikkel hypertermi ved hjelp av et sofistikert leverings- og overvåkingssystem.
Abstract
Hypertermi har lenge vært brukt til behandling av kreft. Teknikkene har variert fra intratumoral innsetting av varme jernstenger, til systemisk leverte tumorantistoffmålrettede magnetiske nanopartikler, ved temperaturer fra 39 °C (febernivå) til 1000 °C (elektrokauteri) og behandlingstider fra sekunder til timer. Temperaturtidsforholdet (termisk dose) dikterer effekten med høye termiske doser som resulterer i vevsablasjon og lavere termiske doser som resulterer i subletale effekter som økt blodgass, akkumulering av legemidler og immunstimulering. En av de mest lovende nåværende medisinske terapiene er magnetisk nanopartikkelhypertermi (mNPH). Denne teknikken innebærer aktivering av magnetiske nanopartikler, som kan leveres systemisk eller intratumoralt, med et ikke-invasivt, giftfritt vekslende magnetfelt. Størrelsen, konstruksjonen og assosiasjonen av de magnetiske nanopartiklene og frekvensen og feltstyrken til magnetfeltet er viktige oppvarmingsdeterminanter. Vi har utviklet avansert instrumentering og teknikker for å levere reproduserbar magnetisk nanopartikkelhypertermi i store og små dyremodeller og dyrkede celler. Denne tilnærmingen, ved hjelp av kontinuerlig temperaturovervåking i sanntid på flere steder, gjør det mulig å levere veldefinerte termiske doser til målvevet (svulsten) eller cellene, samtidig som ikke-målvevsoppvarming begrenses. Nøyaktig kontroll og overvåking av temperatur på flere steder, og bruk av industristandardalgoritmen (kumulative ekvivalente minutter ved 43 °C / CEM43), muliggjør nøyaktig bestemmelse og kvantifisering av termisk dose. Vårt system, som tillater et bredt spekter av temperaturer, termiske doser og biologiske effekter, ble utviklet gjennom en kombinasjon av kommersielle oppkjøp og intern ingeniør- og biologiutvikling. Dette systemet er optimalisert på en måte som muliggjør rask konvertering mellom ex vivo, in vitro og in vivo teknikker. Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man designer, utvikler og implementerer en effektiv teknikk og system for å levere reproduserbar og nøyaktig magnetisk nanopartikkelterapi (mNP) hypertermi.
Introduction
Hypertermi har historisk blitt brukt i kreftbehandling, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlinger. Selv om den har en lang historie med bruk, diskuteres den mest fordelaktige metoden for å levere denne behandlingen fortsatt og er avhengig av sykdomssted og plassering. Metoder for hypertermi levering inkluderer mikrobølgeovn, radiofrekvens, fokusert ultralyd, laser og metalliske nanopartikler (som gull eller jernoksid) 1,2,3,4. Disse leveringsmetodene kan føre til en rekke behandlingstemperaturer fra febernivå til hundrevis av grader C. Den biologiske effekten av hypertermi avhenger hovedsakelig av temperaturene som brukes og varighetenav behandlingen. For dette manuskriptet og formålet fokuserer vi på magnetisk nanopartikkelhypertermi (mNPH). Denne metoden tillater fokuserte, lokaliserte, godt overvåkede og kontrollerte temperaturendringer, ved bruk av giftfri, FDA-godkjent, jernoksid nanopartikler.
En fallgruve for andre hypertermimodaliteter er mangel på presis cellulær målretting; hypertermi har ikke et iboende høyt terapeutisk forhold, derfor er forsiktig termometri og målretting nødvendig6. mNPH tillater systemisk eller intratumoral injeksjon av mNPs, med varme som bare genereres der mNPene er lokalisert, og dermed målretter behandlingen direkte mot svulsten. mNPH kan være effektiv når de magnetiske nanopartiklene befinner seg i eller utenfor cellen. For kreftbehandling er den generelle oversikten over mNPH at de magnetiske nanopartiklene injiseres (intratumoralt eller intravenøst), deretter påføres et vekslende magnetfelt, noe som fører til at nanopartikkelens magnetiske poler hele tiden justeres, noe som fører til en lokalisert oppvarming av celler og vev assosiert med nanopartiklene 7,8 . Ved å justere volumet av nanopartikler og frekvensen / styrken til det vekslende magnetfeltet (AMF), er det mulig å nøye kontrollere temperaturen som genereres i vevet.
Denne behandlingen fungerer bra i svulster som er nær kroppsoverflaten, da dypere svulster krever sterkere AMF, slik at risikoen for virvelstrømoppvarming øker9. Det er tegn på at hypertermi brukes klinisk som monoterapi, men ofte kombineres hypertermi med strålebehandling eller kjemoterapi, noe som fører til en mer målrettet anti-kreft effekt10,11,12. Klinisk evidens for hypertermi i kombinasjon med strålebehandling er gjennomgått i en tidligere publikasjon13. Vårt laboratorium har vellykket behandlet en rekke dyr, fra mus til griser og spontane hundekreft, ved hjelp av mNPH-metoden12,14,15. Denne protokollen er designet for de som er interessert i å undersøke effekten av lokalisert hypertermibehandling, enten alene eller i kombinasjon med andre terapier.
En av de viktigste faktorene i hypertermi er å kunne måle og forstå, i sanntid, den termiske dosen som leveres til målet / tumorvevet. En standard måte å beregne og sammenligne dose på er gjennom demonstrasjon av de kumulative ekvivalente minuttene med oppvarming ved 43 °C; Denne algoritmen gjør det mulig å sammenligne doser uavhengig av leveringssystemet, maksimums- og minimumstemperaturer (innenfor et bestemt område) og oppvarmings- / nedkjølingsparametere 5,16. CEM-beregningen fungerer best for temperaturer mellom 39-57 °C5. For eksempel, i noen av studiene vi har utført, har vi valgt en termisk dose på CEM43 30 (dvs. 30 min ved 43 ° C). Ved å velge denne dosen kunne vi se på sikre, effektive immunogenetiske effekter in vitro, både alene og i kombinasjon med en enkelt stråledose17.
Med magnetisk nanopartikkel hypertermi er det flere faktorer som må vurderes ved bygging av et passende leveringssystem. Instrumenteringsdesignet inkluderer viktige sikkerhetsfaktorer, for eksempel bruk av en kjøler for å sikre at magnetfeltleveringsutstyret forblir kjølig selv når det drives med høy effekt, og feilsikre prosedyrer som forhindrer at systemet slås på hvis alle temperatur-, strømvurderings- og kontrollsystemer ikke er aktivert. I tillegg er det viktige biologiske faktorer som må vurderes for både in vivo og in vitro situasjoner. Ved bruk av dyrkede celler er det nødvendig å behandle i vekstmedier og opprettholde en konsistent levedyktig temperatur for å unngå fysiologiske endringer som kan påvirke resultatene. For individuelle nanopartikkeltyper er det viktig å kjenne den spesifikke absorpsjonshastigheten (SAR) ved beregning av AMF-baserte oppvarmingsparametere. På samme måte er det viktig å kjenne mNP/Fe-konsentrasjonen, i celler og vev, som er nødvendig for å oppnå ønsket oppvarming. In vivo-metoder krever enda mer oppmerksomhet på detaljer siden dyret må opprettholdes under anestesi under behandlingen og dyrets kjernekroppstemperatur opprettholdes på et normalt nivå gjennom hele behandlingen. Å tillate dyrets kroppstemperatur å falle, som skjer under anestesi, kan påvirke de samlede resultatene, med hensyn til den termiske dosen av vevet som behandles.
I dette manuskriptet diskuterer vi metodene som brukes til å designe og konstruere et allsidig magnetisk nanopartikkelhypertermisystem, samt viktige bruksfaktorer som må vurderes. Det beskrevne systemet muliggjør robust, konsistent, biologisk hensiktsmessig, sikker og godt kontrollert levering av magnetisk nanopartikkelhypertermi. Til slutt skal det bemerkes at mNPH-studiene vi utfører ofte involverer andre terapier som stråling, kjemoterapi og immunterapi. For at disse resultatene skal være meningsfulle, er det viktig å bestemme hvordan den leverte varmen kan påvirke effekten og / eller sikkerhetstoksisiteten til andre modaliteter (eller omvendt) og dyrets velvære. Av denne grunn og dosimetri og terapeutiske situasjoner som tidligere er nevnt, er det viktig å være oppmerksom på den magnetiske nanopartikkel hypertermi doseringsnøyaktighet og kontinuerlige kjerne- og måltemperaturmålinger. Målet med denne protokollen er å gi en enkel, konsistent metode og beskrivelse for levering av sikker og effektiv magnetisk nanopartikkel hypertermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dartmouth College Animal Care and Use Program er akkreditert av American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) og overholder alle UDSA og NIH (Office of Laboratory Animal Welfare) retningslinjer og forskrifter. Alle in vivo-studier ble godkjent av Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanasi-prosedyren overholder AVMA-retningslinjene for eutanasi av dyr fra 2020.
1. Instrumentering/design av systemet
- Design tilpasset AMF-antenne (spole) for å være en lukket sløyfe, og velg former for å skape ønsket magnetfelt. Bruk induktansformler og egenskaper fra valg av kraftgenerator for å designe kompatible spoler for å generere ønsket felt. Bruk forskjellige design for in vitro og in vivo eksperimenter.
- Forsikre deg om at AMF-antenneinduktansen faller innenfor det akseptable området til kraftgeneratoren. Legg til eller trekk fra kondensatorer for å matche (tune) antennen til strømgeneratoren.
- For in vitro-eksperimenter, design en 14-svings spiralformet spole, indre diameter 2 cm og lengde 14 cm, som kan inneholde 1,5 ml rør, noe som muliggjør behandling av flere prøver samtidig. Isoler spolen med en vinylpolymer og bruk et polystyren avstandsstykke for å skille spolen fra rørene. Detaljer om designspesifikasjon og hensyn er til stede i tilleggsfilen 1.
- For in vivo eksperimenter, skaff deg en spesialbygd helkroppsspiralspole fra en produsent med proprietær designinformasjon. Bruk 8 mm firkantede rør (da det skaper et mer jevnt felt innenfor spolens boring), og en konsentrator ved det målrettede behandlingsområdet. Gjør konsentratoren 5,0 cm lang, med totalt 5 omdreininger som gir en indre diameter på 3,6 cm, 5,2 cm ytre diameter, og ha sin plassering på det målrettede behandlingsområdet. Omgi spolen med et polykarbonatskall.
- Bruk en AMF-generator med justerbar effekt og frekvens, vurdert til 10 kW eller høyere som strømkilde. Induktans matcher strømkilden og antennene/spolene til et område på 0,62 til 1,18 μHenries (μH), noe som gir frekvenser mellom 30-300 kHz. Avkjøl generatoren med resirkulert vann gjennom en sentrifugalpumpe, trykkregulert til 50 psi.
- Avkjøl spolene med en kjøler på 5,6 tonn som pumper 25 % etylenglykolbasert varmeoverføringsvæske fortynnet med vann gjennom AMF-antennen. Still temperaturen på kjøleren slik at antennen ikke varmer eller avkjøler prøven.
- For dyrebegrensning, konstruer en rørformet holder som kan suspenderes i midten av spolen med et 0,5 cm luftgap mellom holderen og spoleoverflaten. Koble til en justerbar kondisjonert luftpumpe som sirkulerer luft gjennom skallet rundt spolen og sett den for å opprettholde en normal dyrekjernetemperatur. Koble anestesimaskinen til den rørformede dyreholderen nær dyrets hode for å sikre riktig levering av anestesi.
- For celleoppsamling, opprett et apparat som sirkulerer vann fra et vannbad gjennom avstandsstykket der rørene er plassert. Still temperaturen på dette vannbadet slik at rørene er omgitt av vann ved 37 °C.
- Bruk fiberoptiske sonder for å overvåke temperaturer i svulsten, dyrets kjerne og dyremiljøet eller for in vitro-studier, overvåking av temperaturen på cellepelleten og vannet rundt rørene.
- Bruk magnetiske jernoksid nanopartikler som er 100 nm i størrelse for alle eksperimenter.
MERK: Konsentrasjon og spesifikk absorpsjonshastighet (SAR) er to egenskaper som må vurderes ved valg av nanopartikler, da de direkte påvirker mulig oppvarming og termisk dose18.
2. Hypertermi in vitro
- Kultur B16F10 murine melanomceller i RPMI media med 10% FBS og 1% Penn / streptokokker. Plate 150 000 celler/brønn i 6-brønnsplater, med 2 ml komplett medium.
- Bestem riktig behandling for hver brønn, dvs. celler uten mNPs og ingen AMF, celler med mNPs og ingen AMF, celler uten mNPs og AMF, celler med mNPs og AMF.
I tillegg må du sørge for at det er passende kontroller hvis du kombinerer hypertermi med en annen behandling. AMF utføres i et standard forskningsbenklaboratorium ettermontert med de nødvendige strøm- og kjølefunksjonene. - 24 timer etter plating, legg til mNP i de aktuelle brønnene som bestemt i forrige trinn. Tilsett mNPs til en konsentrasjon på 3 mg jern/ml. Sørg for at mNP-ene fordeles i brønnen, enten ved å opprette en lagermedia/mNP-løsning (fjerne gamle medier, legge til denne løsningen) eller ved å tilsette mNP-ene direkte og forsiktig virvle plater for homogen fordeling.
- Begynn behandlingen, 48 timer etter tilsetning av mNPs, når brønner er ~ 80% sammenflytende, ved å fjerne media og vaske brønner med friske medier. Fjern mediet.
- Tilsett 0,5 ml trypsin til hver brønn som behandles, og virvle forsiktig. Bruk et mikroskop for å kontrollere at cellene er løsrevet.
- Tilsett 1 ml media til hver brønn for å samle cellene i 1,5 ml rør. Samle alle cellene fra brønnen (~ 1 x 106 celler). Bruk et tydelig merket separat rør for hver brønn.
- Spinnrør ved 60 x g i 2-3 minutter for å tillate celler å pelletere. Behold pelleten i mediet.
- Plasser rør i avstandsstykket fullt av vann i spolen. Still temperaturen på vannbadet slik at mediet og cellepelleten holdes ved 37 °C. Overvåk temperaturen i røret og vannbadet ved hjelp av separate fiberoptiske temperaturprober.
- Slå på kjøleren, kontroller at kjølevæsken strømmer gjennom spolen. Slå på strømkilden og juster prosentandelen av maksimalt til ønsket felt. Bruk 14-svings magnetspole, drevet av 10 kW generator, ved 165 kHz og 23,87 kA / m (300 Oe).
- Plasser en separat fiberoptisk temperatursonde i et av rørene. Behandle cellene til den tidligere bestemte protokollen termisk dose. Et eksempel er 30 min ved 43 °C (CEM43 av 30).
- Resuspend celler i mediet som er i deres rør og re-plate i nye 6 brønnplater. Merk de nye platene tydelig. Målet er å re-plate alle cellene samlet (~ 1 x 106 celler).
MERK: Nye 6 brønnplater skal brukes for å sikre at cellene som dyrkes får behandling. Hvis de gamle platene brukes, kan det fortsatt være celler igjen på platene som ikke ble trypsinisert. - Om nødvendig, for neste eksperimentelle prosedyre, lyse cellene for RNA eller proteinuttrykksanalyse.
3. Hypertermi in vivo
- Cellekultur og inokulasjon
- Kultur B16F10 murine melanomceller i RPMI media med 10% FBS og 1% Penn / streptokokker. Bruk tallerkener/tallerkener som gir nok celler til inokulering av ønsket antall dyr. For eksempel vil 10.100 mm retter, belagt med 100.000 celler, være sammenflytende med nok celler til 20 musinjeksjoner innen 48 timer.
- Trypsinize celler og samle ved hjelp av rene RPMI media (ingen FBS eller penn / strep).
- Tell celler og lag en løsning for ønsket konsentrasjon av celler, basert på inokulasjonsvolumet og musetall.
- Bedøv 6 uker gamle kvinnelige C57Bl / 6 mus ved hjelp av fordampet isofluran og oksygen. Plasser dyr i en pleksiglassboks med 5% isofluran og 95% oksygen til indusert. Når det er indusert, fjern dyr og bruk en ansiktskjegle ved 2 % isofluran for å fullføre trinn 3.1.5-3.1.7 og 3.3.3-3.3.6.
MERK: For anestesi under behandlingen bruk en innebygd anestesi inneslutning. Følg standard institusjonelle protokoller for musebedøvelse. Før dyreforsøk sikre riktig IACUC godkjenning. Etter anestesi, returner dyret til buret og overvåk utvinningen for å sikre ingen komplikasjoner. - Sjekk for manglende respons på høyrerefleksene.
- Barber høyre flanke ved hjelp av en barbermaskin.
- Rengjør injeksjonsområdet med en spritkompress. Injiser 1-2 x 106 celler, ved hjelp av en 100 μL glasssprøyte med en 28 G nål, dispergert i 50 μL media intradermalt på den barberte høyre flanken av bedøvet.
- Tumorvekst/Nanopartikkelinjeksjon
- Mål svulster i 3 dimensjoner ved hjelp av kalipere (lengde, bredde og dybde), og beregn volumer med (lengde x bredde x dybde x π)/6.
- Når tumorvolumene når 120 mm 3 (+/- 20 mm3), plasser dyrene på studien. Design studien slik at det er passende kontroll- og behandlingsgrupper, inkludert kombinasjonsbehandlingskohorter (dvs. kontroll, mNPH, stråling og kombinasjonen).
- Bedøv mus som vil motta mNPs som beskrevet i 3.1.4.
- Rengjør området med en spritserviett. Injiser mNPs i svulsten 3 timer før AMF-behandling. Injiser et volum slik at dosen er 7,5 mg jern/cm3 svulst.
MERK: Upubliserte data fra laboratoriet antyder at maksimalt mNP-opptak skjer ved 3-6 timer.
- AMF-behandling
- Bedøv musen og legg på en varmepute for å opprettholde kjernetemperaturen.
- Sjekk for manglende respons på høyrerefleksene. Fjern øremerket eller andre metallgjenstander på musen.
- Legg forsiktig en lubed fiberoptisk temperatursonde inn i endetarmen på musen.
- Plasser et kateter inn i svulsten, fjern nålen. Klipp kateteret slik at det ikke stikker ut av svulsten for mye.
NOTAT: De fiberoptiske temperaturkatetrene plasseres og fjernes mens musene er under generell anestesi, dvs. katetrene er bare på plass under tumoroppvarmingsprosedyren. Mus får en enkelt subkutan dose av en NSAID analgesi medisinering, ketoprofen (5 mg / kg), på tidspunktet for prosedyren. Vi har ikke observert kortvarig eller langvarig ubehag eller sykelighet knyttet til plassering av katetrene. - Sett inn en 3-sensor fiberoptisk temperatursonde i kateteret. Kateteret beskytter de fiberoptiske temperatursondesensorene.
- Tape rektal og intratumoral sonde til dyrets hale for å sikre at de forblir på plass.
- Plasser musen i et 50 ml rør, hodet til bunnen. Røret skal ha et hull i nærheten av hodet der anestesien skal kobles til og leveres.
- Plasser røret i spoleoppsettet og koble til anestesien igjen.
- Plasser en fiberoptisk temperatursonde løst inn i røret for å måle miljøtemperaturen.
- Slå på kjøleren, og sørg for at kjølevæsken sirkuleres.
- Kontroller og sørg for at dataprogramvaren viser de forskjellige temperaturene, og begynn å ta opp slik at en CEM43-beregning kan vises i sanntid. Den nødvendige CEM43 er dosen som tidligere er bestemt.
NOTAT: Før magneten slås på, må du sørge for at ingen metallgjenstander er festet til dyret, da disse vil varme raskt. I tillegg må du sørge for at alle i rommet ikke har pacemaker, og det er trygt for dem å være der. - Slå på magneten med lav effektprosent.
- Forsikre deg om at de fiberoptiske temperaturprobene registrerer temperaturendringer. Temperaturen vil øke når AMF er aktivert når feltet øker. Sørg for at dyrets kjernetemperatur forblir ved 38 °C. Reguler kjernetemperaturen ved hjelp av den kondisjonerte luftkappen.
- Juster styrken på magnetfeltet ved å endre strømmen på generatoren, ved hjelp av den innebygde kontrollhjulet, som igjen styrer temperaturnivået i svulsten.
- Slå av AMF når ønsket dose, som tidligere bestemt av brukeren (for eksempel CEM43 40), oppnås i svulsten.
- Når AMF er slått av, fjern røret fra spolen.
- Fjern musen fra røret, trekk ut de forskjellige sonder og kateter. Om nødvendig, merk dyret med en ny metalløremerke.
- Når behandlingene er fullført, slå av kjøleren.
- Gjenopprett dyrene fra anestesi og sørg for ingen komplikasjoner. Overvåk deres oppførsel for å sikre retur til normal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro studier
Celler vil bare oppnå og opprettholde ønsket temperatur og termisk dose hvis mengden og konsentrasjonen av magnetiske nanopartikler / jern og AMF er riktig tilpasset. Ved bruk av magnetiske nanopartikler til å varme celler in vitro (og in vivo), bør det bemerkes at for å oppnå hypertermi i celler med internaliserte magnetiske nanopartikler, vil et bestemt nivå av intracellulær mNP / Fe være nødvendig, og antall og nærhet av mNP-lastede celler, til hverandre, vil være nødvendig. Hvis nivået av mNP/Fe i målcellene/vevet er tilstrekkelig til å oppnå en oppvarmingseffekt, kan magnetfeltfrekvensen og styrken justeres for å oppnå ønsket temperatur og effekter. Hvis belagt riktig, kan videre studier som ser på genetiske og molekylære forskjeller mellom forskjellige doser og tidspunkter forfølges17. Figur 1 representerer et skjema over in vitro-metodene.
Disse in vitro-metodene kan brukes til å undersøke cellulær mRNA og proteinuttrykksendring. Et nylig eksempel fra laboratoriet vårt bestemte immunogenetiske forskjeller etter CEM43 30 mNPH-behandling, en 8 Gy-strålebehandling og kombinasjonen. Vi var i stand til å identifisere likheter og forskjeller i uttrykk på tvers av immun- og cytotoksiske veier for å få en bedre forståelse av mekanismen bak effektene, og hvordan de kombinerer synergistisk17. Hvert eksperiment benytter en rekke miljø- og oppvarmede kontrollprøver. Kontrollene vil ha forskjellige mRNA- og proteinuttrykksnivåer sammenlignet med de som får hypertermibehandling.
In vivo studier
I in vivo-studier er det flere hensyn. Uavhengig av mål termisk dose er det helt avgjørende å opprettholde en fysiologisk akseptabel kjernetemperatur i dyret som behandles. Dette kan være utfordrende med gnagere under anestesi, da kjernetemperaturen raskt kan gå tapt (kjernetemperaturmodulerende teknikker som varmeputer er ofte nødvendige). Lavere kroppstemperaturer enn normalt kan nødvendiggjøre behovet for å presse AMF-mNPH for langt, når man prøver å oppnå en bestemt termisk dose i svulsten, noe som resulterer i uakseptable effekter i ikke-målvevet (ikke-målvev virvelstrømoppvarming er en slik mulighet). Selv mindre avvik i kjerne kroppstemperatur kan føre til uønskede fysiologiske komplikasjoner i svulsten eller normalt vev. Som nevnt tidligere, men verdt å gjenta, for nøyaktig, reproduserbar oppvarming, er det viktig å oppnå en kamp mellom mNP / Fe vevskonsentrasjon, AMF-frekvens og parametere for temperaturovervåking av feltstyrke og målvevsstørrelse og dybde. Det må være en baseline konsentrasjon av mNPs i svulsten for å tillate målbar oppvarming. Nivået / evnen til varme avhenger ikke bare av mNP-vevskonsentrasjon (mg Fe / g-vev) og deres relative fordeling i svulsten, men også frekvensen av AMF og påfølgende feltstyrke. Endringer i noen av de ovennevnte kan føre til forskjellige områder av oppnåelige temperaturer i vevet. Gjennom mange års erfaring har vi optimalisert konsentrasjonen vi bruker for prekliniske tumorbehandlinger og frekvensen og feltstyrken til AMF-systemet for å muliggjøre sikker og effektiv aktivering. Fordi det er umulig å måle temperatur/termisk dose i alle vevssteder, er det også viktig å plassere så mange fiberoptiske temperaturprober som mulig på strategiske steder som muliggjør sanntids effekt- og sikkerhetsvurdering, som vist i figur 2. Disse sondene tillater registrering av temperaturer gjennom hele eksperimentet, noe som muliggjør nøyaktig dosimetri og termisk historie av eksperimentet. Figur 3 demonstrerer kurver generert under et in vivo-eksperiment, og fremhever evnen til å overvåke temperaturen nøye og justere systemet for å opprettholde tumortemperaturer innenfor ønsket område. Figur 4 oppsummerer in vivo-metodene.
Disse in vivo-metodene, som ligner på in vitro-metodene, kan brukes til å undersøke forskjellige krefttyper, forskjellige hypertermidoser og med ulike kombinasjonsbehandlinger. For eksempel har tidligere studier i vårt laboratorium undersøkt kombinasjonen av hypertermi og kjemoterapi12. Vi har også gjennomført en rekke hypertermi- og strålingseksperimenter for bestemmelse av effekt og molekylære mekanismer. Kontrollmusene for disse forsøkene gjennomgår alle prosedyrer bortsett fra den faktiske genereringen av hypertermi. Figur 5 inneholder to vulkanplott som viser differensielt uttrykte gener etter in vitro og in vivo mNP hypertermibehandling(mNPH). Disse tallene er eksempler på hvordan vi bruker molekylære teknikker for å overvåke hypertermieffektene.
Figur 1: In vitro mNP hypertermi skjematisk. Dette skjemaet demonstrerer metoden for in vitro magnetisk nanopartikkel hypertermi. For å sikre at oppvarming skjer, må cellene tilføres nok partikler og tid til tilstrekkelig mNP-opptak. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plassering av katetre for temperaturovervåking. Denne figuren viser plasseringen av katetre som huser de fiberoptiske temperaturprobene for å registrere temperaturer på forskjellige steder i svulsten og / eller tumorområdet. Dette tallet er tilpasset fra ref.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Temperaturovervåking i sanntid under behandling av musetumor. Denne grafen demonstrerer sanntidstemperaturavlesningene som gjør det mulig å overvåke kjernekroppstemperaturen, miljøtemperaturene og flere temperaturer i svulsten, under et in vivo-eksperiment. Kontrollen av temperaturer i svulsten er demonstrert gjennom de minimale store variasjonene på zoomet i delen av figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vivo mNP hypertermi skjematisk. Dette skjemaet demonstrerer metoden for in vivo magnetisk nanopartikkel hypertermi. Injeksjon av tilstrekkelige nanopartikler samt nok tid til distribusjon og absorpsjon, sikrer evnen til å levere ønsket termisk dose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Differensial genuttrykk. Differensiell genuttrykk etter in vitro (A) og in vivo (B) mNP hypertermibehandling. Disse vulkanplottene representerer genetiske endringer på en log 2 x-akse, med betydning på y-aksen, for både in vitro og in vivo mNPH-metoder. Hver sirkel representerer et annet gen, med de 20 mest signifikante differensielt uttrykte gener merket. Jo lenger genet er fra null på x-aksen, jo større foldeendring, og jo høyere genet er på y-aksen, desto lavere er p-verdien. Selv om begge hadde samme termiske dose, førte in vivo hypertermi til større genuttrykksendringer enn in vitro. Disse plottene er eksempler på de biologiske dataene som kan genereres ved hjelp av protokollen som er beskrevet. In vitro vulkanplottet er tilpasset fra ref.17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utformingen og implementeringen av dette systemet gir muligheten til å utføre nøyaktige og reproduserbare in vitro og in vivo magnetiske nanopartikkel hypertermi eksperimenter. Det er kritisk at systemet er utformet slik at AMF-frekvensen og feltstyrken er tilstrekkelig tilpasset den magnetiske nanopartikkeltypen, konsentrasjonen og vevsplasseringen og temperaturen som ønskes. I tillegg er nøyaktig overvåking av temperaturen i sanntid avgjørende for sikkerhet og beregning av en nøyaktig termisk dose (kumulative ekvivalente minutter ved 43 ° C / CEM). Plasseringen av sonder som vist i figur 1, muliggjør sanntidsovervåking av termisk dose og kjernekroppstemperatur som vist i figur 2.
Det første trinnet i nøyaktig levering av magnetisk nanopartikkel hypertermi er å bygge et trygt system for dyr og operatører. Alle komponenter i systemet bør også forstås godt fra et drifts- og leveringssynspunkt. I denne situasjonen betyr det å forstå potensialet for AMF virvelstrømmer og vite hvor magnetiske partikler befinner seg. Antennene eller spolene er en nøkkelfaktor i feltets form og styrke, og kjølesystemet som brukes er viktig for å forhindre overoppheting av spolen20. Feltstyrken utenfor lederen er direkte proporsjonal med strømstyrken som strømmer gjennom lederen. Magnetfeltstyrken på et hvilket som helst punkt i rommet rundt lederen er vektorsummen av feltene produsert av lederne i det omkringliggende området. Magnetfeltet produseres i rett vinkel mot strømmen og styrken avtar eksponentielt, som en funksjon av avstanden fra lederen, i henhold til Biot-Savart invers kvadratregel21. Dermed brukes firkantede rør til in vivo hypertermi for et mer jevnt felt i spolen. Å skape et magnetfelt med styrken og volumet som trengs for et potensielt klinisk relevant system, krever en høy elektrisk strøm. Derfor må antennedesign kunne imøtekomme betydelige elektriske effektnivåer. AMF-antenner må også utformes slik at induktansen faller innenfor det akseptable området til kraftgeneratoren. Ved frekvensene som vanligvis brukes, er det meste av strømmen på overflaten av antennelederen, noe som betyr at overflaten påvirker resistiv oppvarming som kan minimeres ved å eliminere overflatefeil. Denne resistive oppvarmingen betyr også at et spolekjølesystem er nødvendig for å sikre at spolen og miljøet ikke overopphetes.
En begrensning av vårt systemdesign er at det ikke tillater et totalt utvalg av frekvenser og magnetfelt, men det tillater at felt genereres som passer for celler, gnagere og store dyr. Spesielt er den maksimale feltstyrken som er tilgjengelig fra et hvilket som helst induksjonsvarmesystem direkte relatert til strømmen i antennen (spolen). AMF-generatorer er vurdert i kilowatt, som beregnes ved å multiplisere den tilgjengelige spenningen med den tilgjengelige strømmen (ampere). Så, et 10kW-system med en 500 V-grense vil ha en maksimal strømstyrke på 20 A. Spoledesignet vil bestemme hvilken grense som nås først, og dermed systemgrensen. Magnetfeltstyrken skapt av en hvilken som helst strøm reduseres eksponentielt som en funksjon av avstanden fra lederen. Derfor vil en spole med større diameter med samme geometri som en spole med mindre diameter, kjørt på samme system, ha en lavere feltstyrke i midten av spolen. Dermed er den nødvendige magnetfeltstørrelsen og styrken begrenset av kapasiteten til AMF-generatoren. Å bygge en større spole og bruke mer strøm fører til ytterligere bekymringer, først og fremst virvelstrømoppvarming.
Det er flere sikkerhetsproblemer som må tas opp når du bruker dette systemet for å beskytte brukere, dyr og selve systemet. For det første må tilstrekkelig romventilasjon opprettholdes under bruk av anestesi. For det andre må alle områder knyttet til spolen være fri for metall og eller ledere, inkludert høye saltblandinger. Brukere må fjerne ringer og andre smykker når de arbeider rundt AMF, og prøver skal ikke inneholde noen form for metall. Av største betydning bør personer med pacemakere eller andre implanterte enheter eller gjenstander konsultere legen sin før de jobber rundt AMF. For å beskytte systemet bør det brukes et feilsikkert system som sikrer at generator- og spolekjølingsbehovet oppfylles før strømmen påføres. I tillegg bør en termisk kameraoversikt brukes til å oppdage utilsiktet oppvarming.
For in vitro-studier er de viktigste trinnene som skal følges konsentrasjonen av jern i celler, konsentrasjonen av celler, AMF-parametere og termisk dosevurdering. Celler kan behandles / oppvarmes med magnetisk nanopartikkel hypertermi ved å plassere magnetiske nanopartikler i supernatant, celler eller begge deler. Mengden magnetisk nanopartikkeloppvarming vil avhenge av nivået av magnetiske nanopartikler / Fe. Hvis ønsket er å behandle kun celler med internalisert jern, er vår erfaring at individuelle kreftceller bare vil ta opp et begrenset antall magnetiske nanopartikler og at selv når opptaket er optimalt, må cellene aggregeres/pelleteres for å skape celleoppvarmingssituasjon, selv med optimalisert AMF. Å opprettholde temperaturen på mediet og cellene på biologisk relevante nivåer (når de ikke varmes opp) er også viktig for nøyaktig måling av ekte oppvarming. Den 14-svings solenoidspolen som er beskrevet her, gjør det mulig å opprettholde biologisk relevante temperaturer ved å senke prøvene i en termisk kontrollert vannkolonne.
For in vivo-studiene er opprettholdelse av dyrets kjernetemperatur og nøyaktig måling av temperaturen i svulsten nøkkelfaktorer. Dette inneslutningssystemet og utformingen av spolen eliminerer termisk drift i dyrets miljø på grunn av spole / kraftinnstillinger og bidrar til å opprettholde normal kjernekroppstemperatur. Opprettholdelse av kroppstemperaturen er avgjørende for meningsfulle eksperimentresultater. Rektalsonden muliggjør sanntidsovervåking av dyrets kjernetemperatur. Når det er under anestesi, reduseres et dyrs kjernetemperatur iboende. For å møte denne situasjonen utviklet vi et miljøvarmesystem som leverer varm luft rundt dyrebeholderen, slik at kjernetemperaturen holder seg i det normale området. Opprettholde normal kjernetemperatur er avgjørende for å sikre nøyaktig tolkning av hypertermi behandlingsresultater, og eliminering av miljøfaktorer. Plasseringen av temperaturovervåkingssondene på flere steder i målvevet/svulsten er viktig for å få en nøyaktig vurdering av oppnådd temperatur og termisk dose. Fordi det er ekstremt vanskelig om ikke umulig å distribuere magnetiske nanopartikler homogent i en svulst, er det viktig å vite oppvarmingsparametrene på flere steder for å oppnå en konsistent og nøyaktig vev / tumor termisk dose. Det er viktig å merke seg at konsentrasjonen for in vitro og in vivo studier er variabel. Denne variasjonen skyldes at det er færre grenser i cellekultur med celler som har mer tilgang til mNPs, slik at en lavere konsentrasjon kan brukes. In vivo er en høyere konsentrasjon nødvendig på grunn av svulstens heterogene natur og den kompliserte 3D-morfologien. Derfor vil bruk av samme konsentrasjon av partikler in vivo og in vitro føre til at langt færre blir tatt opp av celler.
Dette manuskriptet beskriver parametrene og instrumenteringen som er nødvendig for å utvikle en effektiv og fleksibel vekslende magnetfeltgenerator og spolesystem for magnetisk nanopartikkelhypertermibehandling. Dette systemet kan brukes til både in vitro og in vivo studier. Systemet er effektivt for lokalisert / målrettet hypertermi og sparing av normalt vev, noe som gjør det tiltalende, sammenlignet med andre AMF-mNP hypertermisystemer. Disse hypertermibehandlingene kan endres for å undersøke effekten av forskjellige doser, med en rekke nanopartikler eller nanobærere og tilleggsbehandlinger. Siden vevsoppvarming, spesielt magnetisk nanopartikkeloppvarming, kan påvirkes av så mange variabler, er det viktig å forstå parametrene i en undersøkelse. Hvis disse kriteriene er oppfylt, kan magnetisk nanopartikkelhypertermi adressere mange molekylære, cellulære og kliniske situasjoner, inkludert uavhengig og adjuvant tumorkontroll. Selv om metodene beskrevet her krever betydelig innsats, hvis retningslinjene følges, kan det fulle potensialet for mNP-hypertermi realiseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble finansiert av tilskuddsnummer: NCI P30 CA023108 og NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
