Summary
Ce protocole présente les techniques et la méthodologie nécessaires à l’administration précise de l’hyperthermie des nanoparticules magnétiques à l’aide d’un système sophistiqué de livraison et de surveillance.
Abstract
L’hyperthermie a longtemps été utilisée dans le traitement du cancer. Les techniques ont varié de l’insertion intratumorale de tiges de fer chaudes, aux nanoparticules magnétiques ciblées par anticorps tumoral administrés par voie systémique, à des températures de 39 ° C (niveau de fièvre) à 1 000 ° C (électrocautérisation) et des temps de traitement de quelques secondes à quelques heures. La relation température-temps (dose thermique) dicte l’effet avec des doses thermiques élevées entraînant l’ablation des tissus et des doses thermiques plus faibles entraînant des effets sublétaux tels que l’augmentation du flux sanguin, l’accumulation de médicaments et la stimulation immunitaire. L’une des thérapies médicales actuelles les plus prometteuses est l’hyperthermie magnétique par nanoparticules (mNPH). Cette technique consiste à activer des nanoparticules magnétiques, qui peuvent être délivrées par voie systémique ou intratumorale, avec un champ magnétique alternatif non invasif et non toxique. La taille, la construction et l’association des nanoparticules magnétiques ainsi que la fréquence et l’intensité du champ magnétique sont des déterminants majeurs de l’échauffement. Nous avons développé des instruments et des techniques sophistiqués pour fournir une hyperthermie de nanoparticules magnétiques reproductibles dans des modèles animaux de grande et de petite taille et des cellules en culture. Cette approche, utilisant une surveillance continue et en temps réel de la température à plusieurs endroits, permet d’administrer des doses thermiques bien définies au tissu cible (tumeur) ou aux cellules tout en limitant le chauffage des tissus non ciblés. Le contrôle et la surveillance précis de la température, sur plusieurs sites, et l’utilisation de l’algorithme standard de l’industrie (minutes équivalentes cumulées à 43 °C / CEM43), permettent une détermination et une quantification précises de la dose thermique. Notre système, qui permet une grande variété de températures, de doses thermiques et d’effets biologiques, a été développé grâce à une combinaison d’acquisitions commerciales et de développements internes en ingénierie et en biologie. Ce système a été optimisé de manière à permettre la conversion rapide entre les techniques ex vivo, in vitro et in vivo. L’objectif de ce protocole est de démontrer comment concevoir, développer et mettre en œuvre une technique et un système efficaces pour administrer une hyperthermie reproductible et précise de thérapie par nanoparticules magnétiques (NPm).
Introduction
L’hyperthermie a toujours été utilisée dans le traitement du cancer, seule ou en combinaison avec d’autres traitements. Bien qu’il ait une longue histoire d’utilisation, la méthode la plus avantageuse pour administrer ce traitement fait encore l’objet de débats et dépend du site et de l’emplacement de la maladie. Les méthodes d’administration hyperthermique comprennent les micro-ondes, la radiofréquence, les ultrasons focalisés, le laser et les nanoparticules métalliques (comme l’or ou l’oxyde de fer)1,2,3,4. Ces méthodes d’administration peuvent conduire à une gamme de températures de traitement allant du niveau de fièvre à des centaines de degrés C. L’effet biologique de l’hyperthermie dépend principalement des températures utilisées et de la durée du traitement5. Pour ce manuscrit et à cette fin, nous nous concentrons sur l’hyperthermie des nanoparticules magnétiques (mNPH). Cette méthode permet des changements de température ciblés, localisés, bien surveillés et contrôlés, en utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer non toxiques et approuvées par la FDA.
L’un des pièges des autres modalités d’hyperthermie est le manque de ciblage cellulaire précis; L’hyperthermie n’a pas un rapport thérapeutique intrinsèquement élevé, par conséquent, une thermométrie et un ciblage minutieux sont nécessaires6. mNPH permet l’injection systémique ou intratumorale de mNPs, la chaleur n’étant générée que là où se trouvent les mNPs, ciblant ainsi le traitement directement sur la tumeur. mNPH peut être efficace lorsque les nanoparticules magnétiques sont situées à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule. Pour le traitement du cancer, l’aperçu général de mNPH est que les nanoparticules magnétiques sont injectées (intratumorales ou intraveineuses), puis un champ magnétique alternatif est appliqué, provoquant le réalignement constant des pôles magnétiques des nanoparticules, conduisant à un échauffement localisé des cellules et des tissus associés aux nanoparticules 7,8 . En ajustant le volume de nanoparticules et la fréquence/force du champ magnétique alternatif (CMA), il est possible de contrôler soigneusement la température générée dans le tissu.
Ce traitement fonctionne bien dans les tumeurs qui sont près de la surface du corps, car les tumeurs plus profondes nécessitent des CMA plus fortes, de sorte que le risque de chauffage par courants de Foucault augmente9. Il existe des preuves que l’hyperthermie est utilisée cliniquement en monothérapie, cependant, l’hyperthermie est souvent associée à la radiothérapie ou à la chimiothérapie, ce qui entraîne un effet anticancéreux plus ciblé10,11,12. Les preuves cliniques de l’hyperthermie en association avec la radiothérapie sont examinées dans une publication précédente13. Notre laboratoire a traité avec succès une variété d’animaux, des souris aux porcs et aux cancers canins spontanés, en utilisant la méthode mNPH12,14,15. Ce protocole est conçu pour ceux qui souhaitent étudier les effets du traitement de l’hyperthermie localisée, seul ou en combinaison avec d’autres thérapies.
L’un des facteurs les plus importants de l’hyperthermie est de pouvoir mesurer et comprendre, en temps réel, la dose thermique délivrée au tissu cible / tumoral. Une méthode standard de calcul et de comparaison de la dose consiste à démontrer les minutes équivalentes cumulées de chauffage à 43 °C; Cet algorithme permet de comparer les doses indépendamment du système d’administration, des températures maximales et minimales (dans une plage spécifique) et des paramètres de chauffage et de refroidissement 5,16. Le calcul CEM fonctionne mieux pour des températures comprises entre 39 et 57 °C5. Par exemple, dans certaines des études que nous avons réalisées, nous avons choisi une dose thermique de CEM43 30 (c.-à-d. 30 min à 43 °C). Le choix de cette dose nous a permis d’examiner un effet immunogénétique sûr et efficace in vitro, à la fois seul et en combinaison avec une dose unique de rayonnement17.
Avec l’hyperthermie magnétique par nanoparticules, plusieurs facteurs doivent être pris en compte dans la construction d’un système d’administration approprié. La conception de l’instrumentation comprend des facteurs de sécurité importants, tels que l’utilisation d’un refroidisseur pour s’assurer que l’équipement de distribution de champ magnétique reste froid même lorsqu’il fonctionne à haute puissance, et des procédures à sécurité intégrée qui empêchent le système d’être allumé si tous les systèmes de température, d’évaluation de la puissance et de contrôle n’ont pas été activés. En outre, il existe des facteurs biologiques importants qui doivent être pris en compte pour les situations in vivo et in vitro. Lors de l’utilisation de cellules en culture, il est nécessaire de traiter dans un milieu de croissance et de maintenir à une température viable constante pour éviter les changements physiologiques qui pourraient affecter les résultats. Pour les types de nanoparticules individuels, il est important de connaître le débit d’absorption spécifique (DAS) lors du calcul des paramètres de chauffage basés sur les CMA. De même, il est important de connaître la concentration de mNP/Fe, dans les cellules et les tissus, qui est nécessaire pour obtenir le chauffage souhaité. Les méthodes in vivo nécessitent encore plus d’attention aux détails puisque l’animal doit être maintenu sous anesthésie pendant le traitement et que la température corporelle centrale de l’animal doit être maintenue à un niveau normal tout au long du traitement. Laisser baisser la température corporelle de l’animal, comme c’est le cas sous anesthésie, peut affecter les résultats globaux, en ce qui concerne la dose thermique du tissu traité.
Dans ce manuscrit, nous discutons des méthodes utilisées pour concevoir et construire un système polyvalent d’hyperthermie par nanoparticules magnétiques, ainsi que des facteurs d’utilisation importants qui doivent être pris en compte. Le système décrit permet l’administration robuste, cohérente, biologiquement appropriée, sûre et bien contrôlée de l’hyperthermie par nanoparticules magnétiques. Enfin, il convient de noter que les études mNPH que nous menons impliquent souvent d’autres thérapies telles que la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie. Pour que ces résultats soient significatifs, il est important de déterminer comment la chaleur délivrée peut affecter l’efficacité et/ou la sécurité-toxicité d’autres modalités (ou vice versa) et le bien-être de l’animal. Pour cette raison et les situations de dosimétrie et thérapeutiques mentionnées précédemment, il est essentiel de porter une attention particulière à la précision du dosage de l’hyperthermie magnétique des nanoparticules et aux mesures continues de la température du cœur et de la cible. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode et une description simples et cohérentes pour l’administration d’une hyperthermie de nanoparticules magnétiques sûre et efficace.
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Protocol
Le programme de soin et d’utilisation des animaux du Collège Dartmouth est accrédité par l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) et adhère à toutes les lignes directrices et réglementations de l’UDSA et du NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Toutes les études in vivo ont été approuvées par le Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La procédure d’euthanasie est conforme aux directives 2020 de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux.
1. Instrumentation/conception du système
- Concevez une antenne AMF personnalisée (bobine) pour être une boucle fermée, en choisissant des formes pour créer le champ magnétique souhaité. Utilisez les formules d’inductance et les caractéristiques du choix du générateur de puissance pour concevoir des bobines compatibles afin de générer le champ souhaité. Utilisez différents modèles pour les expériences in vitro et in vivo.
- Assurez-vous que l’inductance de l’antenne AMF se situe dans la plage acceptable du groupe électrogène. Ajoutez ou soustrayez des condensateurs pour faire correspondre (accorder) l’antenne au générateur de puissance.
- Pour les expériences in vitro, concevoir une bobine hélicoïdale à 14 tours, diamètre intérieur 2 cm et longueur 14 cm, pouvant contenir des tubes de 1,5 mL, permettant le traitement simultané de plusieurs échantillons. Isolez la bobine avec un polymère vinylique et utilisez un espaceur en polystyrène pour séparer la bobine des tubes. Les détails des spécifications de conception et des considérations sont présents dans le dossier supplémentaire 1.
- Pour les expériences in vivo, acquérir une bobine hélicoïdale du corps entier construite sur mesure auprès d’un fabricant disposant d’informations de conception exclusives. Utilisez un tube carré de 8 mm (car il crée un champ plus uniforme dans l’alésage de la bobine) et un concentrateur dans la zone de traitement ciblée. Faites le concentrateur de 5,0 cm de long, avec un total de 5 tours résultant en un diamètre intérieur de 3,6 cm, 5,2 cm de diamètre extérieur, et ayez son emplacement dans la zone de traitement ciblée. Entourez la bobine d’une coque en polycarbonate.
- Utilisez une génératrice AMF avec puissance et fréquence réglables, évaluée à 10 kW ou plus comme source d’alimentation. L’inductance correspond à la source d’alimentation et aux antennes/bobines dans une plage de 0,62 à 1,18 μHenries (μH), ce qui permet des fréquences comprises entre 30 et 300 kHz. Refroidir le générateur en utilisant de l’eau recyclée grâce à une pompe de gavage centrifuge, pression régulée à 50 psi.
- Refroidissez les serpentins avec un refroidisseur de capacité de refroidissement de 5,6 tonnes qui pompe un fluide caloporteur à base d’éthylène glycol à 25 % dilué avec de l’eau à travers l’antenne AMF. Réglez la température du refroidisseur de manière à ce que l’antenne ne chauffe ni ne refroidisse l’échantillon.
- Pour le confinement des animaux, construire un support tubulaire qui peut être suspendu au centre de la bobine avec un espace d’air de 0,5 cm entre le support et la surface de la bobine. Connectez une pompe à air climatisée réglable qui fait circuler l’air à travers la coque autour de la bobine et réglez-la pour maintenir une température centrale normale chez l’animal. Connectez l’appareil d’anesthésie au porte-animal tubulaire près de la tête de l’animal pour assurer une bonne administration de l’anesthésie.
- Pour le confinement des cellules, créez un appareil qui fait circuler l’eau d’un bain-marie à travers l’espaceur où les tubes sont placés. Réglez la température de ce bain-marie de telle sorte que les tubes soient entourés d’eau à 37 °C.
- Utilisez des sondes à fibres optiques pour surveiller les températures dans la tumeur, le noyau de l’animal et l’environnement animal ou pour des études in vitro, la surveillance de la température de la pastille cellulaire et de l’eau entourant les tubes.
- Utilisez des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer d’une taille de 100 nm pour toutes les expériences.
NOTE: La concentration et le débit d’absorption spécifique (DAS) sont deux caractéristiques qui doivent être prises en compte lors du choix des nanoparticules, car elles affectent directement la dose de chauffage et thermique possible18.
2. Hyperthermie in vitro
- Culture de cellules de mélanome murin B16F10 dans un milieu RPMI avec 10% FBS et 1% Pen/streptocoque. Plaque 150 000 cellules/puits dans des plaques à 6 puits, avec 2 mL de milieu complet.
- Déterminer le traitement approprié pour chaque puits, c.-à-d. cellules sans NP et sans CMA, cellules sans NPm et sans CMA, cellules sans NPm et CMA, cellules sans NPm et CMA.
REMARQUE: De plus, assurez-vous qu’il existe des contrôles appropriés si vous combinez l’hyperthermie avec un autre traitement. L’AMF est réalisée dans un laboratoire de banc de recherche standard équipé des capacités d’alimentation et de refroidissement nécessaires. - 24 h après le placage, ajouter les NP aux puits appropriés, comme déterminé à l’étape précédente. Ajouter des mNPs à une concentration de 3 mg de fer/mL. S’assurer que les mNP sont répartis dans tout le puits, soit en créant une solution stock/mNP (retrait des anciens milieux, ajout de cette solution), soit en ajoutant les mNP directement et en faisant doucement tourbillonner les plaques pour une distribution homogène.
- Commencer le traitement, 48 h après l’ajout de mNPs, lorsque les puits sont ~80% confluents, en retirant le média et en lavant les puits avec du fluide frais. Retirez le support.
- Ajouter 0,5 mL de trypsine à chaque puits traité et agiter doucement. Utilisez un microscope pour vérifier que les cellules sont détachées.
- Ajouter 1 mL de média à chaque puits pour recueillir les cellules dans des tubes de 1,5 mL. Recueillir toutes les cellules du puits (~1 x 106 cellules). Utilisez un tube séparé clairement étiqueté pour chaque puits.
- Faire tourner les tubes à 60 x g pendant 2-3 min pour permettre aux cellules de s’enrober. Conservez la pastille dans le média.
- Placez les tubes dans l’intercalaire remplis d’eau à l’intérieur de la bobine. Régler la température du bain-marie de telle sorte que le média et la pastille de la cellule soient maintenus à 37 °C. Surveillez la température dans le tube et le bain-marie à l’aide de sondes de température à fibre optique séparées.
- Allumez le refroidisseur, vérifiez que le liquide de refroidissement circule dans le serpentin. Allumez la source d’alimentation et réglez le pourcentage de maximum au champ souhaité. Faire fonctionner la bobine solénoïde à 14 tours, alimentée par un générateur de 10 kW, à 165 kHz et 23,87 kA/m (300 Oe).
- Placez une sonde de température à fibre optique séparée dans l’un des tubes. Traiter les cellules jusqu’à la dose thermique du protocole préalablement déterminée. Un exemple est 30 min à 43 °C (CEM43 sur 30).
- Resuspendre les cellules dans le milieu qui se trouve dans leurs tubes et re-plaquer dans de nouvelles plaques de 6 puits. Étiquetez clairement les nouvelles plaques. L’objectif est de re-plaquer toutes les cellules collectées (~1 x 106 cellules).
REMARQUE : De nouvelles plaques à 6 puits doivent être utilisées pour s’assurer que les cellules cultivées reçoivent un traitement. Si les anciennes plaques sont utilisées, il pourrait encore y avoir des cellules restées sur les plaques qui n’ont pas été trypsinisées avec succès. - Si nécessaire, pour la procédure expérimentale suivante, lyser les cellules pour l’analyse de l’expression de l’ARN ou des protéines.
3. Hyperthermie in vivo
- Culture cellulaire et inoculation
- Culture de cellules de mélanome murin B16F10 dans un milieu RPMI avec 10% FBS et 1% Pen/streptocoque. Utilisez des assiettes/plats qui fourniront suffisamment de cellules pour inoculer le nombre désiré d’animaux. Par exemple, des boîtes de 10, 100 mm, plaquées à 100 000 cellules seront confluentes avec suffisamment de cellules pour des injections de 20 souris en 48 heures.
- Trypsiniser les cellules et recueillir en utilisant des médias RPMI purs (pas de FBS ou stylo / streptocoque).
- Comptez les cellules et créez une solution pour la concentration souhaitée de cellules, en fonction du volume d’inoculation et du nombre de souris.
- Anesthésier les souris C57Bl/6 femelles âgées de 6 semaines à l’aide d’isoflurane vaporisé et d’oxygène. Placez les animaux dans une boîte en plexiglas contenant 5 % d’isoflurane et 95 % d’oxygène jusqu’à incitation. Une fois induit, enlever l’animal et utiliser un cône facial contenant 2 % d’isoflurane pour compléter les étapes 3.1.5-3.1.7 et 3.3.3-3.3.6.
REMARQUE: Pour l’anesthésie pendant le traitement, utilisez un confinement d’anesthésie intégré. Suivez les protocoles institutionnels standard pour l’anesthésie de la souris. Avant l’expérimentation animale, assurez-vous de l’approbation appropriée de l’IACUC. Après l’anesthésie, remettez l’animal en cage et surveillez la récupération pour éviter toute complication. - Vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de redressement.
- Rasez le flanc droit à l’aide d’un rasoir électrique.
- Nettoyez la zone d’injection avec une lingette imbibée d’alcool. Injecter 1-2 x 106 cellules, à l’aide d’une seringue en verre de 100 μL avec une aiguille de 28 G, dispersées dans 50 μL de milieu par voie intradermique sur le flanc droit rasé de l’anesthésié.
- Croissance tumorale/injection de nanoparticules
- Mesurez les tumeurs en 3 dimensions à l’aide d’étriers (longueur, largeur et profondeur) et calculez les volumes par (longueur x largeur x profondeur x π) / 6.
- Lorsque les volumes tumoraux atteignent 120 mm 3 (+/- 20 mm3), placez les animaux à l’étude. Concevoir l’étude en veillant à ce qu’il y ait des groupes témoins et de traitement appropriés, y compris des cohortes de thérapie combinée (c.-à-d. témoin, mNPH, radiothérapie et combinaison).
- Anesthésier les souris qui recevront des NP de la manière décrite à la section 3.1.4.
- Nettoyez la zone avec une lingette imbibée d’alcool. Injecter des mNPs dans la tumeur 3 h avant le traitement par AMF. Injecter un volume tel que la dose soit de 7,5 mg de fer / cm3 de tumeur.
REMARQUE : Des données non publiées du laboratoire suggèrent que l’absorption maximale du NPm se produit à 3-6 heures.
- Traitement AMF
- Anesthésiez la souris et placez-la sur un coussin chauffant pour maintenir la température centrale.
- Vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de redressement. Retirez l’étiquette d’oreille ou tout autre objet métallique sur la souris.
- Placez doucement une sonde de température à fibre optique lubrifiée dans le rectum de la souris.
- Placez un cathéter dans la tumeur, en retirant l’aiguille. Coupez le cathéter de manière à ce qu’il ne dépasse pas trop de la tumeur.
REMARQUE: Les cathéters de température à fibre optique sont placés et retirés pendant que les souris sont sous anesthésie générale, c’est-à-dire que les cathéters ne sont en place que pendant la procédure de chauffage de la tumeur. Les souris reçoivent une dose sous-cutanée unique d’un analgésique AINS, le kétoprofène (5 mg / kg), au moment de la procédure. Nous n’avons pas observé d’inconfort ou de morbidité à court ou à long terme associés à la mise en place des cathéters. - Insérez une sonde de température à fibre optique à 3 capteurs dans le cathéter. Le cathéter protège les capteurs de sonde de température à fibre optique.
- Collez la sonde rectale et intratumorale à la queue de l’animal pour vous assurer qu’elle reste en place.
- Placez la souris dans un tube de 50 mL, dirigez-vous vers le bas. Le tube doit avoir un trou près de la tête où l’anesthésie sera connectée et administrée.
- Placez le tube dans la bobine installée et reconnectez l’anesthésie.
- Placez une sonde de température à fibre optique dans le tube pour mesurer la température ambiante.
- Allumez le refroidisseur et assurez-vous que le liquide de refroidissement circule.
- Vérifiez et assurez-vous que le logiciel de l’ordinateur affiche les différentes températures et commencez l’enregistrement pour permettre l’affichage d’un calcul CEM43 en temps réel. La CEM43 requise est la dose précédemment déterminée.
REMARQUE: Avant d’allumer l’aimant, assurez-vous qu’aucun objet métallique n’est attaché à l’animal, car il chauffera rapidement. De plus, assurez-vous que tout le monde dans la pièce n’a pas de stimulateur cardiaque et qu’il est sécuritaire pour eux d’être là. - Allumez l’aimant à un faible pourcentage de puissance.
- Assurez-vous que les sondes de température à fibre optique enregistrent les changements de température. Les températures augmenteront une fois que le CMA sera activé à mesure que le champ augmentera. S’assurer que la température à cœur de l’animal reste à 38 °C. Réglez la température à cœur à l’aide de la chemise d’air conditionnée.
- Ajustez la force du champ magnétique en changeant l’alimentation du générateur, à l’aide du cadran de contrôle intégré, qui à son tour contrôle le niveau de température dans la tumeur.
- Couper l’AMF une fois que la dose souhaitée, telle que précédemment déterminée par l’utilisateur (par exemple CEM43 40), est atteinte dans la tumeur.
- Une fois l’AMF arrêté, retirez le tube de la bobine.
- Retirez la souris du tube, en extrayant les différentes sondes et cathéter. Si nécessaire, marquez l’animal avec une nouvelle étiquette d’oreille en métal.
- Une fois les traitements terminés, arrêtez le refroidisseur.
- Récupérez les animaux de l’anesthésie en évitant les complications. Surveillez leur comportement pour assurer un retour à la normale.
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Representative Results
Études in vitro
Les cellules n’atteindront et ne maintiendront la température et la dose thermique souhaitées que si la quantité et la concentration des nanoparticules magnétiques/fer et de l’AMF sont correctement appariées. Lors de l’utilisation de nanoparticules magnétiques pour chauffer des cellules in vitro (et in vivo), il convient de noter que pour atteindre l’hyperthermie dans des cellules avec des nanoparticules magnétiques internalisées, un niveau spécifique de mNP / Fe intracellulaire sera nécessaire, et le nombre et la proximité des cellules chargées de mNP, les unes par rapport aux autres, seront nécessaires. Si le niveau de mNP/Fe dans les cellules/tissus cibles est suffisant pour obtenir un effet de chauffage, la fréquence et l’intensité du champ magnétique peuvent être ajustées pour atteindre la température et les effets souhaités. Si elle est plaquée correctement, d’autres études portant sur les différences génétiques et moléculaires entre les différentes doses et les différents moments peuvent être poursuivies17. La figure 1 représente un schéma des méthodes in vitro.
Ces méthodes in vitro peuvent être utilisées pour étudier le changement d’expression de l’ARNm cellulaire et des protéines. Un exemple récent de notre laboratoire a déterminé des différences immunogénétiques après un traitement CEM43 30 mNPH, une radiothérapie 8 Gy et la combinaison. Nous avons pu identifier des similitudes et des différences d’expression entre les voies immunitaires et cytotoxiques afin de mieux comprendre le mécanisme derrière les effets et comment ils se combinent en synergie17. Chaque expérience utilise une variété d’échantillons de contrôle environnementaux et chauffés. Les témoins auront des niveaux d’expression d’ARNm et de protéines différents de ceux qui reçoivent un traitement hyperthermique.
Études in vivo
Dans les études in vivo, il y a des considérations supplémentaires. Quelle que soit la dose thermique cible, il est absolument essentiel de maintenir une température à cœur physiologiquement acceptable chez l’animal traité. Cela peut être difficile avec les rongeurs sous anesthésie, car la température centrale peut être rapidement perdue (des techniques de modulation de la température centrale telles que des coussins chauffants sont souvent nécessaires). Des températures corporelles inférieures à la normale peuvent nécessiter la nécessité de pousser l’AMF-mNPH trop loin, lorsque vous essayez d’atteindre une dose thermique spécifique dans la tumeur, ce qui entraîne des effets inacceptables dans le tissu non cible (le chauffage par courants de Foucault des tissus non cibles est l’une de ces possibilités). Même des écarts mineurs dans la température corporelle centrale peuvent entraîner des complications physiologiques indésirables dans la tumeur ou les tissus normaux. Comme mentionné précédemment, mais il vaut la peine de le répéter, pour un chauffage précis et reproductible, il est essentiel d’obtenir une correspondance entre la concentration tissulaire mNP/Fe, la fréquence AMF et les paramètres de surveillance de la température de champ et la taille et la profondeur des tissus cibles. Il doit y avoir une concentration de base de mNPs dans la tumeur pour permettre un chauffage mesurable. Le niveau / capacité de chaleur dépend non seulement de la concentration tissulaire mNP (mg Fe / g de tissu) et de leur distribution relative dans la tumeur, mais aussi de la fréquence de l’AMF et de l’intensité du champ subséquent. Les changements dans l’un des éléments ci-dessus peuvent conduire à différentes plages de températures atteignables dans le tissu. Grâce à de nombreuses années d’expérience, nous avons optimisé la concentration que nous utilisons pour les traitements précliniques des tumeurs ainsi que la fréquence et l’intensité de champ du système AMF pour permettre une activation sûre et efficace. Parce qu’il est impossible de mesurer la température / dose thermique dans tous les sites tissulaires, il est également essentiel de placer autant de sondes de température à fibre optique que possible dans des sites stratégiques qui permettent une évaluation en temps réel de l’efficacité et de l’innocuité, comme le montre la figure 2. Ces sondes permettent d’enregistrer les températures tout au long de l’expérience, ce qui permet une dosimétrie précise et un historique thermique de l’expérience. La figure 3 illustre les courbes générées au cours d’une expérience in vivo, mettant en évidence la capacité de surveiller de près la température et d’ajuster le système pour maintenir les températures tumorales dans la plage souhaitée. La figure 4 résume les méthodes in vivo.
Ces méthodes in vivo, similaires aux méthodes in vitro, peuvent être utilisées pour étudier différents types de cancer, différentes doses d’hyperthermie et avec divers traitements combinés. Par exemple, des études antérieures dans notre laboratoire ont étudié la combinaison de l’hyperthermie et de la chimiothérapie12. Nous avons également réalisé de nombreuses expériences d’hyperthermie et de rayonnement pour la détermination de l’efficacité et des mécanismes moléculaires. Les souris témoins de ces expériences subissent toutes les procédures, à l’exception de la génération réelle d’hyperthermie. La figure 5 contient deux diagrammes de volcans qui démontrent des gènes exprimés différentiellement après un traitement d’hyperthermie mNP in vitro et in vivo (mNPH). Ces chiffres sont des exemples de la façon dont nous utilisons les techniques moléculaires pour surveiller les effets de l’hyperthermie.
Figure 1 : Schéma d’hyperthermie in vitro mNP. Ce schéma illustre la méthode d’hyperthermie par nanoparticules magnétiques in vitro. Pour assurer l’échauffement, les cellules doivent recevoir suffisamment de particules et de temps pour une absorption adéquate du mNP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mise en place des cathéters pour la surveillance de la température. Cette figure montre l’emplacement des cathéters qui abritent les sondes de température à fibre optique pour enregistrer les températures à différents endroits de la tumeur et / ou de la région tumorale. Cette figure est adaptée de la réf.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Surveillance de la température en temps réel pendant le traitement d’une tumeur de souris. Ce graphique montre les lectures de température en temps réel qui permettent de surveiller la température corporelle centrale, les températures environnementales et les températures multiples dans la tumeur, au cours d’une expérience in vivo. Le contrôle des températures à l’intérieur de la tumeur est démontré par les variations minimales à grande échelle sur la partie zoomée de la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Schéma de l’hyperthermie in vivo mNP. Ce schéma illustre la méthode d’hyperthermie des nanoparticules magnétiques in vivo . L’injection de suffisamment de nanoparticules ainsi que suffisamment de temps pour la distribution et l’absorption, assure la capacité de délivrer la dose thermique souhaitée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expression différentielle des gènes. Expression génique différentielle après traitement in vitro (A) et in vivo (B) de l’hyperthermie mNP. Ces diagrammes de volcans représentent les changements génétiques sur un axe des x log 2, avec une signification sur l’axe des y, pour les méthodes mNPH in vitro et in vivo. Chaque cercle représente un gène différent, avec les 20 gènes exprimés différentiellement les plus significatifs étiquetés. Plus le gène est éloigné de zéro sur l’axe des abscisses, plus le changement de pli est important et plus le gène est élevé sur l’axe des y, plus la valeur p est faible. Bien que les deux aient eu la même dose thermique, l’hyperthermie in vivo a entraîné des changements d’expression génique plus importants qu’in vitro. Ces placettes sont des exemples de données biologiques qui peuvent être générées à l’aide du protocole décrit. La parcelle du volcan in vitro a été adaptée de la réf.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La conception et la mise en œuvre de ce système permettent de mener des expériences précises et reproductibles in vitro et in vivo d’hyperthermie magnétique par nanoparticules. Il est essentiel que le système soit conçu de manière à ce que la fréquence et l’intensité du champ AMF correspondent adéquatement au type de nanoparticules magnétiques, à la concentration, ainsi qu’à l’emplacement et à la température des tissus souhaités. De plus, la surveillance précise de la température en temps réel est cruciale pour la sécurité et le calcul d’une dose thermique précise (minutes équivalentes cumulées à 43 °C / CEM). L’emplacement des sondes, tel que démontré à la figure 1, permet de surveiller en temps réel la dose thermique et la température corporelle centrale, comme le montre la figure 2.
La première étape de l’administration précise de l’hyperthermie par nanoparticules magnétiques consiste à construire un système sûr pour les animaux et les opérateurs. Tous les composants du système doivent également être bien compris du point de vue opérationnel et de la prestation. Dans cette situation, cela signifie comprendre le potentiel des courants de Foucault AMF et savoir où se trouvent les particules magnétiques. Les antennes, ou bobines, sont un facteur clé dans la forme et la force du champ, et le système de refroidissement utilisé est important pour éviter la surchauffe des bobines20. L’intensité du champ à l’extérieur du conducteur est directement proportionnelle à l’intensité du courant circulant dans le conducteur. L’intensité du champ magnétique en tout point de l’espace entourant le conducteur est la somme vectorielle des champs produits par les conducteurs dans la zone environnante. Le champ magnétique est produit perpendiculairement au flux de courant et la force diminue exponentiellement, en fonction de la distance du conducteur, selon la règle du carré inverse de Biot-Savart21. Ainsi, le tube carré est utilisé pour l’hyperthermie in vivo pour un champ plus uniforme à l’intérieur de la bobine. La création d’un champ magnétique avec la force et le volume nécessaires pour un système potentiellement cliniquement pertinent nécessite un courant électrique élevé. Par conséquent, les conceptions d’antennes doivent pouvoir s’adapter à des niveaux de puissance électrique importants. De plus, les antennes AMF doivent être conçues de manière à ce que leur inductance se situe dans la plage acceptable du groupe électrogène. Aux fréquences généralement utilisées, la majeure partie du flux de courant se trouve à la surface du conducteur d’antenne, ce qui signifie que la surface affecte le chauffage résistif qui peut être minimisé en éliminant les défauts de surface. Ce chauffage résistif signifie également qu’un système de refroidissement du serpentin est nécessaire pour s’assurer que le serpentin et l’environnement ne surchauffent pas.
Une limite de la conception de notre système est qu’il ne permet pas une gamme totale de fréquences et de champs magnétiques, mais il permet de générer des champs appropriés pour les cellules, les rongeurs et les grands animaux. Plus précisément, l’intensité de champ maximale disponible à partir de tout système de chauffage par induction est directement liée au flux de courant dans l’antenne (bobine). Les génératrices AMF sont évaluées en kilowatts, qui sont calculés en multipliant la tension disponible par le courant disponible (ampères). Ainsi, un système de 10 kW avec une limite de 500 V aurait un ampérage maximum de 20 A. La conception des bobines déterminera quelle limite est atteinte en premier, et donc la limite du système. L’intensité du champ magnétique créé par tout courant diminue exponentiellement en fonction de la distance du conducteur. Par conséquent, une bobine de plus grand diamètre avec la même géométrie qu’une bobine de plus petit diamètre, fonctionnant sur le même système, aurait une intensité de champ plus faible au centre de la bobine. Ainsi, la taille et l’intensité du champ magnétique requis sont limitées par la capacité du générateur AMF. La construction d’un serpentin plus grand et l’utilisation de plus d’énergie entraînent des préoccupations supplémentaires, principalement le chauffage par courants de Foucault.
Plusieurs problèmes de sécurité doivent être pris en compte lors de l’utilisation de ce système pour protéger les utilisateurs, les animaux et le système lui-même. Tout d’abord, une ventilation adéquate de la pièce doit être maintenue pendant l’utilisation de l’anesthésie. Deuxièmement, toutes les zones associées à la bobine doivent être exemptes de métal et/ou de conducteurs, y compris les mélanges à haute teneur en solution saline. Les utilisateurs doivent retirer les bagues et autres bijoux lorsqu’ils travaillent autour de l’AMF, et les échantillons ne doivent contenir aucun type de métal. Plus important encore, les personnes porteuses d’un stimulateur cardiaque ou d’autres dispositifs ou objets implantés devraient consulter leur médecin avant de contourner le CMA. Pour protéger le système, un système à sécurité intégrée doit être utilisé pour s’assurer que les besoins de refroidissement de la génératrice et du serpentin sont satisfaits avant l’alimentation. De plus, une vue d’ensemble de la caméra thermique doit être utilisée pour détecter un échauffement involontaire.
Pour les études in vitro, les étapes les plus importantes à suivre sont la concentration de fer dans les cellules, la concentration des cellules, les paramètres AMF et l’évaluation de la dose thermique. Les cellules peuvent être traitées/chauffées par hyperthermie magnétique des nanoparticules en plaçant les nanoparticules magnétiques dans le surnageant, les cellules ou les deux. La quantité de chauffage des nanoparticules magnétiques dépendra du niveau de nanoparticules magnétiques/Fe. Si le désir est de traiter uniquement les cellules avec du fer internalisé, notre expérience est que les cellules cancéreuses individuelles n’absorberont qu’un nombre limité de nanoparticules magnétiques et que même lorsque l’absorption est optimale, les cellules doivent être agrégées / granulées pour créer une situation de chauffage cellulaire, même avec des CMA optimisés. Le maintien de la température du milieu et des cellules à des niveaux biologiquement pertinents (lorsqu’ils ne sont pas chauffés) est également important pour mesurer avec précision le chauffage réel. La bobine solénoïde à 14 tours décrite ici permet de maintenir des températures biologiquement pertinentes en immergeant les échantillons dans une colonne d’eau à contrôle thermique.
Pour les études in vivo, le maintien de la température centrale de l’animal et la mesure précise de la température dans la tumeur sont des facteurs clés. Ce système de confinement des animaux et la conception de la bobine éliminent la dérive thermique dans l’environnement de l’animal en raison des réglages de la bobine / puissance et aident à maintenir une température corporelle centrale normale. Le maintien de la température centrale du corps est essentiel pour des résultats d’expérience significatifs. La sonde rectale permet de surveiller en temps réel la température centrale de l’animal. Lorsqu’il est sous anesthésie, la température centrale d’un animal diminue intrinsèquement. Pour remédier à cette situation, nous avons mis au point un système de chauffage environnemental qui fournit de l’air chaud autour de la cuve de confinement des animaux, permettant à la température centrale de rester dans la plage normale. Le maintien d’une température centrale normale est essentiel pour assurer une interprétation précise des résultats du traitement par hyperthermie et l’élimination des facteurs environnementaux. Le placement des sondes de surveillance de la température dans plusieurs sites du tissu / tumeur cible est important pour obtenir une évaluation précise de la température et de la dose thermique atteinte. Parce qu’il est extrêmement difficile, voire impossible, de distribuer les nanoparticules magnétiques de manière homogène dans une tumeur, il est essentiel de connaître les paramètres de chauffage dans plusieurs sites pour obtenir une dose thermique tissulaire / tumeur cohérente et précise. Il est important de noter que la concentration pour les études in vitro et in vivo est variable. Cette variation est due au fait qu’il y a moins de limites dans la culture cellulaire avec des cellules ayant plus d’accès aux mNP, de sorte qu’une concentration plus faible peut être utilisée. In vivo, une concentration plus élevée est nécessaire en raison de la nature hétérogène des tumeurs et de la morphologie 3D compliquée. Par conséquent, l’utilisation de la même concentration de particules in vivo et in vitro conduirait à beaucoup moins d’absorption par les cellules.
Ce manuscrit décrit les paramètres et l’instrumentation nécessaires pour développer un générateur de champ magnétique alternatif efficace et flexible et un système de bobine pour les traitements d’hyperthermie par nanoparticules magnétiques. Ce système peut être utilisé pour des études in vitro et in vivo. Le système est efficace pour l’hyperthermie localisée/ciblée et l’épargne des tissus normaux, ce qui le rend attrayant, comparativement à d’autres systèmes d’hyperthermie AMF-mNP. Ces traitements d’hyperthermie peuvent être modifiés pour étudier les effets de différentes doses, avec une variété de nanoparticules ou de nanotransporteurs et des traitements d’appoint. Étant donné que le chauffage des tissus, en particulier le chauffage des nanoparticules magnétiques, peut être affecté par de nombreuses variables, il est essentiel de comprendre les paramètres dans une enquête. Si ces critères sont remplis, l’hyperthermie magnétique par nanoparticules peut traiter de nombreuses situations moléculaires, cellulaires et cliniques, y compris le contrôle indépendant et adjuvant des tumeurs. Bien que les méthodes décrites ici nécessitent des efforts importants, si les lignes directrices sont suivies, le plein potentiel de l’hyperthermie mNP peut être réalisé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été financée par les numéros de subvention : NCI P30 CA023108 et NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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