Summary
Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la consegna accurata dell'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche utilizzando un sofisticato sistema di consegna e monitoraggio.
Abstract
L'ipertermia è stata a lungo utilizzata nel trattamento del cancro. Le tecniche sono variate dall'inserimento intratumorale di barre di ferro calde, a nanoparticelle magnetiche mirate agli anticorpi tumorali erogate per via sistemica, a temperature da 39 ° C (livello di febbre) a 1.000 ° C (elettrocauterizzazione) e tempi di trattamento da secondi a ore. La relazione temperatura-tempo (dose termica) detta l'effetto con alte dosi termiche con conseguente ablazione tissutale e dosi termiche più basse con conseguenti effetti subletali come aumento del flusso sanguigno, accumulo di farmaci e stimolazione immunitaria. Una delle terapie mediche attuali più promettenti è l'ipertermia con nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questa tecnica prevede l'attivazione di nanoparticelle magnetiche, che possono essere veicolate sistemicamente o intratumoralmente, con un campo magnetico alternato non invasivo e non tossico. La dimensione, la costruzione e l'associazione delle nanoparticelle magnetiche e la frequenza e l'intensità del campo magnetico sono i principali determinanti del riscaldamento. Abbiamo sviluppato strumentazione e tecniche sofisticate per fornire ipertermia magnetica riproducibile con nanoparticelle in modelli animali grandi e piccoli e cellule in coltura. Questo approccio, che utilizza il monitoraggio continuo della temperatura in tempo reale in più posizioni, consente la somministrazione di dosi termiche ben definite al tessuto bersaglio (tumore) o alle cellule, limitando al contempo il riscaldamento dei tessuti non bersaglio. Il controllo e il monitoraggio precisi della temperatura, in più siti, e l'uso dell'algoritmo standard del settore (minuti equivalenti cumulativi a 43 °C / CEM43), consente una determinazione e una quantificazione accurate della dose termica. Il nostro sistema, che consente un'ampia varietà di temperature, dosi termiche ed effetti biologici, è stato sviluppato attraverso una combinazione di acquisizioni commerciali e sviluppi interni di ingegneria e biologia. Questo sistema è stato ottimizzato in modo da consentire la rapida conversione tra tecniche ex vivo, in vitro e in vivo. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come progettare, sviluppare e implementare una tecnica e un sistema efficaci per fornire ipertermia riproducibile e accurata con terapia magnetica con nanoparticelle (mNP).
Introduction
L'ipertermia è stata storicamente utilizzata nella terapia del cancro, da sola o in combinazione con altri trattamenti. Sebbene abbia una lunga storia di utilizzo, il metodo più vantaggioso per fornire questo trattamento è ancora in discussione e dipende dal sito e dalla posizione della malattia. I metodi per la somministrazione di ipertermia includono microonde, radiofrequenza, ultrasuoni focalizzati, laser e nanoparticelle metalliche (come oro o ossido di ferro)1,2,3,4. Questi metodi di somministrazione possono portare a una gamma di temperature di trattamento dal livello di febbre fino a centinaia di gradi C. L'effetto biologico dell'ipertermia dipende principalmente dalle temperature utilizzate e dalla durata del trattamento5. Per questo manoscritto e scopo, ci stiamo concentrando sull'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questo metodo consente variazioni di temperatura focalizzate, localizzate, ben monitorate e controllate, utilizzando nanoparticelle di ossido di ferro non tossiche, approvate dalla FDA.
Una trappola di altre modalità di ipertermia è la mancanza di un preciso targeting cellulare; L'ipertermia non ha un rapporto terapeutico intrinsecamente elevato, pertanto è necessaria un'attenta termometria e targeting6. mNPH consente l'iniezione sistemica o intratumorale di mNP, con il calore generato solo dove si trovano gli mNP, indirizzando così il trattamento direttamente al tumore. mNPH può essere efficace quando le nanoparticelle magnetiche si trovano all'interno o all'esterno della cellula. Per la terapia del cancro, la panoramica generale di mNPH è che le nanoparticelle magnetiche vengono iniettate (per via intratumorale o endovenosa), quindi viene applicato un campo magnetico alternato, causando il costante riallineamento dei poli magnetici delle nanoparticelle, portando ad un riscaldamento localizzato delle cellule e dei tessuti associati alle nanoparticelle 7,8 . Regolando il volume delle nanoparticelle e la frequenza/forza del campo magnetico alternato (AMF), è possibile controllare attentamente la temperatura generata all'interno del tessuto.
Questo trattamento funziona bene nei tumori che si trovano vicino alla superficie corporea, poiché i tumori più profondi richiedono AMF più forte, quindi il rischio di riscaldamento a correnti parassite aumenta9. Ci sono prove che l'ipertermia viene utilizzata clinicamente come monoterapia, tuttavia, spesso l'ipertermia è combinata con radioterapia o chemioterapia, portando ad un effetto anti-cancro più mirato10,11,12. L'evidenza clinica dell'ipertermia che funziona in combinazione con la radioterapia è stata esaminata in una precedente pubblicazione13. Il nostro laboratorio ha trattato con successo una varietà di animali, dai topi ai maiali e tumori canini spontanei, utilizzando il metodo mNPH12,14,15. Questo protocollo è progettato per coloro che sono interessati a studiare gli effetti del trattamento di ipertermia localizzata, da solo o in combinazione con altre terapie.
Uno dei fattori più importanti nell'ipertermia è essere in grado di misurare e comprendere, in tempo reale, la dose termica erogata al tessuto bersaglio/tumorale. Un metodo standard per calcolare e confrontare la dose consiste nella dimostrazione dei minuti equivalenti cumulativi di riscaldamento a 43 °C; Questo algoritmo consente di confrontare le dosi indipendentemente dal sistema di erogazione, le temperature massime e minime (all'interno di un intervallo specifico) e i parametri di riscaldamento/raffreddamento 5,16. Il calcolo CEM funziona meglio per temperature comprese tra 39-57 °C5. Ad esempio, in alcuni degli studi che abbiamo eseguito, abbiamo scelto una dose termica di CEM43 30 (cioè 30 minuti a 43 °C). La scelta di questa dose ci ha permesso di esaminare un sicuro, efficace, effetti immunogenetici in vitro, sia da solo, sia in combinazione con una singola dose di radiazioni17.
Con l'ipertermia magnetica a nanoparticelle, ci sono diversi fattori che devono essere considerati nella costruzione di un sistema di consegna appropriato. La progettazione della strumentazione include importanti fattori di sicurezza, come l'uso di un refrigeratore per garantire che l'apparecchiatura di erogazione del campo magnetico rimanga fredda anche quando funziona ad alta potenza e procedure fail-safe che impediscono l'accensione del sistema se tutti i sistemi di temperatura, valutazione della potenza e controllo non sono stati attivati. Inoltre, ci sono importanti fattori biologici che devono essere considerati sia in situazioni in vivo che in vitro. Quando si utilizzano cellule in coltura, è necessario trattare nei terreni di crescita e mantenere una temperatura vitale costante per evitare cambiamenti fisiologici che potrebbero influenzare i risultati. Per i singoli tipi di nanoparticelle, è importante conoscere il tasso di assorbimento specifico (SAR) quando si calcolano i parametri di riscaldamento basati su AMF. Allo stesso modo, è importante conoscere la concentrazione di mNP/Fe, nelle cellule e nei tessuti, necessaria per ottenere il riscaldamento desiderato. I metodi in vivo richiedono ancora più attenzione ai dettagli poiché l'animale deve essere mantenuto in anestesia durante il trattamento e la temperatura corporea interna dell'animale deve essere mantenuta a un livello normale durante tutto il trattamento. Permettere all'animale di abbassarsi della temperatura corporea, come avviene in anestesia, può influire sui risultati complessivi, rispetto alla dose termica del tessuto da trattare.
In questo manoscritto, discutiamo i metodi utilizzati per progettare e costruire un versatile sistema di ipertermia magnetica a nanoparticelle, nonché importanti fattori d'uso che devono essere considerati. Il sistema descritto consente la somministrazione robusta, coerente, biologicamente appropriata, sicura e ben controllata dell'ipertermia di nanoparticelle magnetiche. Infine, va notato che gli studi mNPH che conduciamo spesso coinvolgono altre terapie come radioterapia, chemioterapia e immunoterapia. Affinché questi risultati siano significativi, è importante determinare in che modo il calore erogato può influenzare l'efficacia e/o la sicurezza-tossicità di altre modalità (o viceversa) e il benessere dell'animale. Per questo motivo e per le situazioni dosimetriche e terapeutiche precedentemente menzionate, è essenziale prestare la massima attenzione all'accuratezza del dosaggio dell'ipertermia con nanoparticelle magnetiche e alle misurazioni continue della temperatura del nucleo e del target. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo e una descrizione semplici e coerenti per la somministrazione di ipertermia magnetica a nanoparticelle sicura ed efficace.
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Protocol
Il Dartmouth College Animal Care and Use Program è accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e aderisce a tutte le linee guida e i regolamenti UDSA e NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dal Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La procedura di eutanasia aderisce alle linee guida AVMA 2020 per l'eutanasia degli animali.
1. Strumentazione/progettazione del sistema
- Progetta un'antenna AMF personalizzata (bobina) per essere un anello chiuso, scegliendo le forme per creare il campo magnetico desiderato. Utilizzare le formule e le caratteristiche di induttanza dalla scelta del generatore di potenza per progettare bobine compatibili per generare il campo desiderato. Utilizzare diversi design per esperimenti in vitro e in vivo.
- Assicurarsi che l'induttanza dell'antenna AMF rientri nell'intervallo accettabile del generatore di corrente. Aggiungere o sottrarre condensatori per abbinare (sintonizzare) l'antenna al generatore di energia.
- Per gli esperimenti in vitro, progettare una bobina elicoidale a 14 giri, diametro interno 2 cm e lunghezza 14 cm, che può contenere tubi da 1,5 ml, consentendo il trattamento di più campioni contemporaneamente. Isolare la bobina con un polimero vinilico e utilizzare un distanziatore in polistirolo per separare la bobina dai tubi. I dettagli delle specifiche di progettazione e le considerazioni sono presenti nel file supplementare 1.
- Per gli esperimenti in vivo, acquista una bobina elicoidale per tutto il corpo costruita su misura da un produttore con informazioni di progettazione proprietarie. Utilizzare tubi quadrati da 8 mm (poiché crea un campo più uniforme all'interno del foro della bobina) e un concentratore nell'area di trattamento mirata. Rendere il concentratore lungo 5,0 cm, con un totale di 5 giri per ottenere un diametro interno di 3,6 cm, diametro esterno di 5,2 cm e avere la sua posizione nell'area di trattamento mirata. Circondare la bobina con un guscio in policarbonato.
- Utilizzare un generatore AMF con potenza e frequenza regolabili, nominale a 10 kW o superiore come fonte di alimentazione. L'induttanza abbina la fonte di alimentazione e le antenne/bobine a un intervallo da 0,62 a 1,18 μHenries (μH), consentendo frequenze comprese tra 30-300 kHz. Raffreddare il generatore utilizzando acqua riciclata attraverso una pompa centrifuga, pressione regolata a 50 psi.
- Raffreddare le bobine con un refrigeratore da 5,6 tonnellate di capacità di raffreddamento che pompa il 25% di fluido termovettore a base di glicole etilenico diluito con acqua attraverso l'antenna AMF. Impostare la temperatura del refrigeratore in modo tale che l'antenna non riscaldi o raffreddi il campione.
- Per il contenimento degli animali, costruire un supporto tubolare che può essere sospeso al centro della bobina con un traferro di 0,5 cm tra il supporto e la superficie della bobina. Collegare una pompa dell'aria condizionata regolabile che fa circolare l'aria attraverso il guscio attorno alla bobina e impostarla per mantenere una normale temperatura interna animale. Collegare la macchina per anestesia al supporto tubolare dell'animale vicino alla testa dell'animale per garantire la corretta erogazione dell'anestesia.
- Per il contenimento delle cellule, creare un apparato che faccia circolare l'acqua da un bagno d'acqua attraverso il distanziatore in cui sono posizionati i tubi. Impostare la temperatura di questo bagnomaria in modo che i tubi siano circondati dall'acqua a 37 °C.
- Utilizzare sonde a fibre ottiche per monitorare le temperature all'interno del tumore, il nucleo dell'animale e l'ambiente animale o per studi in vitro, monitorando la temperatura del pellet cellulare e l'acqua che circonda i tubi.
- Utilizzare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro di dimensioni 100 nm per tutti gli esperimenti.
NOTA: La concentrazione e il tasso di assorbimento specifico (SAR) sono due caratteristiche che devono essere considerate quando si scelgono le nanoparticelle, in quanto influenzano direttamente il possibile riscaldamento e la dose termica18.
2. Ipertermia in vitro
- Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Piastra 150.000 celle/pozzetto in piastre a 6 pozzetti, con 2 ml di mezzo completo.
- Determinare il trattamento appropriato per ogni pozzetto, cioè cellule senza mNP e senza AMF, cellule con mNP e senza AMF, cellule senza mNP e AMF, cellule con mNP e AMF.
NOTA: Inoltre, assicurarsi che ci siano controlli appropriati se si combina l'ipertermia con un'altra terapia. L'AMF viene eseguito in un laboratorio di ricerca standard adattato con le capacità di alimentazione e raffreddamento necessarie. - 24 ore dopo la placcatura, aggiungere mNP ai pozzetti appropriati come determinato nella fase precedente. Aggiungere mNPs ad una concentrazione di 3 mg di ferro/ml. Assicurarsi che gli mNP siano distribuiti in tutto il pozzo, creando una soluzione di supporti / mNP (rimuovendo i vecchi supporti, aggiungendo questa soluzione) o aggiungendo direttamente gli mNP e ruotando delicatamente le piastre per una distribuzione omogenea.
- Iniziare il trattamento, 48 ore dopo l'aggiunta di mNP, quando i pozzetti sono ~ 80% confluenti, rimuovendo i mezzi e lavando i pozzetti con mezzi freschi. Rimuovere il supporto.
- Aggiungere 0,5 ml di tripsina a ciascun pozzetto trattato e ruotare delicatamente. Utilizzare un microscopio per verificare che le cellule siano staccate.
- Aggiungere 1 mL di supporto a ciascun pozzetto per raccogliere le cellule in tubi da 1,5 ml. Raccogliere tutte le celle dal pozzo (~1 x 106 celle). Utilizzare un tubo separato chiaramente etichettato per ciascun pozzetto.
- Spingere i tubi a 60 x g per 2-3 minuti per consentire alle celle di pellettare. Trattenere il pellet nel supporto.
- Posizionare i tubi nel distanziatore pieno d'acqua all'interno della bobina. Impostare la temperatura del bagno d'acqua in modo tale che il fluido e il pellet cellulare siano mantenuti a 37 °C. Monitorare la temperatura all'interno del tubo e del bagno d'acqua utilizzando sonde di temperatura a fibre ottiche separate.
- Accendere il refrigeratore, controllare che il refrigerante scorra attraverso la bobina. Accendere la fonte di alimentazione e regolare la percentuale massima in base al campo desiderato. Azionare l'elettrobobina a 14 giri, alimentata da un generatore da 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).
- Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica separata in uno dei tubi. Trattare le cellule fino alla dose termica del protocollo precedentemente determinata. Un esempio è 30 min a 43 °C (CEM43 di 30).
- Risospendere le celle nel mezzo che si trova nei loro tubi e ri-placcare in nuove piastre a 6 pozzetti. Etichettare chiaramente i nuovi piatti. L'obiettivo è quello di ri-placcare tutte le cellule raccolte (~1 x 106 celle).
NOTA: Dovrebbero essere utilizzate nuove piastre a 6 pozzetti per garantire che le cellule coltivate ricevano il trattamento. Se vengono utilizzate le vecchie piastre, potrebbero essere ancora rimaste cellule sulle piastre che non sono state tripsinizzate con successo. - Se necessario, per la successiva procedura sperimentale, lisare le cellule per l'analisi dell'espressione di RNA o proteine.
3. Ipertermia in vivo
- Coltura cellulare e inoculazione
- Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Utilizzare piastre / piatti che forniscano abbastanza cellule per l'inoculazione del numero desiderato di animali. Ad esempio, piatti da 10.100 mm, placcati a 100.000 cellule saranno confluenti con abbastanza cellule per 20 iniezioni di topi entro 48 ore.
- Tripsinizzare le cellule e raccogliere utilizzando supporti RPMI puri (senza FBS o penna / streptococco).
- Contare le cellule e creare una soluzione per la concentrazione desiderata di cellule, in base al volume di inoculazione e al numero di mouse.
- Anestetizzare topi femmina C57Bl/6 di 6 settimane usando isoflurano vaporizzato e ossigeno. Mettere gli animali in una scatola di plexiglass con il 5% di isoflurano e il 95% di ossigeno fino a quando non vengono indotti. Una volta indotto, rimuovere l'animale e usare un cono facciale al 2% di isoflurano per completare i passaggi 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6.
NOTA: Per l'anestesia durante il trattamento utilizzare un contenimento dell'anestesia incorporato. Seguire i protocolli istituzionali standard per l'anestesia del topo. Prima della sperimentazione animale garantire l'approvazione IACUC appropriata. Dopo l'anestesia, riportare l'animale in gabbia e monitorare il recupero per garantire che non ci siano complicazioni. - Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento.
- Rasare il fianco destro usando un rasoio elettrico.
- Pulire l'area di iniezione con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare 1-2 x 106 cellule, utilizzando una siringa di vetro da 100 μL con un ago da 28 G, dispersa in 50 μL di terreno per via intradermica sul fianco destro rasato di anestetizzato.
- Crescita tumorale/iniezione di nanoparticelle
- Misura i tumori in 3 dimensioni usando i calibri (lunghezza, larghezza e profondità) e calcola i volumi per (lunghezza x larghezza x profondità x π)/6.
- Quando i volumi tumorali raggiungono 120 mm 3 (+/- 20 mm3), mettere gli animali in studio. Progettare lo studio, assicurandosi che ci siano gruppi di controllo e trattamento appropriati che includano coorti di terapia combinata (cioè controllo, mNPH, radiazioni e la combinazione).
- Anestetizzare i topi che riceveranno mNP come descritto al punto 3.1.4.
- Pulire l'area con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare mNPs nel tumore 3 ore prima del trattamento con AMF. Iniettare un volume tale che la dose sia di 7,5 mg di ferro/cm3 di tumore.
NOTA: Dati non pubblicati dal laboratorio suggeriscono che l'assorbimento massimo di mNP avviene a 3-6 ore.
- Trattamento AMF
- Anestetizzare il mouse e posizionarlo su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura interna.
- Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento. Rimuovere il marchio auricolare o altri oggetti metallici sul mouse.
- Posizionare delicatamente una sonda di temperatura in fibra ottica lubrificata nel retto del mouse.
- Posizionare un catetere nel tumore, rimuovendo l'ago. Tagliare il catetere in modo tale che non sporga troppo dal tumore.
NOTA: I cateteri di temperatura a fibre ottiche vengono posizionati e rimossi mentre i topi sono in anestesia generale, cioè i cateteri sono in posizione solo durante la procedura di riscaldamento del tumore. Ai topi viene somministrata una singola dose sottocutanea di un farmaco per l'analgesia dei FANS, ketoprofene (5 mg / kg), al momento della procedura. Non abbiamo osservato disagio o morbilità a breve o lungo termine associati al posizionamento dei cateteri. - Inserire una sonda di temperatura a fibra ottica a 3 sensori nel catetere. Il catetere protegge i sensori della sonda di temperatura in fibra ottica.
- Fissare la sonda rettale e intratumorale alla coda dell'animale per assicurarsi che rimangano in posizione.
- Posizionare il mouse in un tubo da 50 ml, dirigersi verso il basso. Il tubo dovrebbe avere un foro vicino alla testa dove l'anestesia sarà collegata e consegnata.
- Posizionare il tubo all'interno della bobina e ricollegare l'anestesia.
- Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica liberamente nel tubo per misurare la temperatura ambiente.
- Accendere il refrigeratore e assicurarsi che il refrigerante sia in circolazione.
- Controllare e assicurarsi che il software del computer visualizzi le varie temperature e iniziare la registrazione per consentire la visualizzazione di un calcolo CEM43 in tempo reale. Il CEM43 richiesto è la dose precedentemente determinata.
NOTA: Prima di accendere il magnete, assicurarsi che nessun oggetto metallico sia attaccato all'animale, poiché questi si riscaldano rapidamente. Inoltre, assicurati che tutti nella stanza non abbiano un pacemaker e che sia sicuro per loro essere lì. - Accendere il magnete a bassa percentuale di potenza.
- Assicurarsi che le sonde di temperatura in fibra ottica registrino le variazioni di temperatura. Le temperature aumenteranno una volta attivato l'AMF all'aumentare del campo. Assicurarsi che la temperatura interna dell'animale rimanga a 38 °C. Regolare la temperatura interna utilizzando la camicia ad aria condizionata.
- Regolare la forza del campo magnetico cambiando l'alimentazione sul generatore, utilizzando il quadrante di controllo incorporato, che a sua volta controlla il livello di temperatura nel tumore.
- Spegnere l'AMF una volta che la dose desiderata, come precedentemente determinato dall'utente (ad esempio CEM43 40), è stata raggiunta all'interno del tumore.
- Una volta spento l'AMF, rimuovere il tubo dalla bobina.
- Rimuovere il mouse dal tubo, estraendo le varie sonde e catetere. Se necessario, etichettare l'animale con un nuovo marchio auricolare metallico.
- Una volta completati i trattamenti, spegnere il refrigeratore.
- Recuperare gli animali dall'anestesia garantendo l'assenza di complicazioni. Monitorare il loro comportamento per garantire il ritorno alla normalità.
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Representative Results
Studi in vitro
Le cellule raggiungeranno e manterranno la temperatura e la dose termica desiderate solo se la quantità e la concentrazione delle nanoparticelle magnetiche / ferro e dell'AMF sono opportunamente abbinate. Quando si utilizzano nanoparticelle magnetiche per riscaldare le cellule in vitro (e in vivo), va notato che per ottenere l'ipertermia in cellule con nanoparticelle magnetiche internalizzate, sarà necessario un livello specifico di mNP / Fe intracellulare e sarà necessario il numero e la vicinanza delle cellule caricate con mNP, l'una all'altra. Se il livello di mNP/Fe nelle cellule/tessuti bersaglio è sufficiente per ottenere un effetto di riscaldamento, la frequenza e l'intensità del campo magnetico possono essere regolate per ottenere la temperatura e gli effetti desiderati. Se placcato correttamente, possono essere proseguiti ulteriori studi che esaminano le differenze genetiche e molecolari tra diverse dosi e tempistiche17. La figura 1 rappresenta uno schema dei metodi in vitro.
Questi metodi in vitro possono essere utilizzati per studiare l'mRNA cellulare e il cambiamento dell'espressione proteica. Un recente esempio dal nostro laboratorio ha determinato le differenze immunogenetiche dopo il trattamento con CEM43 30 mNPH, un trattamento con radiazioni a 8 Gy e la combinazione. Siamo stati in grado di identificare somiglianze e differenze nell'espressione tra i percorsi immunitari e citotossici per ottenere una migliore comprensione del meccanismo alla base degli effetti e di come si combinano sinergicamente17. Ogni esperimento utilizza una varietà di campioni di controllo ambientali e riscaldati. I controlli avranno diversi livelli di espressione di mRNA e proteine rispetto a quelli sottoposti a trattamento di ipertermia.
Studi in vivo
Negli studi in vivo ci sono ulteriori considerazioni. Indipendentemente dalla dose termica target, è assolutamente essenziale mantenere una temperatura interna fisiologicamente accettabile nell'animale da trattare. Questo può essere difficile con i roditori sotto anestesia poiché la temperatura interna può essere persa rapidamente (spesso sono necessarie tecniche di modulazione della temperatura interna come i cuscinetti riscaldanti). Temperature corporee inferiori al normale possono richiedere la necessità di spingere l'AMF-mNPH troppo lontano, quando si cerca di raggiungere una dose termica specifica nel tumore, con conseguenti effetti inaccettabili nel tessuto non bersaglio (il riscaldamento a correnti parassite del tessuto non bersaglio è una di queste possibilità). Anche piccole deviazioni nella temperatura corporea interna possono portare a complicazioni fisiologiche indesiderate nel tumore o nel tessuto normale. Come accennato in precedenza, comunque valga la pena ripeterlo, per un riscaldamento accurato e riproducibile, è essenziale ottenere una corrispondenza tra la concentrazione tissutale mNP / Fe, la frequenza AMF e i parametri di monitoraggio della temperatura dell'intensità del campo e le dimensioni e la profondità del tessuto target. Ci deve essere una concentrazione basale di mNPs all'interno del tumore per consentire un riscaldamento misurabile. Il livello/capacità di calore dipende non solo dalla concentrazione tissutale di mNP (tessuto mg Fe/g) e dalla loro distribuzione relativa all'interno del tumore, ma anche dalla frequenza dell'AMF e dalla successiva intensità di campo. I cambiamenti in uno qualsiasi dei precedenti possono portare a diversi intervalli di temperature raggiungibili all'interno del tessuto. Attraverso molti anni di esperienza, abbiamo ottimizzato la concentrazione che utilizziamo per i trattamenti preclinici dei tumori e la frequenza e l'intensità del campo del sistema AMF per consentire un'attivazione sicura ed efficace. Poiché è impossibile misurare la temperatura/dose termica in tutti i siti tissutali, è anche essenziale posizionare il maggior numero possibile di sonde di temperatura in fibra ottica in siti strategici che consentano una valutazione dell'efficacia e della sicurezza in tempo reale, come mostrato nella Figura 2. Queste sonde consentono la registrazione delle temperature durante l'esperimento, consentendo una dosimetria accurata e una storia termica dell'esperimento. La Figura 3 mostra le curve generate durante un esperimento in vivo, evidenziando la capacità di monitorare da vicino la temperatura e regolare il sistema per mantenere le temperature del tumore entro l'intervallo desiderato. Nella figura 4 sono riepilogati i metodi in vivo.
Questi metodi in vivo, simili ai metodi in vitro, possono essere utilizzati per studiare diversi tipi di cancro, diverse dosi di ipertermia e con vari trattamenti combinati. Ad esempio, studi precedenti nel nostro laboratorio hanno studiato la combinazione di ipertermia e chemioterapia12. Abbiamo inoltre completato numerosi esperimenti di ipertermia e radiazioni per la determinazione dell'efficacia e dei meccanismi molecolari. I topi di controllo per questi esperimenti sono sottoposti a tutte le procedure tranne che per l'effettiva generazione di ipertermia. La Figura 5 contiene due grafici vulcanici che dimostrano geni differenzialmente espressi dopo il trattamento di ipertermia mNP in vitro e in vivo (mNPH). Queste cifre sono esempi di come utilizziamo tecniche molecolari per monitorare gli effetti dell'ipertermia.
Figura 1: Schema di ipertermia mNP in vitro. Questo schema dimostra il metodo per l'ipertermia di nanoparticelle magnetiche in vitro. Per garantire il riscaldamento, alle celle devono essere fornite particelle e tempo sufficienti per un adeguato assorbimento di mNP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Posizionamento dei cateteri per il monitoraggio della temperatura. Questa figura dimostra il posizionamento dei cateteri che ospitano le sonde di temperatura in fibra ottica per registrare le temperature in diverse posizioni nel tumore e / o nella regione tumorale. Questa cifra è adattata dal rif.19. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Monitoraggio della temperatura in tempo reale durante il trattamento di un tumore di topo. Questo grafico mostra le letture della temperatura in tempo reale che consentono di monitorare la temperatura corporea interna, le temperature ambientali e le temperature multiple all'interno del tumore, durante un esperimento in vivo. Il controllo delle temperature all'interno del tumore è dimostrato attraverso le variazioni minime su larga scala sulla porzione ingrandita della figura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Schema di ipertermia mNP in vivo. Questo schema dimostra il metodo per l'ipertermia di nanoparticelle magnetiche in vivo . L'iniezione di nanoparticelle sufficienti e il tempo sufficiente per la distribuzione e l'assorbimento, garantisce la capacità di fornire la dose termica desiderata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Espressione genica differenziale. Espressione genica differenziale dopo trattamento di ipertermia mNP in vitro (A) e in vivo (B). Questi grafici vulcanici rappresentano cambiamenti genetici su un asse x log 2, con significato sull'asse y, sia per i metodi mNPH in vitro che in vivo. Ogni cerchio rappresenta un gene diverso, con i 20 geni differenzialmente espressi più significativi etichettati. Più il gene è lontano da zero sull'asse x, maggiore è il cambiamento di piega, e più alto è il gene sull'asse y, minore è il valore p. Sebbene entrambi avessero la stessa dose termica, l'ipertermia in vivo ha portato a maggiori cambiamenti di espressione genica rispetto in vitro. Questi grafici sono esempi dei dati biologici che possono essere generati utilizzando il protocollo descritto. Il diagramma del vulcano in vitro è stato adattato dal ref.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La progettazione e l'implementazione di questo sistema fornisce la capacità di condurre esperimenti accurati e riproducibili in vitro e in vivo di ipertermia di nanoparticelle magnetiche. È fondamentale che il sistema sia progettato in modo tale che la frequenza AMF e l'intensità del campo siano adeguatamente abbinate al tipo di nanoparticelle magnetiche, alla concentrazione, alla posizione e alla temperatura del tessuto desiderate. Inoltre, il monitoraggio accurato della temperatura in tempo reale è fondamentale per la sicurezza e il calcolo di una dose termica accurata (minuti equivalenti cumulativi a 43 °C/CEM). Il posizionamento delle sonde, come mostrato nella Figura 1, consente il monitoraggio in tempo reale della dose termica e della temperatura corporea interna, come mostrato nella Figura 2.
Il primo passo nella somministrazione accurata dell'ipertermia con nanoparticelle magnetiche è la costruzione di un sistema sicuro per animali e operatori. Tutti i componenti del sistema dovrebbero essere ben compresi anche dal punto di vista operativo e della consegna. In questa situazione, ciò significa comprendere il potenziale delle correnti parassite AMF e sapere dove si trovano le particelle magnetiche. Le antenne, o bobine, sono un fattore chiave nella forma e nella forza del campo, e il sistema di raffreddamento utilizzato è importante per prevenire il surriscaldamento della bobina20. L'intensità di campo all'esterno del conduttore è direttamente proporzionale alla forza di corrente che scorre attraverso il conduttore. L'intensità del campo magnetico in qualsiasi punto dello spazio che circonda il conduttore è la somma vettoriale dei campi prodotti dai conduttori nell'area circostante. Il campo magnetico viene prodotto ad angolo retto rispetto al flusso di corrente e la forza diminuisce esponenzialmente, in funzione della distanza dal conduttore, secondo la regola21 dell'inverso del quadrato di Biot-Savart. Pertanto, il tubo quadrato viene utilizzato per l'ipertermia in vivo per un campo più uniforme all'interno della bobina. La creazione di un campo magnetico con la forza e il volume necessari per un sistema potenzialmente clinicamente rilevante, richiede un'elevata corrente elettrica. Pertanto, i progetti di antenne devono essere in grado di adattarsi a livelli di potenza elettrica significativi. Inoltre, le antenne AMF devono essere progettate in modo che la loro induttanza rientri nell'intervallo accettabile del generatore di energia. Alle frequenze tipicamente utilizzate, la maggior parte del flusso di corrente è sulla superficie del conduttore dell'antenna, il che significa che la superficie influisce sul riscaldamento resistivo che può essere ridotto al minimo eliminando i difetti superficiali. Questo riscaldamento resistivo significa anche che è necessario un sistema di raffreddamento della bobina per garantire che la bobina e l'ambiente non si surriscaldino.
Una limitazione del nostro design del sistema è che non consente una gamma totale di frequenze e campi magnetici, ma consente di generare campi appropriati per cellule, roditori e animali di grandi dimensioni. In particolare, l'intensità massima di campo disponibile da qualsiasi sistema di riscaldamento a induzione è direttamente correlata al flusso di corrente nell'antenna (bobina). I generatori AMF sono valutati in kilowatt, che vengono calcolati moltiplicando la tensione disponibile per la corrente disponibile (ampere). Quindi, un sistema da 10kW con un limite di 500 V avrebbe un amperaggio massimo di 20 A. La progettazione delle bobine determinerà quale limite viene raggiunto per primo, e quindi il limite dei sistemi. L'intensità del campo magnetico creato da qualsiasi corrente diminuisce esponenzialmente in funzione della distanza dal conduttore. Pertanto, una bobina di diametro maggiore con la stessa geometria di una bobina di diametro inferiore, eseguita sullo stesso sistema, avrebbe una forza di campo inferiore al centro della bobina. Pertanto, la dimensione e la forza del campo magnetico richieste sono limitate dalla capacità del generatore AMF. Costruire una bobina più grande e utilizzare più energia porta a ulteriori preoccupazioni, principalmente riscaldamento a correnti parassite.
Ci sono diversi problemi di sicurezza che devono essere affrontati quando si utilizza questo sistema per proteggere gli utenti, gli animali e il sistema stesso. In primo luogo, un'adeguata ventilazione della stanza deve essere mantenuta durante l'uso dell'anestesia. In secondo luogo, tutte le aree associate alla bobina devono essere libere da metallo e/o conduttori, comprese le miscele altamente saline. Gli utenti devono rimuovere anelli e altri gioielli quando lavorano intorno all'AMF e i campioni non devono contenere alcun tipo di metallo. Di massima importanza, le persone con pacemaker o altri dispositivi o oggetti impiantati dovrebbero consultare il proprio medico prima di lavorare intorno all'AMF. Per proteggere il sistema, è necessario utilizzare un sistema fail-safe che garantisca che le esigenze di raffreddamento del generatore e della bobina siano soddisfatte prima che venga applicata l'alimentazione. Inoltre, è necessario utilizzare una panoramica della telecamera termica per rilevare il riscaldamento involontario.
Per gli studi in vitro, i passi più importanti da seguire sono la concentrazione di ferro nelle cellule, la concentrazione delle cellule, i parametri AMF e la valutazione della dose termica. Le cellule possono essere trattate / riscaldate con ipertermia di nanoparticelle magnetiche posizionando le nanoparticelle magnetiche nel surnatante, nelle cellule o in entrambi. La quantità di riscaldamento delle nanoparticelle magnetiche dipenderà dal livello di nanoparticelle magnetiche / Fe. Se il desiderio è quello di trattare solo le cellule con ferro interiorizzato, la nostra esperienza è che le singole cellule tumorali assorbiranno solo un numero limitato di nanoparticelle magnetiche e che anche quando l'assorbimento è ottimale le cellule devono essere aggregate / pellettate per creare situazioni di riscaldamento cellulare, anche con AMF ottimizzato. Mantenere la temperatura dei mezzi e delle celle a livelli biologicamente rilevanti (quando non vengono riscaldati) è importante anche per una misurazione accurata del riscaldamento reale. La bobina solenoide a 14 giri qui descritta consente di mantenere temperature biologicamente rilevanti immergendo i campioni in una colonna d'acqua controllata termicamente.
Per gli studi in vivo, il mantenimento della temperatura interna animale e la misurazione accurata della temperatura all'interno del tumore sono fattori chiave. Questo sistema di contenimento degli animali e il design della bobina eliminano la deriva termica nell'ambiente dell'animale a causa delle impostazioni di bobina / potenza e aiutano a mantenere la normale temperatura corporea interna. Il mantenimento della temperatura interna corporea è fondamentale per risultati significativi dell'esperimento. La sonda rettale consente il monitoraggio in tempo reale della temperatura interna dell'animale. Quando è sotto anestesia, la temperatura interna di un animale diminuisce intrinsecamente. Per affrontare questa situazione, abbiamo sviluppato un sistema di riscaldamento ambientale che fornisce aria calda intorno al recipiente di contenimento degli animali, consentendo alla temperatura interna di rimanere nel range di normalità. Il mantenimento della normale temperatura interna è essenziale per garantire un'interpretazione accurata dei risultati del trattamento di ipertermia e l'eliminazione dei fattori ambientali. Il posizionamento delle sonde di monitoraggio della temperatura in più siti nel tessuto/tumore bersaglio è importante per ottenere una valutazione accurata della temperatura e della dose termica raggiunta. Poiché è estremamente difficile, se non impossibile, distribuire le nanoparticelle magnetiche in modo omogeneo all'interno di un tumore, conoscere i parametri di riscaldamento in più siti è essenziale per ottenere una dose termica tissutale / tumorale coerente e accurata. È importante notare che la concentrazione per gli studi in vitro e in vivo è variabile. Questa variazione è dovuta al fatto che ci sono meno confini nella coltura cellulare con le cellule che hanno più accesso alle mNP, quindi è possibile utilizzare una concentrazione inferiore. In vivo, una maggiore concentrazione è necessaria a causa della natura eterogenea dei tumori e della complicata morfologia 3D. Pertanto, l'utilizzo della stessa concentrazione di particelle in vivo e in vitro porterebbe a un numero molto minore di assorbimenti da parte delle cellule.
Questo manoscritto descrive i parametri e la strumentazione necessari per sviluppare un generatore di campo magnetico alternato efficace e flessibile e un sistema a bobina per trattamenti di ipertermia di nanoparticelle magnetiche. Questo sistema può essere utilizzato sia per studi in vitro che in vivo. Il sistema è efficace per l'ipertermia localizzata / mirata e il risparmio di tessuto normale che lo rende attraente, rispetto ad altri sistemi di ipertermia AMF-mNP. Questi trattamenti di ipertermia possono essere modificati per studiare gli effetti di diverse dosi, con una varietà di nanoparticelle o nanocarrier e trattamenti aggiuntivi. Poiché il riscaldamento dei tessuti, in particolare il riscaldamento delle nanoparticelle magnetiche, può essere influenzato da così tante variabili, è essenziale comprendere i parametri in un'indagine. Se questi criteri sono soddisfatti, l'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche può affrontare molte situazioni molecolari, cellulari e cliniche, incluso il controllo tumorale indipendente e adiuvante. Sebbene i metodi qui descritti richiedano uno sforzo significativo, se vengono seguite le linee guida, è possibile realizzare il pieno potenziale dell'ipertermia mNP.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato finanziato dai numeri di sovvenzione: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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