Summary
Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für die genaue Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie unter Verwendung eines ausgeklügelten Verabreichungs- und Überwachungssystems erforderlich sind.
Abstract
Hyperthermie wird seit langem bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Die Techniken reichen von der intratumoralen Einführung von heißen Eisenstäben bis hin zu systemisch verabreichten magnetischen Nanopartikeln, die auf Tumorantikörper abzielen, bei Temperaturen von 39 °C (Fieber) bis 1.000 °C (Elektrokauterisation) und Behandlungszeiten von Sekunden bis Stunden. Die Temperatur-Zeit-Beziehung (thermische Dosis) bestimmt die Wirkung mit hohen thermischen Dosen, die zur Gewebeablation führen, und niedrigeren thermischen Dosen, die zu subletalen Effekten wie erhöhtem Blutfluss, Akkumulation von Medikamenten und Immunstimulation führen. Eine der vielversprechendsten medizinischen Therapien ist die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Bei dieser Technik werden magnetische Nanopartikel, die systemisch oder intratumoral abgegeben werden können, mit einem nicht-invasiven, nicht-toxischen magnetischen Wechselfeld aktiviert. Die Größe, der Aufbau und die Assoziation der magnetischen Nanopartikel sowie die Frequenz und Feldstärke des Magnetfeldes sind wichtige Erwärmungsdeterminanten. Wir haben ausgeklügelte Instrumente und Techniken entwickelt, um eine reproduzierbare magnetische Nanopartikel-Hyperthermie in großen und kleinen Tiermodellen und kultivierten Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz, der eine kontinuierliche Echtzeit-Temperaturüberwachung an mehreren Standorten verwendet, ermöglicht die Abgabe genau definierter thermischer Dosen an das Zielgewebe (Tumor) oder die Zielzellen, während die Erwärmung des Nicht-Zielgewebes begrenzt wird. Die präzise Steuerung und Überwachung der Temperatur an mehreren Standorten und die Verwendung des Industriestandardalgorithmus (kumulative äquivalente Minuten bei 43 °C /CEM43) ermöglichen eine genaue Bestimmung und Quantifizierung der thermischen Dosis. Unser System, das eine Vielzahl von Temperaturen, thermischen Dosen und biologischen Effekten ermöglicht, wurde durch eine Kombination aus kommerziellen Akquisitionen und internen technischen und biologischen Entwicklungen entwickelt. Dieses System wurde so optimiert, dass eine schnelle Umstellung zwischen Ex-vivo-, In-vitro- und In-vivo-Techniken möglich ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie eine effektive Technik und ein System zur Bereitstellung einer reproduzierbaren und genauen magnetischen Nanopartikeltherapie (mNP) Hyperthermie entworfen, entwickelt und implementiert werden können.
Introduction
Hyperthermie wurde in der Vergangenheit in der Krebstherapie eingesetzt, entweder allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen. Obwohl es eine lange Geschichte der Verwendung hat, wird die vorteilhafteste Methode zur Verabreichung dieser Behandlung immer noch diskutiert und hängt vom Krankheitsort und -ort ab. Zu den Verfahren zur Hyperthermieabgabe gehören Mikrowellen-, Hochfrequenz-, fokussierter Ultraschall, Laser und metallische Nanopartikel (wie Gold oder Eisenoxid)1,2,3,4. Diese Verabreichungsmethoden können zu einer Reihe von Behandlungstemperaturen von Fieber bis zu Hunderten von Grad Celsius führen. Die biologische Wirkung der Hyperthermie hängt in erster Linie von den verwendeten Temperaturen und der Dauer der Behandlungab 5. Für dieses Manuskript und Zweck konzentrieren wir uns auf die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Diese Methode ermöglicht fokussierte, lokalisierte, gut überwachte und kontrollierte Temperaturänderungen unter Verwendung von ungiftigen, von der FDA zugelassenen Eisenoxid-Nanopartikeln.
Ein Fallstrick bei anderen Hyperthermie-Modalitäten ist das Fehlen eines präzisen zellulären Targetings. Hyperthermie hat kein inhärent hohes therapeutisches Verhältnis, daher ist eine sorgfältige Thermometrie und gezieltes Targeting erforderlich6. mNPH ermöglicht die systemische oder intratumorale Injektion von mNPs, wobei Wärme nur dort erzeugt wird, wo sich die mNPs befinden, wodurch die Behandlung direkt auf den Tumor ausgerichtet ist. mNPH kann wirksam sein, wenn sich die magnetischen Nanopartikel innerhalb oder außerhalb der Zelle befinden. Für die Krebstherapie ist die allgemeine Übersicht von mNPH, dass die magnetischen Nanopartikel injiziert werden (intratumoral oder intravenös), dann wird ein magnetisches Wechselfeld angelegt, wodurch sich die magnetischen Pole der Nanopartikel ständig neu ausrichten, was zu einer lokalen Erwärmung der Zellen und des Gewebes führt, die mit den Nanopartikeln assoziiertsind 7,8 . Durch die Einstellung des Volumens der Nanopartikel und der Frequenz/Stärke des magnetischen Wechselfeldes (AMF) ist es möglich, die im Gewebe erzeugte Temperatur sorgfältig zu steuern.
Diese Behandlung funktioniert gut bei Tumoren, die sich in der Nähe der Körperoberfläche befinden, da tiefere Tumore eine stärkere AMF erfordern, so dass das Risiko einer Wirbelstromerwärmung steigt9. Es gibt Hinweise darauf, dass Hyperthermie klinisch als Monotherapie eingesetzt wird, jedoch wird Hyperthermie oft mit einer Strahlentherapie oder Chemotherapie kombiniert, was zu einer gezielteren Anti-Krebs-Wirkung führt10,11,12. Der klinische Nachweis von Hyperthermie in Kombination mit einer Strahlentherapie wurde in einer früheren Veröffentlichungüberprüft 13. Unser Labor hat eine Vielzahl von Tieren, von Mäusen über Schweine bis hin zu spontanen Krebserkrankungen bei Hunden, mit der mNPH-Methode12,14,15 erfolgreich behandelt. Dieses Protokoll richtet sich an alle, die daran interessiert sind, die Auswirkungen einer lokalisierten Hyperthermiebehandlung allein oder in Kombination mit anderen Therapien zu untersuchen.
Einer der wichtigsten Faktoren bei der Hyperthermie ist die Fähigkeit, die thermische Dosis, die an das Ziel-/Tumorgewebe abgegeben wird, in Echtzeit zu messen und zu verstehen. Eine Standardmethode zur Berechnung und zum Vergleich der Dosis ist der Nachweis der kumulativen äquivalenten Erhitzungsminuten bei 43 °C. Dieser Algorithmus ermöglicht den Vergleich von Dosen unabhängig vom Abgabesystem, maximalen und minimalen Temperaturen (innerhalb eines bestimmten Bereichs) und Aufheiz-/Abkühlparametern 5,16. Die CEM-Berechnung funktioniert am besten für Temperaturen zwischen 39-57 °C5. Zum Beispiel haben wir in einigen der von uns durchgeführten Studien eine thermische Dosis von CEM43 30 (d.h. 30 min bei 43 °C) gewählt. Die Wahl dieser Dosis ermöglichte es uns, eine sichere, wirksame, immungenetische Wirkung in vitro zu untersuchen, sowohl allein als auch in Kombination mit einer EinzeldosisStrahlung 17.
Bei der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie gibt es mehrere Faktoren, die beim Aufbau eines geeigneten Verabreichungssystems berücksichtigt werden müssen. Das Instrumentierungsdesign umfasst wichtige Sicherheitsfaktoren, wie z. B. die Verwendung eines Kühlers, um sicherzustellen, dass die Magnetfeldübertragungsgeräte auch bei hoher Leistung kühl bleiben, und ausfallsichere Verfahren, die verhindern, dass das System eingeschaltet wird, wenn nicht alle Temperatur-, Leistungsbewertungs- und Steuerungssysteme aktiviert wurden. Darüber hinaus gibt es wichtige biologische Faktoren, die sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Situationen berücksichtigt werden müssen. Bei der Verwendung von kultivierten Zellen ist es notwendig, in Wachstumsmedien zu behandeln und auf einer konstanten lebensfähigen Temperatur zu halten, um physiologische Veränderungen zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinflussen könnten. Für einzelne Nanopartikeltypen ist es wichtig, die spezifische Absorptionsrate (SAR) zu kennen, wenn AMF-basierte Heizparameter berechnet werden. Ebenso ist es wichtig, die mNP/Fe-Konzentration in Zellen und Geweben zu kennen, die notwendig ist, um die gewünschte Erwärmung zu erreichen. In-vivo-Methoden erfordern noch mehr Liebe zum Detail, da das Tier während der Behandlung unter Narkose gehalten werden muss und die Körperkerntemperatur des Tieres während der gesamten Behandlung auf einem normalen Niveau gehalten werden muss. Wenn die Körpertemperatur des Tieres sinkt, wie dies unter Narkose der Fall ist, kann dies das Gesamtergebnis in Bezug auf die thermische Dosis des zu behandelnden Gewebes beeinflussen.
In diesem Manuskript diskutieren wir die Methoden, die verwendet werden, um ein vielseitiges magnetisches Nanopartikel-Hyperthermiesystem zu entwerfen und zu konstruieren, sowie wichtige Anwendungsfaktoren, die berücksichtigt werden müssen. Das beschriebene System ermöglicht die robuste, konsistente, biologisch angemessene, sichere und gut kontrollierte Abgabe von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie. Schließlich ist zu beachten, dass die von uns durchgeführten mNPH-Studien häufig andere Therapien wie Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie beinhalten. Damit diese Ergebnisse aussagekräftig sind, ist es wichtig zu bestimmen, wie sich die abgegebene Wärme auf die Wirksamkeit und/oder Sicherheitstoxizität anderer Modalitäten (oder umgekehrt) und das Wohlbefinden des Tieres auswirken kann. Aus diesem Grund und den zuvor genannten Dosimetrie- und Therapiesituationen ist es unerlässlich, der Dosiergenauigkeit der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie und den kontinuierlichen Kern- und Zieltemperaturmessungen strikte Aufmerksamkeit zu schenken. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache, konsistente Methode und Beschreibung für die Bereitstellung einer sicheren und effektiven magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie bereitzustellen.
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Protocol
Das Dartmouth College Animal Care and Use Program ist von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) akkreditiert und hält sich an alle Richtlinien und Vorschriften von UDSA und NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle In-vivo-Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Das Euthanasieverfahren entspricht den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren aus dem Jahr 2020.
1. Instrumentierung/Aufbau des Systems
- Entwerfen Sie eine benutzerdefinierte AMF-Antenne (Spule) als geschlossene Schleife und wählen Sie Formen aus, um das gewünschte Magnetfeld zu erzeugen. Verwenden Sie Induktivitätsformeln und Eigenschaften aus der Auswahl des Stromgenerators, um kompatible Spulen zu entwerfen, um das gewünschte Feld zu erzeugen. Verwenden Sie unterschiedliche Designs für In-vitro- und In-vivo-Experimente.
- Stellen Sie sicher, dass die Induktivität der AMF-Antenne innerhalb des akzeptablen Bereichs des Stromgenerators liegt. Fügen Sie Kondensatoren hinzu oder subtrahieren Sie sie, um die Antenne an den Stromgenerator anzupassen (abzustimmen).
- Entwerfen Sie für In-vitro-Experimente eine spiralförmige Spule mit 14 Windungen und einem Innendurchmesser von 2 cm und einer Länge von 14 cm, die 1,5-ml-Röhrchen enthalten kann, so dass mehrere Proben gleichzeitig behandelt werden können. Isolieren Sie die Spule mit einem Vinylpolymer und verwenden Sie einen Styropor-Abstandhalter, um die Spule von den Rohren zu trennen. Einzelheiten zu den Entwurfsspezifikationen und -überlegungen sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.
- Erwerben Sie für In-vivo-Experimente eine speziell angefertigte Ganzkörper-Spiralspule von einem Hersteller mit proprietären Designinformationen. Verwenden Sie einen 8-mm-Vierkantschlauch (da dies ein gleichmäßigeres Feld innerhalb der Bohrung der Spule erzeugt) und einen Konzentrator im Zielbehandlungsbereich. Machen Sie den Konzentrator 5,0 cm lang, mit insgesamt 5 Umdrehungen, was zu einem Innendurchmesser von 3,6 cm und einem Außendurchmesser von 5,2 cm führt, und positionieren Sie sich im Zielbereich. Umgeben Sie die Spule mit einer Polycarbonat-Schale.
- Verwenden Sie einen AMF-Generator mit einstellbarer Leistung und Frequenz von 10 kW oder mehr als Stromquelle. Die Induktivität passt die Stromquelle und die Antennen/Spulen auf einen Bereich von 0,62 bis 1,18 μHenries (μH) an, was Frequenzen zwischen 30 und 300 kHz ermöglicht. Kühlen Sie den Generator mit recyceltem Wasser durch eine Zentrifugalpumpe, deren Druck auf 50 psi geregelt ist.
- Kühlen Sie die Spulen mit einem Kühler mit einer Kühlleistung von 5,6 Tonnen, der 25% Wärmeträgerflüssigkeit auf Ethylenglykolbasis, die mit Wasser verdünnt ist, durch die AMF-Antenne pumpt. Stellen Sie die Temperatur des Kühlers so ein, dass die Antenne die Probe nicht erwärmt oder kühlt.
- Für die Tiereindämmung konstruieren Sie einen schlauchförmigen Halter, der in der Mitte der Spule mit einem Luftspalt von 0,5 cm zwischen dem Halter und der Spulenoberfläche aufgehängt werden kann. Schließen Sie eine einstellbare konditionierte Luftpumpe an, die Luft durch die Schale um die Spule zirkulieren lässt, und stellen Sie sie so ein, dass sie eine normale Tierkerntemperatur aufrechterhält. Verbinden Sie das Anästhesiegerät mit dem röhrenförmigen Tierhalter in der Nähe des Kopfes des Tieres, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.
- Erstellen Sie für die Zelleindämmung eine Vorrichtung, die Wasser aus einem Wasserbad durch den Abstandshalter zirkulieren lässt, in dem sich die Schläuche befinden. Stellen Sie die Temperatur dieses Wasserbades so ein, dass die Rohre von Wasser bei 37 °C umgeben sind.
- Verwenden Sie faseroptische Sonden, um die Temperaturen innerhalb des Tumors, des Tierkerns und der Tierumgebung zu überwachen, oder für In-vitro-Studien, um die Temperatur des Zellpellets und des Wassers, das die Röhrchen umgibt, zu überwachen.
- Verwenden Sie magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Größe von 100 nm für alle Experimente.
ANMERKUNG: Konzentration und spezifische Absorptionsrate (SAR) sind zwei Merkmale, die bei der Auswahl von Nanopartikeln berücksichtigt werden müssen, da sie sich direkt auf die mögliche Wärme- und Wärmedosis auswirken18.
2. Hyperthermie in vitro
- Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Platte 150.000 Zellen/Well in 6-Well-Platten mit 2 mL vollständigem Medium.
- Bestimmen Sie die geeignete Behandlung für jede Vertiefung, d.h. Zellen ohne mNPs und ohne AMF, Zellen mit mNPs und ohne AMF, Zellen ohne mNPs und AMF, Zellen mit mNPs und AMF.
HINWEIS: Stellen Sie außerdem sicher, dass geeignete Kontrollen vorhanden sind, wenn Sie Hyperthermie mit einer anderen Therapie kombinieren. AMF wird in einem Standard-Forschungslabor durchgeführt, das mit den erforderlichen Strom- und Kühlkapazitäten nachgerüstet ist. - 24 Stunden nach der Beschichtung mNPs in die entsprechenden Vertiefungen geben, wie im vorherigen Schritt bestimmt. Fügen Sie mNPs zu einer Konzentration von 3 mg Eisen / ml hinzu. Stellen Sie sicher, dass die mNPs im gesamten Bohrloch verteilt sind, indem Sie entweder eine Standardmedien/mNP-Lösung erstellen (alte Medien entfernen, diese Lösung hinzufügen) oder indem Sie die mNPs direkt und sanft wirbelnde Platten hinzufügen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.
- Beginnen Sie die Behandlung 48 Stunden nach der Zugabe von mNPs, wenn die Wells ~ 80% konfluent sind, indem Sie das Medium entfernen und die Wells mit frischen Medien waschen. Entfernen Sie das Medium.
- Fügen Sie 0,5 ml Trypsin zu jedem behandelten Wohlbefinden hinzu und schwenken Sie es sanft. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind.
- Geben Sie 1 ml Medium in jede Vertiefung, um die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen zu sammeln. Sammeln Sie alle Zellen aus dem Brunnen (~ 1 x 106 Zellen). Verwenden Sie für jede Vertiefung ein deutlich beschriftetes separates Röhrchen.
- Spinnröhrchen bei 60 x g für 2-3 min, damit die Zellen pelletieren können. Bewahren Sie das Pellet im Medium auf.
- Legen Sie die Schläuche in den mit Wasser gefüllten Abstandhalter in der Spule. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass das Medium und das Zellpellet auf 37 °C gehalten werden. Überwachen Sie die Temperatur innerhalb der Röhre und des Wasserbades mit separaten faseroptischen Temperaturfühlern.
- Schalten Sie den Kühler ein und überprüfen Sie, ob das Kühlmittel durch die Spule fließt. Schalten Sie die Stromquelle ein, und stellen Sie den Prozentsatz des Maximums auf das gewünschte Feld ein. Betreiben Sie die 14-Gang-Magnetspule, die von einem 10-kW-Generator gespeist wird, bei 165 kHz und 23,87 kA/m (300 Oe).
- Platzieren Sie einen separaten faseroptischen Temperaturfühler in einem der Rohre. Behandeln Sie die Zellen bis zur zuvor festgelegten thermischen Protokolldosis. Ein Beispiel ist 30 min bei 43 °C (CEM43 von 30).
- Resuspendieren Sie die Zellen in den Medien, die sich in ihren Röhrchen befinden, und beschichten Sie sie in neue 6-Well-Platten. Beschriften Sie die neuen Schilder deutlich. Das Ziel ist es, alle gesammelten Zellen (~ 1 x 106 Zellen) neu zu beschichten.
HINWEIS: Es sollten neue 6-Well-Platten verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu kultivierenden Zellen behandelt werden. Wenn die alten Platten verwendet werden, können immer noch Zellen auf den Platten verbleiben, die nicht erfolgreich trypsinisiert wurden. - Falls erforderlich, für das nächste experimentelle Verfahren, lysieren Sie die Zellen für die RNA- oder Proteinexpressionsanalyse.
3. Hyperthermie in vivo
- Zellkultur und Impfung
- Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Verwenden Sie Teller / Schüsseln, die genügend Zellen für die Impfung der gewünschten Anzahl von Tieren liefern. Zum Beispiel werden 10, 100 mm Schalen, die mit 100.000 Zellen plattiert sind, mit genügend Zellen für 20 Mäuseinjektionen innerhalb von 48 Stunden konfluieren.
- Trypsinisieren Sie die Zellen und sammeln Sie sie mit reinem RPMI-Medium (kein FBS oder Pen/Streptokokken).
- Zählen Sie die Zellen und erstellen Sie eine Lösung für die gewünschte Zellkonzentration, basierend auf dem Impfvolumen und der Anzahl der Mäuse.
- Betäuben Sie 6 Wochen alte weibliche C57Bl/6-Mäuse mit verdampftem Isofluran und Sauerstoff. Legen Sie die Tiere in einen Plexiglaskasten mit 5% Isofluran und 95% Sauerstoff, bis sie induziert sind. Nach der Induktion wird das Tier entnommen und ein Stirnkegel mit 2 % Isofluran verwendet, um die Schritte 3.1.5-3.1.7 und 3.3.3-3.3.6 abzuschließen.
HINWEIS: Für die Anästhesie während der Behandlung verwenden Sie eine eingebaute Anästhesieeindämmung. Befolgen Sie die institutionellen Standardprotokolle für die Anästhesie der Maus. Stellen Sie vor dem Tierversuch eine entsprechende IACUC-Zulassung sicher. Bringen Sie das Tier nach der Anästhesie in den Käfig zurück und überwachen Sie die Genesung, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten. - Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren.
- Rasieren Sie die rechte Flanke mit einem Elektrorasierer.
- Reinigen Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie 1-2 x 106 Zellen mit einer 100 μL Glasspritze mit einer 28 G Nadel, dispergiert in 50 μL Medien intradermal auf der rasierten rechten Flanke der Anästhesie.
- Tumorwachstum/Nanopartikel-Injektion
- Messen Sie Tumore in 3 Dimensionen mit Messschiebern (Länge, Breite und Tiefe) und berechnen Sie Volumina nach (Länge x Breite x Tiefe x π)/6.
- Wenn das Tumorvolumen 120 mm3 (+/- 20mm3) erreicht, werden die Tiere untersucht. Entwerfen Sie die Studie und stellen Sie sicher, dass es geeignete Kontroll- und Behandlungsgruppen gibt, einschließlich Kombinationstherapie-Kohorten (d. h. Kontrolle, mNPH, Bestrahlung und die Kombination).
- Betäubung von Mäusen, die mNPs erhalten, wie in 3.1.4 beschrieben.
- Reinigen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie mNPs 3 h vor der AMF-Behandlung in den Tumor. Injizieren Sie ein Volumen, so dass die Dosis 7,5 mg Eisen / cm3 des Tumors beträgt.
HINWEIS: Unveröffentlichte Daten aus dem Labor deuten darauf hin, dass die maximale mNP-Aufnahme nach 3-6 Stunden erfolgt.
- AMF-Behandlung
- Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Kerntemperatur aufrechtzuerhalten.
- Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren. Entfernen Sie die Ohrmarke oder andere Metallgegenstände an der Maus.
- Setzen Sie vorsichtig einen geschmierten faseroptischen Temperaturfühler in das Rektum der Maus ein.
- Legen Sie einen Katheter in den Tumor und entfernen Sie die Nadel. Schneiden Sie den Katheter so, dass er nicht zu sehr aus dem Tumor herausragt.
HINWEIS: Die faseroptischen Temperaturkatheter werden platziert und entfernt, während sich die Mäuse unter Vollnarkose befinden, d.h. die Katheter sind nur während der Tumorerwärmung an Ort und Stelle. Mäuse erhalten zum Zeitpunkt des Eingriffs eine subkutane Einzeldosis eines NSAID-Analgesiemedikaments, Ketoprofen (5 mg/kg). Wir haben keine kurz- oder langfristigen Beschwerden oder Morbiditäten im Zusammenhang mit der Platzierung der Katheter beobachtet. - Führen Sie einen faseroptischen 3-Sensor-Temperaturfühler in den Katheter ein. Der Katheter schützt die faseroptischen Temperaturfühlersensoren.
- Kleben Sie die rektale und intratumorale Sonde an den Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass sie an Ort und Stelle bleiben.
- Legen Sie die Maus in ein 50-ml-Röhrchen und gehen Sie mit dem Kopf nach unten. Der Schlauch sollte ein Loch in der Nähe des Kopfes haben, wo die Anästhesie angeschlossen und abgegeben wird.
- Legen Sie den Schlauch in die Spule und schließen Sie die Anästhesie wieder an.
- Legen Sie einen faseroptischen Temperaturfühler locker in die Röhre, um die Umgebungstemperatur zu messen.
- Schalten Sie den Kühler ein und stellen Sie sicher, dass das Kühlmittel zirkuliert.
- Überprüfen und stellen Sie sicher, dass die Computersoftware die verschiedenen Temperaturen anzeigt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, damit eine CEM43-Berechnung in Echtzeit angezeigt werden kann. Das erforderliche CEM43 ist die zuvor festgelegte Dosis.
HINWEIS: Bevor der Magnet eingeschaltet wird, stellen Sie sicher, dass keine Metallgegenstände am Tier befestigt sind, da sich diese schnell erwärmen. Stellen Sie außerdem sicher, dass jeder im Raum keinen Herzschrittmacher hat und es für sie sicher ist, dort zu sein. - Schalten Sie den Magneten bei einem niedrigen Leistungsprozentsatz ein.
- Stellen Sie sicher, dass die faseroptischen Temperaturfühler Temperaturänderungen aufzeichnen. Die Temperaturen steigen an, sobald das AMF aktiviert wird, wenn das Feld zunimmt. Stellen Sie sicher, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 38 °C bleibt. Regulieren Sie die Kerntemperatur mit dem klimatisierten Luftmantel.
- Passen Sie die Stärke des Magnetfeldes an, indem Sie die Leistung des Generators mit dem eingebauten Einstellrad ändern, das wiederum das Temperaturniveau im Tumor steuert.
- Schalten Sie die AMF ab, sobald die gewünschte Dosis, wie sie zuvor vom Benutzer bestimmt wurde (z. B. CEM43 40), innerhalb des Tumors erreicht ist.
- Sobald die AMF abgeschaltet ist, entfernen Sie den Schlauch von der Spule.
- Nehmen Sie die Maus aus dem Röhrchen und ziehen Sie die verschiedenen Sonden und den Katheter heraus. Wenn nötig, markieren Sie das Tier mit einer neuen Ohrmarke aus Metall.
- Sobald die Behandlungen abgeschlossen sind, schalten Sie den Kühler aus.
- Erholen Sie die Tiere aus der Narkose, um Komplikationen zu vermeiden. Überwachen Sie ihr Verhalten, um sicherzustellen, dass sie zur Normalität zurückkehren.
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Representative Results
In-vitro-Studien
Zellen erreichen und halten die gewünschte Temperatur und thermische Dosis nur dann aufrecht, wenn die Menge und Konzentration der magnetischen Nanopartikel / Eisen und der AMF entsprechend abgestimmt sind. Bei der Verwendung von magnetischen Nanopartikeln zur Erwärmung von Zellen in vitro (und in vivo) sollte beachtet werden, dass zur Erzielung einer Hyperthermie in Zellen mit internalisierten magnetischen Nanopartikeln ein bestimmtes Maß an intrazellulärem mNP / Fe erforderlich ist und die Anzahl und Nähe der mNP-beladenen Zellen zueinander erforderlich ist. Wenn der Gehalt an mNP/Fe in den Zielzellen/-geweben ausreicht, um einen Heizeffekt zu erzielen, kann die Magnetfeldfrequenz und -stärke eingestellt werden, um die gewünschte Temperatur und Wirkung zu erzielen. Bei richtiger Beschichtung können weitere Studien durchgeführt werden, die genetische und molekulare Unterschiede zwischen verschiedenen Dosen und Zeitpunkten untersuchen17. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der In-vitro-Methoden.
Mit diesen In-vitro-Methoden können zelluläre mRNA- und Proteinexpressionsänderungen untersucht werden. Ein aktuelles Beispiel aus unserem Labor ermittelte immungenetische Unterschiede nach CEM43 30 mNPH-Behandlung, einer 8-Gy-Strahlenbehandlung und der Kombination. Wir waren in der Lage, Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Expression über immun- und zytotoxische Signalwege hinweg zu identifizieren, um den Mechanismus hinter den Effekten besser zu verstehen und wie sie synergistisch kombiniertwerden 17. Jedes Experiment verwendet eine Vielzahl von Umgebungs- und beheizten Kontrollproben. Die Kontrollpersonen haben unterschiedliche mRNA- und Proteinexpressionsniveaus im Vergleich zu denen, die eine Hyperthermie-Behandlung erhalten.
In-vivo-Studien
In In-vivo-Studien gibt es zusätzliche Überlegungen. Unabhängig von der thermischen Zieldosis ist es unbedingt erforderlich, eine physiologisch akzeptable Kerntemperatur im zu behandelnden Tier aufrechtzuerhalten. Dies kann bei Nagetieren unter Narkose eine Herausforderung darstellen, da die Kerntemperatur schnell verloren gehen kann (Kerntemperaturmodulationstechniken wie Heizkissen sind oft erforderlich). Niedrigere Körpertemperaturen als normal können es erforderlich machen, das AMF-mNPH zu weit zu drücken, wenn versucht wird, eine bestimmte thermische Dosis im Tumor zu erreichen, was zu inakzeptablen Effekten im Nicht-Zielgewebe führt (Nicht-Zielgewebe-Wirbelstromerwärmung ist eine solche Möglichkeit). Schon geringe Abweichungen der Körperkerntemperatur können zu unerwünschten physiologischen Komplikationen im Tumor oder im normalen Gewebe führen. Wie bereits erwähnt, ist es für eine genaue, reproduzierbare Erwärmung unerlässlich, eine Übereinstimmung zwischen der mNP/Fe-Gewebekonzentration, der AMF-Frequenz und den Temperaturüberwachungsparametern der Feldstärke und der Zielgewebegröße und -tiefe zu erreichen. Es muss eine Ausgangskonzentration von mNPs im Tumor vorhanden sein, um eine messbare Erwärmung zu ermöglichen. Die Höhe der Wärme hängt nicht nur von der mNP-Gewebekonzentration (mg Fe/g Gewebe) und ihrer relativen Verteilung im Tumor ab, sondern auch von der Häufigkeit der AMF und der anschließenden Feldstärke. Änderungen in einem der oben genannten können zu unterschiedlichen Bereichen von erreichbaren Temperaturen innerhalb des Gewebes führen. Durch langjährige Erfahrung haben wir die Konzentration, die wir für präklinische Tumorbehandlungen verwenden, sowie die Frequenz und Feldstärke des AMF-Systems optimiert, um eine sichere und effektive Aktivierung zu ermöglichen. Da es unmöglich ist, die Temperatur/thermische Dosis an allen Gewebestellen zu messen, ist es auch wichtig, so viele faseroptische Temperatursonden wie möglich an strategischen Stellen zu platzieren, die eine Echtzeitbewertung der Wirksamkeit und Sicherheit ermöglichen, wie in Abbildung 2 zu sehen ist. Diese Sonden ermöglichen die Aufzeichnung der Temperaturen während des gesamten Experiments, was eine genaue Dosimetrie und den thermischen Verlauf des Experiments ermöglicht. Abbildung 3 zeigt Kurven, die während eines In-vivo-Experiments erzeugt wurden, und unterstreicht die Fähigkeit, die Temperatur genau zu überwachen und das System anzupassen, um die Tumortemperaturen innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten. Abbildung 4 fasst die In-vivo-Methoden zusammen.
Diese In-vivo-Methoden, ähnlich den In-vitro-Methoden, können verwendet werden, um verschiedene Krebsarten, verschiedene Hyperthermie-Dosen und verschiedene Kombinationsbehandlungen zu untersuchen. Frühere Studien in unserem Labor haben beispielsweise die Kombination von Hyperthermie und Chemotherapieuntersucht 12. Darüber hinaus haben wir zahlreiche Hyperthermie- und Bestrahlungsexperimente zur Bestimmung der Wirksamkeit und der molekularen Mechanismen durchgeführt. Die Kontrollmäuse für diese Experimente durchlaufen alle Verfahren außer der eigentlichen Erzeugung von Hyperthermie. Abbildung 5 zeigt zwei Vulkandiagramme, die differentiell exprimierte Gene nach einer in vitro und in vivo mNP-Hyperthermiebehandlung (mNPH) zeigen. Diese Zahlen sind Beispiele dafür, wie wir molekulare Techniken einsetzen, um die Hyperthermie-Effekte zu überwachen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der In-vitro-mNP-Hyperthermie. Dieses Schema zeigt das Verfahren zur In-vitro-Hyperthermie mit magnetischen Nanopartikeln. Um eine Erwärmung zu gewährleisten, müssen den Zellen genügend Partikel und Zeit für eine ausreichende mNP-Aufnahme zur Verfügung gestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Platzierung von Kathetern zur Temperaturüberwachung. Diese Abbildung zeigt die Platzierung von Kathetern, in denen die faseroptischen Temperatursonden untergebracht sind, um Temperaturen an verschiedenen Stellen im Tumor und/oder in der Tumorregion aufzuzeichnen. Diese Zahl ist aus Ref.19 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Echtzeit-Temperaturüberwachung während der Behandlung eines Maustumors. Diese Grafik zeigt die Echtzeit-Temperaturmesswerte, die es ermöglichen, die Körperkerntemperatur, die Umgebungstemperaturen und mehrere Temperaturen innerhalb des Tumors während eines In-vivo-Experiments zu überwachen. Die Kontrolle der Temperaturen innerhalb des Tumors wird durch die minimalen großräumigen Variationen des vergrößerten Teils der Abbildung demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der in vivo mNP-Hyperthermie. Dieses Schema zeigt das Verfahren zur in vivo magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie. Die Injektion von ausreichend Nanopartikeln sowie genügend Zeit für die Verteilung und Absorption stellt sicher, dass die gewünschte thermische Dosis abgegeben werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Differentielle Genexpression. Differentielle Genexpression nach in vitro (A) und in vivo (B) mNP-Hyperthermie-Behandlung. Diese Vulkandiagramme repräsentieren genetische Veränderungen auf einer log 2-x-Achse, mit Bedeutung auf der y-Achse, sowohl für in vitro als auch in vivo mNPH-Methoden. Jeder Kreis repräsentiert ein anderes Gen, wobei die 20 signifikantesten differentiell exprimierten Gene markiert sind. Je weiter das Gen auf der x-Achse von Null entfernt ist, desto größer ist die Faltenänderung, und je höher das Gen auf der y-Achse ist, desto niedriger ist der p-Wert. Obwohl beide die gleiche thermische Dosis aufwiesen, führte die In-vivo-Hyperthermie zu größeren Veränderungen der Genexpression als in vitro. Diese Diagramme sind Beispiele für die biologischen Daten, die mit dem beschriebenen Protokoll generiert werden können. Das In-vitro-Vulkandiagramm wurde von Ref.17 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzendes Dossier 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Design und die Implementierung dieses Systems bietet die Möglichkeit, genaue und reproduzierbare In-vitro- und In-vivo-Experimente zur magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie durchzuführen. Es ist wichtig, dass das System so ausgelegt ist, dass die AMF-Frequenz und die Feldstärke angemessen auf den magnetischen Nanopartikeltyp, die Konzentration und die gewünschte Gewebeposition und -temperatur abgestimmt sind. Darüber hinaus ist die genaue Überwachung der Temperatur in Echtzeit entscheidend für die Sicherheit und die Berechnung einer genauen thermischen Dosis (kumulative äquivalente Minuten bei 43 °C/ CEM). Die Platzierung der Sonden, wie in Abbildung 1 gezeigt, ermöglicht die Echtzeitüberwachung der thermischen Dosis und der Körperkerntemperatur, wie in Abbildung 2 dargestellt.
Der erste Schritt zur präzisen Verabreichung der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie ist der Aufbau eines sicheren Systems für Tiere und Bediener. Alle Komponenten des Systems sollten auch aus Sicht des Betriebs und der Lieferung gut verstanden werden. In dieser Situation bedeutet das, das Potenzial für AMF-Wirbelströme zu verstehen und zu wissen, wo sich magnetische Partikel befinden. Die Antennen oder Spulen sind ein Schlüsselfaktor für die Form und Stärke des Feldes, und das verwendete Kühlsystem ist wichtig, um eine Überhitzung der Spulezu verhindern 20. Die Feldstärke außerhalb des Leiters ist direkt proportional zur Stromstärke, die durch den Leiter fließt. Die magnetische Feldstärke an einem beliebigen Punkt im Raum, der den Leiter umgibt, ist die Vektorsumme der Felder, die von den Leitern in der Umgebung erzeugt werden. Das Magnetfeld wird im rechten Winkel zum Stromfluss erzeugt und die Stärke nimmt exponentiell ab, als Funktion des Abstands vom Leiter, gemäß der Biot-Savart-Regel21 im umgekehrten Quadrat. So werden Vierkantschläuche für die In-vivo-Hyperthermie verwendet, um ein gleichmäßigeres Feld innerhalb der Spule zu erreichen. Die Erzeugung eines Magnetfeldes mit der Stärke und dem Volumen, die für ein potenziell klinisch relevantes System erforderlich sind, erfordert einen hohen elektrischen Strom. Daher müssen Antennenkonstruktionen in der Lage sein, signifikante elektrische Leistungen aufzunehmen. Außerdem müssen AMF-Antennen so ausgelegt sein, dass ihre Induktivität innerhalb des akzeptablen Bereichs des Stromgenerators liegt. Bei den typischerweise verwendeten Frequenzen befindet sich der größte Teil des Stromflusses auf der Oberfläche des Antennenleiters, was bedeutet, dass die Oberfläche die Widerstandserwärmung beeinflusst, die durch Beseitigung von Oberflächendefekten minimiert werden kann. Diese Widerstandsheizung bedeutet auch, dass ein Spulenkühlsystem erforderlich ist, um sicherzustellen, dass die Spule und die Umgebung nicht überhitzen.
Eine Einschränkung unseres Systemdesigns besteht darin, dass es nicht einen Gesamtbereich von Frequenzen und Magnetfeldern zulässt, aber es ermöglicht die Erzeugung von Feldern, die für Zellen, Nagetiere und große Tiere geeignet sind. Insbesondere steht die maximale Feldstärke, die von einem induktiven Erwärmungssystem zur Verfügung steht, in direktem Zusammenhang mit dem Stromfluss in der Antenne (Spule). AMF-Generatoren werden in Kilowatt angegeben, die durch Multiplikation der verfügbaren Spannung mit dem verfügbaren Strom (Ampere) berechnet werden. Ein 10-kW-System mit einer 500-V-Grenze hätte also eine maximale Stromstärke von 20 A. Das Spulendesign bestimmt, welche Grenze zuerst erreicht wird, und damit die Systemgrenze. Die magnetische Feldstärke, die durch einen Strom erzeugt wird, nimmt exponentiell in Abhängigkeit vom Abstand vom Leiter ab. Daher hätte eine Spule mit größerem Durchmesser und der gleichen Geometrie wie eine Spule mit kleinerem Durchmesser, die auf demselben System betrieben wird, eine geringere Feldstärke in der Mitte der Spule. Somit sind die erforderliche Magnetfeldgröße und -stärke durch die Kapazität des AMF-Generators begrenzt. Der Bau einer größeren Spule und der Verbrauch von mehr Leistung führt zu zusätzlichen Problemen, vor allem zur Wirbelstromerwärmung.
Es gibt mehrere Sicherheitsbedenken, die bei der Verwendung dieses Systems berücksichtigt werden müssen, um Benutzer, Tiere und das System selbst zu schützen. Erstens muss während der Anästhesie eine ausreichende Raumbelüftung aufrechterhalten werden. Zweitens müssen alle Bereiche, die mit der Spule verbunden sind, frei von Metall und / oder Leitern sein, einschließlich Mischungen mit hohem Salzgehalt. Benutzer müssen Ringe und anderen Schmuck entfernen, wenn sie mit dem AMF arbeiten, und Proben sollten keine Art von Metall enthalten. Am wichtigsten ist, dass Personen mit Herzschrittmachern oder anderen implantierten Geräten oder Gegenständen ihren Arzt konsultieren sollten, bevor sie mit dem AMF arbeiten. Um das System zu schützen, sollte ein ausfallsicheres System verwendet werden, das sicherstellt, dass die Anforderungen an die Generator- und Spulenkühlung erfüllt werden, bevor Strom betrieben wird. Darüber hinaus sollte eine Wärmebildkamera-Übersicht verwendet werden, um eine unbeabsichtigte Erwärmung zu erkennen.
Bei In-vitro-Studien sind die wichtigsten Schritte die Konzentration von Eisen in den Zellen, die Konzentration der Zellen, die AMF-Parameter und die Bewertung der thermischen Dosis. Zellen können mit magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie behandelt / erhitzt werden, indem die magnetischen Nanopartikel in den Überstand, die Zellen oder beides eingebracht werden. Die Menge der magnetischen Nanopartikelerwärmung hängt von der Menge an magnetischen Nanopartikeln / Fe ab. Wenn der Wunsch besteht, nur Zellen mit internalisiertem Eisen zu behandeln, ist unsere Erfahrung, dass einzelne Krebszellen nur eine begrenzte Anzahl von magnetischen Nanopartikeln aufnehmen und dass selbst wenn die Aufnahme optimal ist, die Zellen aggregiert / pelletiert werden müssen, um eine Zellerwärmungssituation zu erzeugen, selbst bei optimierter AMF. Die Aufrechterhaltung der Temperatur der Medien und Zellen auf biologisch relevanten Niveaus (wenn sie nicht erhitzt werden) ist ebenfalls wichtig für die genaue Messung der tatsächlichen Erwärmung. Die hier beschriebene 14-Gang-Magnetspule ermöglicht es, biologisch relevante Temperaturen aufrechtzuerhalten, indem die Proben in eine thermisch kontrollierte Wassersäule getaucht werden.
Für die In-vivo-Studien sind die Aufrechterhaltung der Tierkerntemperatur und die genaue Messung der Temperatur im Tumor Schlüsselfaktoren. Dieses Tierhaltungssystem und das Design der Spule eliminieren thermische Drift in der Umgebung des Tieres aufgrund von Spulen- / Leistungseinstellungen und helfen, die normale Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. Die Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur ist entscheidend für aussagekräftige Versuchsergebnisse. Die rektale Sonde ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Kerntemperatur des Tieres. Unter Narkose sinkt die Kerntemperatur eines Tieres von Natur aus. Um dieser Situation zu begegnen, haben wir ein umweltfreundliches Heizsystem entwickelt, das warme Luft um das Tierhaltungsgefäß herum liefert, so dass die Kerntemperatur im normalen Bereich bleibt. Die Aufrechterhaltung einer normalen Kerntemperatur ist unerlässlich, um eine genaue Interpretation der Ergebnisse der Hyperthermiebehandlung und die Eliminierung von Umweltfaktoren zu gewährleisten. Die Platzierung der Temperaturüberwachungssonden an mehreren Stellen im Zielgewebe / Tumor ist wichtig, um eine genaue Beurteilung der erreichten Temperatur und thermischen Dosis zu erhalten. Da es extrem schwierig, wenn nicht unmöglich ist, magnetische Nanopartikel homogen in einem Tumor zu verteilen, ist die Kenntnis der Erwärmungsparameter an mehreren Stellen unerlässlich, um eine konsistente und genaue thermische Dosis von Gewebe / Tumor zu erreichen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Konzentration für In-vitro- und In-vivo-Studien variabel ist. Diese Variation ist darauf zurückzuführen, dass es in der Zellkultur weniger Grenzen gibt und die Zellen mehr Zugang zu den mNPs haben, so dass eine niedrigere Konzentration verwendet werden kann. In vivo ist aufgrund der heterogenen Natur der Tumore und der komplizierten 3D-Morphologie eine höhere Konzentration erforderlich. Daher würde die Verwendung der gleichen Konzentration von Partikeln in vivo und in vitro dazu führen, dass viel weniger von Zellen aufgenommen werden.
Dieses Manuskript beschreibt die Parameter und Instrumente, die notwendig sind, um einen effektiven und flexiblen Magnetfeld-Wechselfeldgenerator und ein Spulensystem für magnetische Nanopartikel-Hyperthermie-Behandlungen zu entwickeln. Dieses System kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Studien verwendet werden. Das System ist wirksam für lokalisierte/gezielte Hyperthermie und die Schonung von normalem Gewebe, was es im Vergleich zu anderen AMF-mNP-Hyperthermiesystemen attraktiv macht. Diese Hyperthermiebehandlungen können modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener Dosen mit einer Vielzahl von Nanopartikeln oder Nanoträgern und Zusatzbehandlungen zu untersuchen. Da die Erwärmung des Gewebes, insbesondere die Erwärmung mit magnetischen Nanopartikeln, von so vielen Variablen beeinflusst werden kann, ist es wichtig, die Parameter in einer Untersuchung zu verstehen. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, kann die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie viele molekulare, zelluläre und klinische Situationen abdecken, einschließlich einer unabhängigen und adjuvanten Tumorkontrolle. Obwohl die hier beschriebenen Methoden einen erheblichen Aufwand erfordern, kann bei Einhaltung der Richtlinien das volle Potenzial der mNP-Hyperthermie ausgeschöpft werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch die Fördernummern NCI P30 CA023108 und NCI U54 CA151662 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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