Summary
Этот протокол представляет методы и методологию, необходимые для точной доставки гипертермии магнитных наночастиц с использованием сложной системы доставки и мониторинга.
Abstract
Гипертермия уже давно используется при лечении рака. Методы варьировались от внутриопухолевой вставки горячих железных стержней до системно доставляемых магнитных наночастиц, нацеленных на антитела, при температурах от 39 ° C (уровень лихорадки) до 1000 ° C (электрокоагуляция) и времени лечения от секунд до часов. Температурно-временная зависимость (тепловая доза) диктует эффект с высокими тепловыми дозами, приводящими к абляции тканей и более низким тепловым дозам, приводящим к сублетальным эффектам, таким как увеличение кровотока, накопление лекарств и иммунная стимуляция. Одним из наиболее перспективных современных медицинских методов лечения является гипертермия магнитных наночастиц (mNPH). Этот метод включает в себя активацию магнитных наночастиц, которые могут быть доставлены системно или внутриопухолево, с неинвазивным, нетоксичным переменным магнитным полем. Размер, конструкция и ассоциация магнитных наночастиц, а также частота и напряженность поля магнитного поля являются основными детерминантами нагрева. Мы разработали сложные приборы и методы для доставки воспроизводимой гипертермии магнитных наночастиц в больших и малых животных моделях и культивируемых клетках. Этот подход, использующий непрерывный мониторинг температуры в режиме реального времени в нескольких местах, позволяет доставлять четко определенные тепловые дозы в ткань-мишень (опухоль) или клетки, ограничивая при этом нагрев нецелевой ткани. Точный контроль и мониторинг температуры на нескольких участках и использование стандартного алгоритма (кумулятивный эквивалент минут при 43 °C / CEM43) позволяет точно определять и количественно оценивать тепловую дозу. Наша система, которая допускает широкий спектр температур, тепловых доз и биологических эффектов, была разработана путем сочетания коммерческих приобретений и собственных инженерных и биологических разработок. Эта система была оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить быстрое преобразование между методами ex vivo, in vitro и in vivo. Целью этого протокола является демонстрация того, как проектировать, разрабатывать и внедрять эффективную технику и систему для обеспечения воспроизводимой и точной гипертермии магнитной наночастицы (mNP).
Introduction
Гипертермия исторически использовалась в терапии рака, либо отдельно, либо в сочетании с другими методами лечения. Хотя он имеет долгую историю использования, наиболее выгодный метод доставки этого лечения все еще обсуждается и зависит от места и местоположения заболевания. Методы доставки гипертермии включают микроволновые, радиочастотные, сфокусированные ультразвуковые, лазерные и металлические наночастицы (такие как золото или оксид железа)1,2,3,4. Эти методы доставки могут привести к диапазону температур лечения от уровня лихорадки до сотен градусов С. Биологический эффект гипертермии зависит, прежде всего, от применяемых температур и длительности лечения5. Для этой рукописи мы фокусируемся на гипертермии магнитных наночастиц (mNPH). Этот метод позволяет фокусировать, локализовать, хорошо контролировать и контролировать изменения температуры, используя нетоксичные, одобренные FDA наночастицы оксида железа.
Одной из ловушек других модальностей гипертермии является отсутствие точного клеточного таргетинга; Гипертермия не имеет по своей сути высокого терапевтического соотношения, поэтому необходима тщательная термометрия и таргетирование6. mNPH позволяет системную или внутриопухолевую инъекцию mNP, при этом тепло генерируется только там, где находятся mNP, тем самым нацеливая лечение непосредственно на опухоль. mNPH может быть эффективным, когда магнитные наночастицы расположены внутри или снаружи клетки. Для терапии рака общий обзор mNPH заключается в том, что магнитные наночастицы вводятся (внутриопухолево или внутривенно), затем применяется переменное магнитное поле, заставляя магнитные полюса наночастиц постоянно выравниваться, что приводит к локализованному нагреву клеток итканей, связанных с наночастицами 7,8 . Регулируя объем наночастиц и частоту/силу переменного магнитного поля (AMF), можно тщательно контролировать температуру, генерируемую внутри ткани.
Это лечение хорошо работает при опухолях, которые находятся вблизи поверхности тела, так как более глубокие опухоли требуют более сильного AMF, поэтому риск вихретокового нагрева увеличиваетсяна 9. Имеются данные о том, что гипертермия используется клинически в качестве монотерапии, однако часто гипертермия сочетается с лучевой терапией или химиотерапией, что приводит к более целенаправленному противораковому эффекту 10,11,12. Клинические доказательства гипертермии, работающей в сочетании с лучевой терапией, рассматриваются в предыдущей публикации13. Наша лаборатория успешно лечила различных животных, от мышей до свиней и спонтанного рака собак, используя метод mNPH 12,14,15. Этот протокол предназначен для тех, кто заинтересован в исследовании эффектов лечения локализованной гипертермии, либо отдельно, либо в сочетании с другими методами лечения.
Одним из наиболее важных факторов гипертермии является возможность измерения и понимания в режиме реального времени тепловой дозы, доставляемой в ткань мишени / опухоли. Стандартным способом расчета и сравнения дозы является демонстрация кумулятивного эквивалента минут нагрева при 43 °C; данный алгоритм позволяет сравнивать дозы независимо от системы доставки, максимальную и минимальную температуры (в пределах определенного диапазона) и параметры нагрева/охлаждения 5,16. Расчет CEM лучше всего подходит для температур от 39 до 57 °C5. Например, в некоторых исследованиях, которые мы проводили, мы выбрали тепловую дозу CEM43 30 (т.е. 30 мин при 43 °C). Выбор этой дозы позволил посмотреть на безопасный, эффективный, иммуногенетический эффект in vitro, как отдельно, так и в сочетании с однократной дозой облучения17.
При гипертермии магнитных наночастиц существует несколько факторов, которые необходимо учитывать при построении соответствующей системы доставки. Конструкция контрольно-измерительных приборов включает в себя важные факторы безопасности, такие как использование чиллера для обеспечения того, чтобы оборудование для доставки магнитного поля оставалось прохладным даже при работе на высокой мощности, и отказоустойчивые процедуры, которые предотвращают включение системы, если все системы оценки температуры, мощности и управления не были активированы. Кроме того, существуют важные биологические факторы, которые необходимо учитывать как для ситуаций in vivo, так и in vitro. При использовании культивируемых клеток необходимо обрабатывать в питательных средах и поддерживать постоянную жизнеспособную температуру, чтобы избежать физиологических изменений, которые могут повлиять на результаты. Для отдельных типов наночастиц важно знать удельную скорость поглощения (SAR) при расчете параметров нагрева на основе AMF. Точно так же важно знать концентрацию mNP/Fe в клетках и тканях, которая необходима для достижения желаемого нагрева. Методы in vivo требуют еще большего внимания к деталям, так как животное должно поддерживаться под наркозом во время лечения, а температура тела животного поддерживалась на нормальном уровне на протяжении всего лечения. Снижение температуры тела животного, как это происходит под наркозом, может повлиять на общие результаты в отношении тепловой дозы обрабатываемой ткани.
В этой рукописи мы обсуждаем методы, используемые для проектирования и построения универсальной системы гипертермии магнитных наночастиц, а также важные факторы использования, которые необходимо учитывать. Описанная система обеспечивает надежную, последовательную, биологически приемлемую, безопасную и хорошо контролируемую доставку гипертермии магнитных наночастиц. Наконец, следует отметить, что исследования mNPH, которые мы проводим, часто включают другие методы лечения, такие как лучевая, химиотерапия и иммунотерапия. Чтобы эти результаты были значимыми, важно определить, как доставляемое тепло может повлиять на эффективность и / или токсичность для безопасности других модальностей (или наоборот) и благополучие животного. По этой причине и в дозиметрических и терапевтических ситуациях, упомянутых ранее, важно уделять строгое внимание точности дозирования магнитной наночастицы гипертермии и непрерывным измерениям температуры ядра и цели. Целью этого протокола является предоставление простого, последовательного метода и описания для доставки безопасной и эффективной гипертермии магнитных наночастиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Программа по уходу и использованию животных Дартмутского колледжа аккредитована Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (iAAALAC) и придерживается всех руководящих принципов и правил UDSA и NIH (Управление по благополучию лабораторных животных). Все исследования in vivo были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Дартмутского колледжа (IACUC). Процедура эвтаназии придерживается Руководящих принципов AVMA 2020 года для эвтаназии животных.
1. Контрольно-измерительные приборы/проектирование системы
- Проектируйте пользовательскую антенну AMF (катушку), чтобы она представляла собой замкнутый контур, выбирая формы для создания желаемого магнитного поля. Используйте формулы индуктивности и характеристики из выбора генератора мощности для проектирования совместимых катушек для создания желаемого поля. Используйте различные конструкции для экспериментов in vitro и in vivo.
- Убедитесь, что индуктивность антенны AMF находится в допустимом диапазоне электрогенератора. Добавьте или вычтите конденсаторы, чтобы сопоставить (настроить) антенну с электрогенератором.
- Для экспериментов in vitro спроектируйте 14-виточную спиральную катушку, внутренний диаметр 2 см и длину 14 см, которая может содержать трубки объемом 1,5 мл, что позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно. Изолируйте катушку виниловым полимером и используйте полистирольную прокладку для отделения катушки от труб. Подробная информация о спецификации и соображениях по проектированию представлена в Дополнительном файле 1.
- Для экспериментов in vivo приобретите изготовленную на заказ винтовую катушку для всего тела от производителя с запатентованной информацией о конструкции. Используйте 8 мм квадратные трубки (так как они создают более равномерное поле в отверстии катушки) и концентратор в целевой зоне обработки. Сделайте концентратор длиной 5,0 см, в общей сложности 5 витков, что приведет к внутреннему диаметру 3,6 см, внешнему диаметру 5,2 см и расположите его в целевой зоне обработки. Окружите катушку поликарбонатной оболочкой.
- Используйте в качестве источника питания генератор AMF с регулируемой мощностью и частотой, рассчитанный на 10 кВт или более. Индуктивность соответствует источнику питания и антеннам/катушкам в диапазоне от 0,62 до 1,18 мкГн (мкГн), что позволяет использовать частоты в диапазоне от 30 до 300 кГц. Охладите генератор с помощью оборотной воды с помощью центробежного наддувного насоса, давление которого регулируется до 50 фунтов на квадратный дюйм.
- Охладите катушки с помощью 5,6-тонного охлаждающего чиллера, который перекачивает 25% теплоносителя на основе этиленгликоля, разбавленную водой через антенну AMF. Установите температуру чиллера таким образом, чтобы антенна не нагревала и не охлаждала образец.
- Для содержания животных сконструируйте трубчатый держатель, который может быть подвешен в центре катушки с воздушным зазором 0,5 см между держателем и поверхностью катушки. Подключите регулируемый кондиционированный воздушный насос, который циркулирует воздух через оболочку вокруг катушки, и установите его для поддержания нормальной температуры ядра животного. Подключите анестезиологический аппарат к трубчатому держателю животного рядом с головой животного, чтобы обеспечить надлежащую доставку анестезии.
- Для удержания клеток создайте устройство, которое циркулирует воду с водяной бани через распорку, где размещены трубки. Установите температуру этой водяной бани так, чтобы трубы были окружены водой при 37 °C.
- Используйте волоконно-оптические зонды для мониторинга температуры в опухоли, сердцевине животного и окружающей среде животного или для исследований in vitro, контролируя температуру клеточной гранулы и воды, окружающей трубки.
- Используйте магнитные наночастицы оксида железа размером 100 нм для всех экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и удельная скорость поглощения (SAR) являются двумя характеристиками, которые необходимо учитывать при выборе наночастиц, поскольку они непосредственно влияют на возможный нагрев и тепловую дозу18.
2. Гипертермия in vitro
- Культивирование клеток мышиной меланомы B16F10 в среде RPMI с 10% FBS и 1% Pen/strep. Плита 150 000 ячеек/скважина в 6-луночных плитах, с 2 мл полной среды.
- Определить соответствующее лечение для каждой лунки, т.е. клеток без мНП и без АМФ, клеток с мНП и без АМФ, клеток без мНП и АМФ, клеток с мНП и АМФ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, убедитесь, что существуют соответствующие средства контроля при сочетании гипертермии с другой терапией. AMF выполняется в стандартной исследовательской стендовой лаборатории, оснащенной необходимыми возможностями питания и охлаждения. - Через 24 ч после нанесения покрытия добавить мНП в соответствующие скважины, как это было определено на предыдущем этапе. Добавьте мНП до концентрации 3 мг железа/мл. Обеспечьте распределение мНП по всей скважине либо путем создания стоковой среды/раствора mNP (удаление старых носителей, добавление этого решения), либо путем добавления mNP непосредственно и мягко закручивающихся пластин для однородного распределения.
- Начинают обработку через 48 ч после добавления мНП, когда скважины на 80% сливаются, путем удаления среды и промывки скважин свежими средами. Удалите носитель.
- Добавьте 0,5 мл трипсина к каждой пролеченной болезни и осторожно закрутите. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки отсоединены.
- Добавьте 1 мл среды в каждую лунку, чтобы собрать клетки в трубки по 1,5 мл. Соберите все клетки из колодца (~1 х 106 клеток). Используйте четко обозначенную отдельную трубку для каждой скважины.
- Отжимают трубки по 60 х г в течение 2-3 мин, чтобы ячейки гранулировались. Сохраните гранулу в среде.
- Поместите трубки в распорку, полную воды внутри катушки. Установите температуру водяной бани таким образом, чтобы среда и гранула ячейки поддерживались при 37 °C. Контролируйте температуру внутри трубки и водяной бани с помощью отдельных волоконно-оптических датчиков температуры.
- Включите чиллер, проверьте, что охлаждающая жидкость течет через катушку. Включите источник питания и отрегулируйте процент максимума в соответствии с требуемым полем. Управляйте 14-оборотной электромагнитной катушкой, работающей от генератора мощностью 10 кВт, на частоте 165 кГц и 23,87 кА/м (300 Oe).
- Поместите отдельный волоконно-оптический датчик температуры в одну из трубок. Обрабатывают клетки до тех пор, пока не будет установлена заранее определенная протоколом тепловая доза. Примером может служить 30 мин при 43 °C (CEM43 из 30).
- Повторное суспендирование клеток в среде, которая находится в их трубках, и повторное покрытие в новые 6 пластин скважин. Четко обозначьте новые пластины. Цель состоит в том, чтобы повторно покрыть все собранные клетки (~ 1 х 106 клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Новые 6 луночных пластин должны быть использованы для обеспечения того, чтобы культивируемые клетки получали обработку. Если старые пластины используются, на пластинах все еще могут оставаться клетки, которые не были успешно трипсинизированы. - При необходимости для следующей экспериментальной процедуры лизируйте клетки для анализа экспрессии РНК или белка.
3. Гипертермия in vivo
- Клеточная культура и инокуляция
- Культивирование клеток мышиной меланомы B16F10 в среде RPMI с 10% FBS и 1% Pen/strep. Используйте тарелки/тарелки, которые обеспечат достаточное количество клеток для прививки нужного количества животных. Например, тарелки толщиной 10 100 мм, покрытые 100 000 клеток, будут сливаться с достаточным количеством клеток для инъекций 20 мышей в течение 48 ч.
- Трипсинизируют клетки и собирают с помощью чистых сред RPMI (без FBS или пера / стрептококка).
- Подсчитайте клетки и создайте раствор для нужной концентрации клеток, исходя из объема прививки и номеров мышей.
- Обезболивайте 6-недельную самку мышей C57Bl/6, используя испаренный изофлуран и кислород. Поместите животных в коробку из плексигласа с 5% изофлурана и 95% кислорода до индуцирования. После индуцирования удалите животное и используйте лицевой конус с 2% изофлурана для выполнения этапов 3.1.5-3.1.7 и 3.3.3-3.3.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анестезии во время лечения используйте встроенное обезболивающее средство. Следуйте стандартным институциональным протоколам для мышиной анестезии. Перед экспериментами на животных обеспечьте соответствующее одобрение IACUC. После анестезии верните животное в клетку и следите за выздоровлением, чтобы убедиться в отсутствии осложнений. - Проверьте отсутствие реакции на корректирующие рефлексы.
- Побрейте правый фланг с помощью электробритвы.
- Очистите область инъекции спиртовой салфеткой. Вводят 1-2 х 106 клеток, используя стеклянный шприц 100 мкл с иглой 28 Г, диспергированной в 50 мкл среды внутрикожно на бритой правой стороне анестезированного.
- Рост опухоли/инъекция наночастиц
- Измерьте опухоли в 3 измерениях с помощью суппортов (длина, ширина и глубина) и рассчитайте объемы по (длина х ширина х глубина х π)/6.
- Когда объемы опухоли достигнут 120мм3 (+/- 20мм3), поместите животных на исследование. Разработайте исследование, обеспечив наличие соответствующих контрольных и лечебных групп, включая когорты комбинированной терапии (т. Е. Контроль, мНПЗ, радиацию и комбинацию).
- Обезболивание мышей, которые будут получать mNP, как описано в 3.1.4.
- Очистите область спиртовой салфеткой. Вводят mNP в опухоль за 3 ч до лечения AMF. Вводят таким объемом, чтобы доза составляла 7,5 мг железа/см3 опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неопубликованные данные лаборатории свидетельствуют о том, что максимальное поглощение mNP происходит через 3-6 ч.
- Лечение АМФ
- Обезболить мышь и поместить на грелку для поддержания температуры ядра.
- Проверьте отсутствие реакции на корректирующие рефлексы. Снимите ушную бирку или любые другие металлические предметы на мыши.
- Осторожно поместите смазанный волоконно-оптический температурный зонд в прямую кишку мыши.
- Поместите катетер в опухоль, удалив иглу. Обрежьте катетер так, чтобы он не высовывался из опухоли слишком сильно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Волоконно-оптические температурные катетеры помещаются и удаляются, пока мыши находятся под общим наркозом, т.е. катетеры находятся на месте только во время процедуры нагрева опухоли. Мышам дают одну подкожную дозу препарата для обезболивания НПВП, кетопрофена (5 мг / кг), во время процедуры. Мы не наблюдали краткосрочного или долгосрочного дискомфорта или заболеваемости, связанных с установкой катетеров. - Вставьте в катетер волоконно-оптический температурный зонд с 3 датчиками. Катетер защищает волоконно-оптические датчики температурного зонда.
- Прикрепите ректальный и внутриопухолевый зонд к хвосту животного, чтобы они оставались на месте.
- Поместите мышь в трубку объемом 50 мл, головой вниз. Трубка должна иметь отверстие возле головки, куда будет соединяться и доставляться анестезия.
- Поместите трубку в установленную катушку и снова подключите анестезию.
- Поместите волоконно-оптический температурный зонд в трубку, чтобы измерить температуру окружающей среды.
- Включите чиллер и убедитесь, что охлаждающая жидкость циркулирует.
- Проверьте и убедитесь, что компьютерное программное обеспечение отображает различные температуры, и начните запись, чтобы расчет CEM43 отображался в режиме реального времени. Требуемая доза CEM43 – это ранее определенная доза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем включить магнит, убедитесь, что к животному не прикреплены металлические предметы, так как они будут быстро нагреваться. Кроме того, убедитесь, что у всех в комнате нет кардиостимулятора, и для них безопасно находиться там. - Включите магнит при низком проценте мощности.
- Убедитесь, что волоконно-оптические датчики температуры регистрируют изменения температуры. Температура будет увеличиваться после активации AMF по мере увеличения поля. Убедитесь, что температура ядра животного остается на уровне 38 °C. Регулируйте температуру ядра с помощью кондиционированной воздушной рубашки.
- Отрегулируйте напряженность магнитного поля, изменив мощность на генераторе, используя встроенный контрольный диск, который в свою очередь контролирует уровень температуры в опухоли.
- Отключение AMF после того, как желаемая доза, как ранее определено пользователем (например, CEM43 40), достигается внутри опухоли.
- Как только AMF будет выключен, извлеките трубку из катушки.
- Извлеките мышь из трубки, извлекая различные зонды и катетер. При необходимости пометьте животное новой металлической ушной биркой.
- Как только обработка будет завершена, выключите чиллер.
- Выздоравливайте животных после анестезии, гарантируя отсутствие осложнений. Следите за их поведением, чтобы обеспечить возвращение к нормальной жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исследования in vitro
Клетки будут достигать и поддерживать желаемую температуру и тепловую дозу только в том случае, если количество и концентрация магнитных наночастиц /железа и AMF соответствующим образом совпадают. При использовании магнитных наночастиц для нагрева клеток in vitro (и in vivo) следует отметить, что для достижения гипертермии в клетках с интернализованными магнитными наночастицами потребуется определенный уровень внутриклеточных mNP/Fe, а также количество и близость нагруженных mNP клеток друг к другу. Если уровень mNP/Fe в клетках-мишенях/ткани достаточен для достижения эффекта нагрева, частота и сила магнитного поля могут быть отрегулированы для достижения желаемой температуры и эффектов. При правильном покрытии дальнейшие исследования, изучающие генетические и молекулярные различия между различными дозами и сроками, могут быть проведены17. На рисунке 1 представлена схема методов in vitro.
Эти методы in vitro могут быть использованы для исследования изменения клеточной мРНК и экспрессии белка. Недавний пример из нашей лаборатории определил иммуногенетические различия после лечения CEM43 30 мНПГ, лучевой терапии 8 Гр и комбинации. Мы смогли определить сходства и различия в экспрессии по иммунным и цитотоксическим путям, чтобы лучше понять механизм, лежащий в основе эффектов, и то, как они сочетаются синергетически17. В каждом эксперименте используются различные экологически чистые и нагретые контрольные образцы. Контрольная группа будет иметь различные уровни экспрессии мРНК и белка по сравнению с теми, кто получал лечение гипертермии.
Исследования in vivo
В исследованиях in vivo есть дополнительные соображения. Независимо от целевой тепловой дозы абсолютно необходимо поддерживать физиологически приемлемую температуру ядра у обрабатываемого животного. Это может быть сложной задачей для грызунов под анестезией, поскольку температура ядра может быть быстро потеряна (часто необходимы методы модуляции температуры ядра, такие как грелки). Более низкая, чем обычно, температура тела может потребовать слишком далеко продвинуть AMF-mNPH при попытке достичь определенной тепловой дозы в опухоли, что приводит к неприемлемым эффектам в нецелевой ткани (нецелевой вихретоковый нагрев ткани является одной из таких возможностей). Даже незначительные отклонения температуры тела могут привести к нежелательным физиологическим осложнениям в опухоли или нормальной ткани. Как упоминалось ранее, однако стоит повторить, для точного, воспроизводимого нагрева важно достичь соответствия между концентрацией ткани mNP / Fe, частотой AMF и параметрами мониторинга температуры напряженности поля и размером и глубиной целевой ткани. Должна быть базовая концентрация mNP в опухоли, чтобы обеспечить измеримый нагрев. Уровень/способность тепла зависит не только от концентрации mNP в тканях (mg Fe/g ткани) и их относительного распределения внутри опухоли, но и от частоты AMF и последующей напряженности поля. Изменения в любом из вышеперечисленных могут привести к различным диапазонам достижимых температур в ткани. Благодаря многолетнему опыту мы оптимизировали концентрацию, которую мы используем для доклинического лечения опухолей, а также частоту и напряженность поля системы AMF, чтобы обеспечить безопасную и эффективную активацию. Поскольку невозможно измерить температуру/температурную дозу во всех участках тканей, также важно разместить как можно больше волоконно-оптических температурных зондов на стратегических участках, которые позволяют проводить оценку эффективности и безопасности в режиме реального времени, как показано на рисунке 2. Эти зонды позволяют регистрировать температуры на протяжении всего эксперимента, обеспечивая точную дозиметрию и тепловую историю эксперимента. На рисунке 3 показаны кривые, генерируемые в ходе эксперимента in vivo, подчеркивая возможность тщательного мониторинга температуры и регулировки системы для поддержания температуры опухоли в желаемом диапазоне. На рисунке 4 обобщены методы in vivo.
Эти методы in vivo, аналогичные методам in vitro, могут быть использованы для исследования различных типов рака, различных доз гипертермии и с различными комбинированными методами лечения. Например, предыдущие исследования в нашей лаборатории исследовали комбинацию гипертермии и химиотерапии12. Мы также завершили многочисленные эксперименты с гипертермией и радиацией для определения эффективности и молекулярных механизмов. Контрольные мыши для этих экспериментов проходят все процедуры, кроме фактической генерации гипертермии. Рисунок 5 содержит два вулканических графика, которые демонстрируют дифференциально экспрессированные гены после лечения гипертермии in vitro и in vivo mNP (mNPH). Эти цифры являются примерами того, как мы используем молекулярные методы для мониторинга эффектов гипертермии.
Рисунок 1: Схема гипертермии in vitro mNP. Эта схема демонстрирует метод гипертермии магнитных наночастиц in vitro. Чтобы обеспечить нагрев, ячейки должны быть обеспечены достаточным количеством частиц и временем для адекватного поглощения mNP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Установка катетеров для контроля температуры. Этот рисунок демонстрирует размещение катетеров, в которых размещаются волоконно-оптические температурные зонды для регистрации температуры в разных местах в опухоли и / или области опухоли. Эта цифра взята из ссылки 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мониторинг температуры в режиме реального времени во время лечения опухоли мыши. Этот график демонстрирует показания температуры в реальном времени, которые позволяют контролировать температуру тела, температуру окружающей среды и несколько температур в опухоли во время эксперимента in vivo. Контроль температур внутри опухоли демонстрируется через минимальные крупномасштабные вариации на увеличенной части фигуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схема гипертермии In vivo mNP. Данная схема демонстрирует метод гипертермии in vivo магнитных наночастиц. Инъекция достаточного количества наночастиц, а также достаточное время для распределения и поглощения, обеспечивает способность доставлять желаемую тепловую дозу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Дифференциальная экспрессия генов. Дифференциальная экспрессия генов после лечения гипертермии in vitro (A) и in vivo (B) mNP. Эти вулканические графики представляют собой генетические изменения на оси log 2 x, со значением на оси Y, как для методов in vitro, так и in vivo mNPH. Каждый круг представляет собой отдельный ген, с 20 наиболее значимыми дифференциально экспрессированными генами. Чем дальше ген находится от нуля по оси x, тем больше изменение складки, и чем выше ген находится на оси Y, тем ниже p-значение. Хотя оба имели одинаковую тепловую дозу, гипертермия in vivo привела к большим изменениям экспрессии генов, чем in vitro. Эти графики являются примерами биологических данных, которые могут быть сгенерированы с использованием описанного протокола. Сюжет вулкана in vitro был адаптирован из ref.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проектирование и реализация данной системы обеспечивает возможность проведения точных и воспроизводимых in vitro и in vivo экспериментов по гипертермии магнитных наночастиц. Крайне важно, чтобы система была спроектирована таким образом, чтобы частота AMF и напряженность поля адекватно соответствовали типу магнитных наночастиц, концентрации, а также местоположению ткани и желаемой температуре. Кроме того, точный мониторинг температуры в режиме реального времени имеет решающее значение для безопасности и расчета точной тепловой дозы (кумулятивный эквивалент минут при 43 °C / CEM). Размещение зондов, как показано на рисунке 1, позволяет в режиме реального времени контролировать температурную дозу и температуру тела, как показано на рисунке 2.
Первым шагом в точной доставке гипертермии магнитных наночастиц является построение безопасной системы для животных и операторов. Все компоненты системы также должны быть хорошо поняты с оперативной точки зрения и с точки зрения доставки. В этой ситуации это означает понимание потенциала вихревых токов AMF и знание того, где находятся магнитные частицы. Антенны, или катушки, являются ключевым фактором формы и напряженности поля, а используемая система охлаждения важна для предотвращения перегрева катушки20. Напряженность поля вне проводника прямо пропорциональна напряженности тока, протекающей через проводник. Напряженность магнитного поля в любой точке пространства, окружающего проводник, представляет собой векторную сумму полей, создаваемых проводниками в окружающей области. Магнитное поле создается под прямым углом к течению тока, и сила уменьшается экспоненциально, в зависимости от расстояния от проводника, в соответствии с правилом обратного квадрата Био-Савара21. Таким образом, квадратная трубка используется для гипертермии in vivo для более однородного поля внутри катушки. Создание магнитного поля с силой и объемом, необходимыми для потенциально клинически значимой системы, требует высокого электрического тока. Поэтому конструкции антенн должны быть в состоянии приспособиться к значительным уровням электрической мощности. Кроме того, антенны AMF должны быть спроектированы таким образом, чтобы их индуктивность находилась в допустимом диапазоне электрогенератора. На обычно используемых частотах большая часть потока тока находится на поверхности проводника антенны, что означает, что поверхность влияет на резистивный нагрев, который может быть сведен к минимуму путем устранения поверхностных дефектов. Этот резистивный нагрев также означает, что система охлаждения катушки необходима для обеспечения того, чтобы катушка и окружающая среда не перегревались.
Ограничение нашей конструкции системы заключается в том, что она не допускает общего диапазона частот и магнитных полей, но позволяет генерировать поля, подходящие для клеток, грызунов и крупных животных. В частности, максимальная напряженность поля, доступная из любой системы индукционного нагрева, напрямую связана с потоком тока в антенне (катушке). Генераторы AMF рассчитаны в киловаттах, которые рассчитываются путем умножения доступного напряжения на доступный ток (амперы). Таким образом, система мощностью 10 кВт с ограничением 500 В будет иметь максимальную силу тока 20 А. Конструкция катушек будет определять, какой предел будет достигнут в первую очередь, и, следовательно, предел системы. Напряженность магнитного поля, создаваемая любым током, уменьшается экспоненциально в зависимости от расстояния от проводника. Поэтому катушка большего диаметра с той же геометрией, что и катушка меньшего диаметра, работающая по той же системе, будет иметь более низкую напряженность поля в центре катушки. Таким образом, требуемый размер и напряженность магнитного поля ограничены мощностью генератора AMF. Создание большей катушки и использование большей мощности приводит к дополнительным проблемам, в первую очередь к вихретоковому нагреву.
Существует несколько проблем безопасности, которые необходимо учитывать при использовании этой системы для защиты пользователей, животных и самой системы. Во-первых, во время использования анестезии должна поддерживаться адекватная вентиляция помещения. Во-вторых, все области, связанные с катушкой, должны быть очищены от металла и/или проводников, включая смеси с высоким содержанием соли. Пользователи должны снимать кольца и другие украшения при работе вокруг AMF, а образцы не должны содержать никакого типа металла. Самое главное, люди с кардиостимуляторами или другими имплантированными устройствами или объектами должны проконсультироваться со своим врачом, прежде чем работать с AMF. Для защиты системы следует использовать отказоустойчивую систему, которая обеспечивает удовлетворение потребностей в охлаждении генератора и катушки до подачи питания. Кроме того, для обнаружения непреднамеренного нагрева следует использовать обзор тепловизионной камеры.
Для исследований in vitro наиболее важными шагами, которыми необходимо следовать, являются концентрация железа в клетках, концентрация клеток, параметры AMF и оценка тепловой дозы. Клетки могут быть обработаны / нагреты гипертермией магнитных наночастиц путем размещения магнитных наночастиц в супернатанте, клетках или обоих. Величина нагрева магнитных наночастиц будет зависеть от уровня магнитных наночастиц/Fe. Если есть желание лечить только клетки интернализованным железом, наш опыт показывает, что отдельные раковые клетки будут поглощать только ограниченное количество магнитных наночастиц и что даже когда поглощение является оптимальным, клетки должны быть агрегированы / гранулированы для создания ситуации нагрева клеток, даже с оптимизированным AMF. Поддержание температуры среды и клеток на биологически значимых уровнях (когда они не нагреваются) также важно для точного измерения истинного нагрева. 14-оборотная электромагнитная катушка, описанная здесь, позволяет поддерживать биологически значимые температуры путем погружения образцов в толщу воды с термически контролируемым контролем.
Для исследований in vivo поддержание температуры ядра животного и точное измерение температуры в опухоли являются ключевыми факторами. Эта система содержания животных и конструкция катушки устраняет тепловой дрейф в окружающей среде животного из-за настроек катушки / питания и помогает поддерживать нормальную температуру тела. Поддержание температуры тела имеет решающее значение для значимых результатов эксперимента. Ректальный зонд позволяет в режиме реального времени контролировать температуру ядра животного. Под наркозом температура ядра животного по своей природе снижается. Чтобы решить эту проблему, мы разработали систему отопления окружающей среды, которая доставляет теплый воздух вокруг сосуда для содержания животных, позволяя температуре ядра оставаться в нормальном диапазоне. Поддержание нормальной температуры ядра имеет важное значение для обеспечения точной интерпретации результатов лечения гипертермии и устранения факторов окружающей среды. Размещение зондов для мониторинга температуры в нескольких местах в ткани-мишени / опухоли важно для получения точной оценки достигнутой температуры и тепловой дозы. Поскольку чрезвычайно трудно, если не невозможно, равномерно распределить магнитные наночастицы в опухоли, знание параметров нагрева в нескольких местах имеет важное значение для достижения последовательной и точной тепловой дозы ткани / опухоли. Важно отметить, что концентрация для исследований in vitro и in vivo является переменной. Это изменение связано с тем, что в клеточной культуре меньше границ с клетками, имеющими больший доступ к mNP, поэтому можно использовать более низкую концентрацию. In vivo необходима более высокая концентрация из-за гетерогенной природы опухолей и сложной 3D-морфологии. Таким образом, использование одинаковой концентрации частиц in vivo и in vitro приведет к гораздо меньшему поглощению клетками.
В данной рукописи описываются параметры и приборы, необходимые для разработки эффективного и гибкого генератора переменного магнитного поля и системы катушек для лечения гипертермии магнитных наночастиц. Эта система может быть использована как для исследований in vitro, так и in vivo. Система эффективна для локализованной / целенаправленной гипертермии и щадящей нормальной ткани, что делает ее привлекательной по сравнению с другими системами гипертермии AMF-mNP. Эти методы лечения гипертермии могут быть изменены для исследования эффектов различных доз с различными наночастицами или нанонесущими и вспомогательными методами лечения. Поскольку на нагрев тканей, особенно на нагрев магнитных наночастиц, может влиять так много переменных, важно понимать параметры в исследовании. Если эти критерии соблюдены, гипертермия магнитных наночастиц может решить многие молекулярные, клеточные и клинические ситуации, включая независимый и адъювантный контроль опухоли. Хотя методы, описанные здесь, требуют значительных усилий, если следовать руководящим принципам, можно реализовать весь потенциал гипертермии mNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование финансировалось за счет номеров грантов: NCI P30 CA023108 и NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
