Summary
Detta protokoll presenterar tekniker och metoder som är nödvändiga för exakt leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi med hjälp av ett sofistikerat leverans- och övervakningssystem.
Abstract
Hypertermi har länge använts vid behandling av cancer. Teknikerna har varierat från intratumörinsättning av heta järnstänger, till systemiskt levererade tumörantikroppsinriktade magnetiska nanopartiklar, vid temperaturer från 39 °C (febernivå) till 1 000 °C (elektrokauteri) och behandlingstider från sekunder till timmar. Temperatur-tidsförhållandet (termisk dos) dikterar effekten med höga termiska doser som resulterar i vävnadsablation och lägre termiska doser som resulterar i subletala effekter såsom ökat blodflöde, ackumulering av läkemedel och immunstimulering. En av de mest lovande nuvarande medicinska terapierna är magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denna teknik innebär aktivering av magnetiska nanopartiklar, som kan levereras systemiskt eller intratumoralt, med ett icke-invasivt, giftfritt alternerande magnetfält. Storleken, konstruktionen och associationen av de magnetiska nanopartiklarna och magnetfältets frekvens och fältstyrka är viktiga uppvärmningsfaktorer. Vi har utvecklat sofistikerade instrument och tekniker för att leverera reproducerbar magnetisk nanopartikelhypertermi i stora och små djurmodeller och odlade celler. Detta tillvägagångssätt, med kontinuerlig temperaturövervakning i realtid på flera platser, möjliggör leverans av väldefinierade termiska doser till målvävnaden (tumören) eller cellerna samtidigt som icke-målvävnadsuppvärmning begränsas. Exakt kontroll och övervakning av temperatur, på flera platser, och användning av industristandardalgoritmen (kumulativa ekvivalenta minuter vid 43 °C / CEM43), möjliggör en exakt bestämning och kvantifiering av termisk dos. Vårt system, som möjliggör en mängd olika temperaturer, termiska doser och biologiska effekter, utvecklades genom en kombination av kommersiella förvärv och intern teknik- och biologiutveckling. Detta system har optimerats på ett sätt som möjliggör snabb omvandling mellan ex vivo-, in vitro- och in vivo-tekniker. Målet med detta protokoll är att demonstrera hur man designar, utvecklar och implementerar en effektiv teknik och ett effektivt system för att leverera reproducerbar och exakt magnetisk nanopartikelterapi (mNP) hypertermi.
Introduction
Hypertermi har historiskt använts i cancerbehandling, antingen ensam eller i kombination med andra behandlingar. Även om det har en lång historia av användning, diskuteras fortfarande den mest fördelaktiga metoden för att leverera denna behandling och är beroende av sjukdomsplatsen och platsen. Metoder för hypertermileverans inkluderar mikrovågsugn, radiofrekvens, fokuserad ultraljud, laser och metalliska nanopartiklar (såsom guld eller järnoxid)1,2,3,4. Dessa leveransmetoder kan leda till en rad behandlingstemperaturer från febernivå till hundratals grader C. Den biologiska effekten av hypertermi beror främst på de temperaturer som används och behandlingens varaktighet5. För detta manuskript och ändamål fokuserar vi på magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denna metod möjliggör fokuserade, lokaliserade, väl övervakade och kontrollerade temperaturförändringar, med hjälp av giftfria, FDA-godkända, järnoxidnanopartiklar.
En fallgrop av andra hypertermimodaliteter är bristen på exakt cellulär inriktning; Hypertermi har inte ett i sig högt terapeutiskt förhållande, därför är noggrann termometri och inriktning nödvändig6. mNPH möjliggör systemisk eller intratumoral injektion av mNPs, med värme som endast genereras där mNPs är belägna, vilket riktar behandlingen direkt till tumören. mNPH kan vara effektivt när de magnetiska nanopartiklarna är belägna inuti eller utanför cellen. För cancerterapi är den allmänna översikten över mNPH att de magnetiska nanopartiklarna injiceras (intratumoralt eller intravenöst), sedan appliceras ett alternerande magnetfält, vilket får nanopartikelns magnetiska poler att ständigt justeras, vilket leder till en lokaliserad uppvärmning av cellerna och vävnaden associerad med nanopartiklarna 7,8 . Genom att justera volymen av nanopartiklar och frekvensen/styrkan hos det alternerande magnetfältet (AMF) är det möjligt att noggrant kontrollera temperaturen som genereras i vävnaden.
Denna behandling fungerar bra i tumörer som ligger nära kroppsytan, då djupare tumörer kräver starkare AMF så ökar risken för virvelströmsuppvärmning9. Det finns tecken på att hypertermi används kliniskt som monoterapi, men ofta kombineras hypertermi med strålbehandling eller kemoterapi, vilket leder till en mer riktad anti-cancereffekt10,11,12. Kliniska bevis på att hypertermi fungerar i kombination med strålbehandling granskas i en tidigare publikation13. Vårt laboratorium har framgångsrikt behandlat en mängd olika djur, från möss till grisar och spontan hundcancer, med hjälp av mNPH-metoden12,14,15. Detta protokoll är utformat för dem som är intresserade av att undersöka effekterna av lokaliserad hypertermibehandling, antingen ensam eller i kombination med andra terapier.
En av de viktigaste faktorerna vid hypertermi är att i realtid kunna mäta och förstå den termiska dosen som levereras till mål- / tumörvävnaden. Ett standardiserat sätt att beräkna och jämföra dosen är att demonstrera de kumulativa ekvivalenta minuterna av uppvärmning vid 43 °C. Denna algoritm gör det möjligt att jämföra doser oberoende av leveranssystemet, högsta och lägsta temperaturer (inom ett visst intervall) och värme-/nedkylningsparametrar 5,16. CEM-beräkningen fungerar bäst för temperaturer mellan 39-57 °C5. I några av de studier vi har utfört har vi till exempel valt en termisk dos av CEM43 30 (dvs. 30 min vid 43 °C). Att välja denna dos gjorde det möjligt för oss att titta på en säker, effektiv, immunogenetiska effekter in vitro, både ensam och i kombination med en enda dos av strålning17.
Med magnetisk nanopartikelhypertermi finns det flera faktorer som måste beaktas vid byggandet av ett lämpligt leveranssystem. Instrumenteringsdesignen innehåller viktiga säkerhetsfaktorer, såsom användning av en kylare för att säkerställa att magnetfältleveransutrustningen förblir sval även när den används med hög effekt, och felsäkra procedurer som förhindrar att systemet slås på om alla temperatur-, effektbedömnings- och styrsystem inte har aktiverats. Dessutom finns det viktiga biologiska faktorer som måste beaktas för både in vivo- och in vitro-situationer. Vid användning av odlade celler är det nödvändigt att behandla i tillväxtmedia och upprätthålla vid en konsekvent livskraftig temperatur för att undvika fysiologiska förändringar som kan påverka resultaten. För enskilda nanopartikeltyper är det viktigt att känna till den specifika absorptionshastigheten (SAR) vid beräkning av AMF-baserade uppvärmningsparametrar. På samma sätt är det viktigt att känna till mNP / Fe-koncentrationen, i celler och vävnader, som är nödvändig för att uppnå önskad uppvärmning. In vivo-metoder kräver ännu mer uppmärksamhet på detaljer eftersom djuret måste hållas under anestesi under behandlingen och djurets kärnkroppstemperatur bibehållas på en normal nivå under hela behandlingen. Att tillåta djurets kroppstemperatur att sjunka, som händer under anestesi, kan påverka de totala resultaten med avseende på den termiska dosen av vävnaden som behandlas.
I detta manuskript diskuterar vi de metoder som används för att designa och konstruera ett mångsidigt magnetiskt nanopartikelhypertermisystem, samt viktiga användningsfaktorer som måste beaktas. Det beskrivna systemet möjliggör robust, konsekvent, biologiskt lämplig, säker och välkontrollerad leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi. Slutligen bör det noteras att de mNPH-studier vi genomför ofta involverar andra terapier som strålning, kemoterapi och immunterapi. För att dessa resultat ska vara meningsfulla är det viktigt att avgöra hur den levererade värmen kan påverka effekten och/eller säkerhetstoxiciteten hos andra modaliteter (eller vice versa) och djurets välbefinnande. Av denna anledning och de dosimetri och terapeutiska situationer som tidigare nämnts är det viktigt att ägna strikt uppmärksamhet åt den magnetiska nanopartikelhypertermidoseringsnoggrannheten och de kontinuerliga kärn- och måltemperaturmätningarna. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en enkel, konsekvent metod och beskrivning för leverans av säker och effektiv magnetisk nanopartikelhypertermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dartmouth College Animal Care and Use Program är ackrediterat av American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) och följer alla riktlinjer och föreskrifter för UDSA och NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alla in vivo-studier godkändes av Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanasiproceduren följer 2020 års AVMA-riktlinjer för eutanasi av djur.
1. Instrumentering/utformning av systemet
- Designa anpassad AMF-antenn (spole) för att vara en sluten slinga, välj former för att skapa önskat magnetfält. Använd induktansformler och egenskaper från kraftgeneratorval för att designa kompatibla spolar för att generera önskat fält. Använd olika mönster för in vitro- och in vivo-experiment.
- Se till att AMF-antennens induktans faller inom kraftgeneratorns acceptabla intervall. Lägg till eller subtrahera kondensatorer för att matcha (ställa in) antennen till kraftgeneratorn.
- För in vitro-experiment, designa en 14-varvs spiralformad spole, innerdiameter 2 cm och längd 14 cm, som kan innehålla 1,5 ml rör, vilket möjliggör behandling av flera prover samtidigt. Isolera spolen med en vinylpolymer och använd en polystyrendistans för att separera spolen från rören. Detaljer om designspecifikationer och överväganden finns i tilläggsfilen 1.
- För in vivo-experiment, skaffa en specialbyggd helkroppsspiralformad spole från en tillverkare med proprietär designinformation. Använd 8 mm fyrkantiga slangar (eftersom det skapar ett mer enhetligt fält inom spolens borrning) och en koncentrator vid det riktade behandlingsområdet. Gör koncentratorn 5,0 cm lång, med totalt 5 varv som resulterar i en innerdiameter på 3,6 cm, 5,2 cm ytterdiameter, och ha sin placering vid det riktade behandlingsområdet. Omge spolen med ett polykarbonatskal.
- Använd en AMF-generator med justerbar effekt och frekvens, klassad till 10 kW eller högre som strömkälla. Induktansen matchar strömkällan och antennerna/spolarna till ett intervall på 0,62 till 1,18 μHenries (μH), vilket möjliggör frekvenser mellan 30-300 kHz. Kyl generatorn med återvunnet vatten genom en centrifugallyftpump, tryckreglerad till 50 psi.
- Kyl spolarna med en kylaggregat med 5,6 ton kylkapacitet som pumpar 25% etylenglykolbaserad värmeöverföringsvätska utspädd med vatten genom AMF-antennen. Ställ in kylaggregatets temperatur så att antennen inte värmer eller kyler provet.
- För djurinneslutningen, konstruera en rörformad hållare som kan hängas upp i mitten av spolen med ett 0,5 cm luftgap mellan hållaren och spolytan. Anslut en justerbar konditionerad luftpump som cirkulerar luft genom skalet runt spolen och ställ in den för att bibehålla en normal djurkärntemperatur. Anslut anestesimaskinen till den rörformiga djurhållaren nära djurets huvud för att säkerställa korrekt leverans av anestesi.
- För cellinneslutning, skapa en apparat som cirkulerar vatten från ett vattenbad genom distansen där rör placeras. Ställ in temperaturen på detta vattenbad så att rören omges av vatten vid 37 °C.
- Använd fiberoptiska sonder för att övervaka temperaturer i tumören, djurets kärna och djurmiljön eller för in vitro-studier, övervaka temperaturen på cellpelleten och vattnet som omger rören.
- Använd magnetiska järnoxidnanopartiklar som är 100 nm stora för alla experiment.
OBS: Koncentration och specifik absorptionshastighet (SAR) är två egenskaper som måste beaktas vid val av nanopartiklar, eftersom de direkt påverkar den möjliga uppvärmningen och termiska dosen18.
2. Hypertermi in vitro
- Kultur B16F10 murina melanomceller i RPMI-media med 10% FBS och 1% Pen / strep. Platta 150 000 celler/brunn i 6-brunnsplattor, med 2 ml komplett medium.
- Bestäm lämplig behandling för varje brunn, dvs celler utan mNPs och ingen AMF, celler med mNPs och ingen AMF, celler utan mNPs och AMF, celler med mNPs och AMF.
OBS: Se också till att det finns lämpliga kontroller om du kombinerar hypertermi med en annan behandling. AMF utförs i ett standardlaboratorium för forskningsbänkar som eftermonteras med den effekt och kylkapacitet som behövs. - 24 timmar efter plätering, tillsätt mNP till lämpliga brunnar enligt bestämd i föregående steg. Tillsätt mNP till en koncentration av 3 mg järn/ml. Se till att mNPs distribueras i hela brunnen, antingen genom att skapa en lagermedia / mNP-lösning (ta bort gamla media, lägga till den här lösningen) eller genom att lägga till mNPs direkt och försiktigt virvlande plattor för homogen distribution.
- Börja behandlingen, 48 h efter tillsats av mNPs, när brunnar är ~ 80% sammanflytande, genom att ta bort media och tvätta brunnar med färska medier. Ta bort media.
- Tillsätt 0,5 ml trypsin till varje brunn som behandlas och virvla försiktigt. Använd ett mikroskop för att kontrollera att cellerna är fristående.
- Tillsätt 1 ml media till varje brunn för att samla cellerna i 1,5 ml rör. Samla alla celler från brunnen (~ 1 x 106 celler). Använd ett tydligt märkt separat rör för varje brunn.
- Snurra rör vid 60 x g i 2-3 minuter för att låta cellerna pelletera. Behåll pelleten i media.
- Placera rören i distansen fulla av vatten i spolen. Ställ in vattenbadets temperatur så att mediet och cellpelleten hålls vid 37 °C. Övervaka temperaturen i röret och vattenbadet med separata fiberoptiska temperatursonder.
- Slå på kylaren, kontrollera att kylvätskan strömmar genom spolen. Slå på strömkällan och justera procenten av maximalt till önskat fält. Använd den 14-varvs solenoidspolen, som drivs av 10 kW generator, vid 165 kHz och 23,87 kA/m (300 Oe).
- Placera en separat fiberoptisk temperatursond i ett av rören. Behandla cellerna tills det tidigare bestämda protokollet termisk dos. Ett exempel är 30 min vid 43 °C (CEM43 av 30).
- Återsuspendera celler i mediet som finns i deras rör och platta om till nya 6 brunnsplattor. Märk tydligt de nya plattorna. Målet är att platta om alla celler som samlats in (~1 x 106 celler).
OBS: Nya 6 brunnsplattor ska användas för att säkerställa att cellerna som odlas får behandling. Om de gamla plattorna används kan det fortfarande finnas celler kvar på plattorna som inte framgångsrikt trypsiniserades. - Om det behövs, för nästa experimentella procedur, lyse cellerna för RNA- eller proteinuttrycksanalys.
3. Hypertermi in vivo
- Cellodling och ympning
- Kultur B16F10 murina melanomceller i RPMI-media med 10% FBS och 1% Pen / strep. Använd tallrikar / rätter som ger tillräckligt med celler för ympning av önskat antal djur. Till exempel kommer 10 100 mm rätter, pläterade vid 100 000 celler, att vara sammanflytande med tillräckligt med celler för 20 mössinjektioner inom 48 timmar.
- Trypsinisera celler och samla med rena RPMI-media (ingen FBS eller penna / strep).
- Räkna celler och skapa en lösning för önskad koncentration av celler, baserat på inokuleringsvolymen och musnummer.
- Bedöva 6 veckor gamla kvinnliga C57Bl / 6 möss med förångad isofluran och syre. Placera djur i en plexiglaslåda med 5% isofluran och 95% syre tills de induceras. När det har inducerats, ta bort djuret och använd en ansiktskon med 2% isofluran för att slutföra steg 3.1.5-3.1.7 och 3.3.3-3.3.6.
OBS: För anestesi under behandlingen använd en inbyggd anestesiinneslutning. Följ vanliga institutionella protokoll för musanestesi. Före djurförsök säkerställa lämpligt IACUC-godkännande. Efter anestesi, sätt tillbaka djuret i buret och övervaka återhämtningen för att säkerställa inga komplikationer. - Kontrollera om det saknas svar på de rätande reflexerna.
- Raka höger flank med en elektrisk rakapparat.
- Rengör injektionsområdet med en alkoholtork. Injicera 1-2 x 106 celler med en 100 μL glasspruta med en 28 G nål, dispergerad i 50 μL media intradermalt på den rakade högra flanken av bedövad.
- Tumörtillväxt/Nanopartikelinjektion
- Mät tumörer i 3 dimensioner med bromsok (längd, bredd och djup) och beräkna volymer med (längd x bredd x djup x π)/6.
- När tumörvolymerna når 120 mm 3 (+/- 20 mm3), placera djuren på studie. Utforma studien och se till att det finns lämpliga kontroll- och behandlingsgrupper inklusive kombinationskohorter (dvs. kontroll, mNPH, strålning och kombinationen).
- Bedöva möss som kommer att ta emot mNPs enligt beskrivningen i 3.1.4.
- Rengör området med en alkoholtork. Injicera mNPs i tumören 3 h före AMF-behandling. Injicera en volym så att dosen är 7,5 mg järn/cm3 tumör.
OBS: Opublicerade data från labbet tyder på att maximalt mNP-upptag sker vid 3-6 timmar.
- AMF-behandling
- Bedöva musen och placera på en värmedyna för att bibehålla kärntemperaturen.
- Kontrollera om det saknas svar på de rätande reflexerna. Ta bort öronmärket eller andra metallföremål på musen.
- Placera försiktigt en lubed fiberoptisk temperatursond i musens ändtarm.
- Placera en kateter i tumören och ta bort nålen. Skär katetern så att den inte sticker ut ur tumören för mycket.
OBS: De fiberoptiska temperaturkatetrarna placeras och tas bort medan mössen är under generell anestesi, dvs katetrarna är endast på plats under tumöruppvärmningsproceduren. Möss ges en enda subkutan dos av ett NSAID-analgesiläkemedel, ketoprofen (5 mg/kg), vid tidpunkten för proceduren. Vi har inte observerat kort- eller långvarigt obehag eller sjuklighet i samband med placeringen av katetrarna. - Sätt i en 3-sensor fiberoptisk temperatursond i katetern. Katetern skyddar de fiberoptiska temperatursondsensorerna.
- Tejpa den rektala och intratumorala sonden till djurets svans för att säkerställa att de förblir på plats.
- Placera musen i ett 50 ml rör, gå till botten. Röret ska ha ett hål nära huvudet där anestesin kommer att anslutas och levereras.
- Placera röret i spolen och anslut anestesin igen.
- Placera en fiberoptisk temperatursond löst i röret för att mäta omgivningstemperaturen.
- Slå på kylaggregatet och se till att kylvätska cirkuleras.
- Kontrollera och se till att datorprogramvaran visar de olika temperaturerna och börja spela in så att en CEM43-beräkning kan visas i realtid. Den erforderliga CEM43 är den dos som tidigare bestämts.
OBS: Innan magneten slås på, se till att inga metallföremål är fästa vid djuret, eftersom dessa värms snabbt. Se också till att alla i rummet inte har en pacemaker och att det är säkert för dem att vara där. - Slå på magneten med låg effektprocent.
- Se till att de fiberoptiska temperatursonderna registrerar temperaturförändringar. Temperaturerna kommer att öka när AMF aktiveras när fältet ökar. Se till att djurets kärntemperatur förblir vid 38 °C. Reglera kärntemperaturen med den konditionerade luftmanteln.
- Justera magnetfältets styrka genom att ändra effekten på generatorn med hjälp av den inbyggda kontrollratten, som i sin tur styr temperaturnivån i tumören.
- Stäng av AMF när önskad dos, som tidigare bestämts av användaren (till exempel CEM43 40), uppnås i tumören.
- När AMF har stängts av, ta bort röret från spolen.
- Ta bort musen från röret, extrahera de olika sonderna och katetern. Märk vid behov djuret med en ny öronmärkning av metall.
- När behandlingarna är klara, stäng av kylaggregatet.
- Återställ djuren från anestesi som garanterar inga komplikationer. Övervaka deras beteende för att säkerställa återgång till det normala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-studier
Celler kommer endast att uppnå och bibehålla önskad temperatur och termisk dos om mängden och koncentrationen av de magnetiska nanopartiklarna/järnet och AMF matchas på lämpligt sätt. Vid användning av magnetiska nanopartiklar för att värma celler in vitro (och in vivo) bör det noteras att för att uppnå hypertermi i celler med internaliserade magnetiska nanopartiklar kommer en specifik nivå av intracellulär mNP / Fe att vara nödvändig, och antal och närhet av mNP-laddade celler, till varandra, kommer att vara nödvändigt. Om nivån av mNP/Fe i målcellerna/vävnaden är tillräcklig för att uppnå en uppvärmningseffekt kan magnetfältfrekvensen och styrkan justeras för att uppnå önskad temperatur och effekt. Om det pläteras ordentligt kan ytterligare studier som tittar på genetiska och molekylära skillnader mellan olika doser och tidpunkter fortsätta17. Figur 1 representerar ett schema över in vitro-metoderna.
Dessa in vitro-metoder kan användas för att undersöka cellulärt mRNA och proteinuttrycksförändring. Ett färskt exempel från vårt laboratorium bestämde immunogenetiska skillnader efter CEM43 30 mNPH-behandling, en 8 Gy strålbehandling och kombinationen. Vi kunde identifiera likheter och skillnader i uttryck över immun- och cytotoxiska vägar för att få en bättre förståelse för mekanismen bakom effekterna, och hur de kombineras synergistiskt17. Varje experiment använder en mängd olika miljö- och uppvärmda kontrollprover. Kontrollerna kommer att ha olika mRNA- och proteinuttrycksnivåer jämfört med dem som får hypertermibehandling.
In vivo-studier
I in vivo-studier finns det ytterligare överväganden. Oavsett målvärmedos är det absolut nödvändigt att upprätthålla en fysiologiskt acceptabel kärntemperatur hos det djur som behandlas. Detta kan vara utmanande med gnagare under anestesi eftersom kärntemperaturen snabbt kan gå förlorad (kärntemperaturmodulerande tekniker som värmedynor är ofta nödvändiga). Lägre kroppstemperaturer än normalt kan kräva behovet av att driva AMF-mNPH för långt när man försöker uppnå en specifik termisk dos i tumören, vilket resulterar i oacceptabla effekter i icke-målvävnaden (icke-målvävnadsvirvelströmuppvärmning är en sådan möjlighet). Även mindre avvikelser i kärnkroppstemperaturen kan leda till oönskade fysiologiska komplikationer i tumören eller normal vävnad. Som tidigare nämnts, men värt att upprepa, för exakt, reproducerbar uppvärmning, är det viktigt att uppnå en matchning mellan mNP / Fe-vävnadskoncentrationen, AMF-frekvensen och parametrarna för temperaturövervakning av fältstyrka och målvävnadens storlek och djup. Det måste finnas en baslinjekoncentration av mNP i tumören för att möjliggöra mätbar uppvärmning. Nivån/förmågan hos värme beror inte bara på mNP-vävnadskoncentrationen (mg Fe/g-vävnad) och deras relativa fördelning inom tumören, utan också frekvensen av AMF och efterföljande fältstyrka. Förändringar i något av ovanstående kan leda till olika intervall av uppnåeliga temperaturer i vävnaden. Genom många års erfarenhet har vi optimerat koncentrationen vi använder för prekliniska tumörbehandlingar och frekvensen och fältstyrkan i AMF-systemet för att möjliggöra säker och effektiv aktivering. Eftersom det är omöjligt att mäta temperaturen/den termiska dosen på alla vävnadsställen är det också viktigt att placera så många fiberoptiska temperatursonder som möjligt på strategiska platser som möjliggör effektivitets- och säkerhetsbedömning i realtid, vilket framgår av figur 2. Dessa sonder möjliggör registrering av temperaturer under hela experimentet, vilket möjliggör noggrann dosimetri och termisk historia för experimentet. Figur 3 visar kurvor som genereras under ett in vivo-experiment, vilket belyser förmågan att noggrant övervaka temperaturen och justera systemet för att bibehålla tumörtemperaturer inom önskat intervall. Figur 4 sammanfattar in vivo-metoderna.
Dessa in vivo-metoder, liknande in vitro-metoderna, kan användas för att undersöka olika cancertyper, olika hypertermidoser och med olika kombinationsbehandlingar. Till exempel har tidigare studier i vårt laboratorium undersökt kombinationen av hypertermi och kemoterapi12. Vi har också genomfört många hypertermi- och strålningsexperiment för bestämning av effekt och molekylära mekanismer. Kontrollmössen för dessa experiment genomgår alla procedurer utom den faktiska genereringen av hypertermi. Figur 5 innehåller två vulkandiagram som visar differentiellt uttryckta gener efter in vitro och in vivo mNP hypertermibehandling (mNPH). Dessa siffror är exempel på hur vi använder molekylära tekniker för att övervaka hypertermieffekterna.
Figur 1: In vitro mNP hypertermi schematisk. Detta schema visar metoden för in vitro magnetisk nanopartikelhypertermi. För att säkerställa uppvärmning måste cellerna tillhandahållas tillräckligt med partiklar och tid för adekvat mNP-upptag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Placering av katetrar för temperaturövervakning. Denna figur visar placeringen av katetrar som rymmer fiberoptiska temperaturprober för att registrera temperaturer på olika platser i tumören och / eller tumörregionen. Denna siffra är anpassad från ref.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Temperaturövervakning i realtid under behandling av en mustumör. Denna graf visar temperaturavläsningar i realtid som möjliggör övervakning av kärnkroppstemperaturen, omgivningstemperaturerna och flera temperaturer i tumören under ett in vivo-experiment. Kontrollen av temperaturer i tumören demonstreras genom de minimala storskaliga variationerna på den inzoomade delen av figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: In vivo mNP hypertermi schematisk. Detta schema visar metoden för in vivo magnetisk nanopartikelhypertermi. Injektion av tillräckliga nanopartiklar samt tillräckligt med tid för distribution och absorption säkerställer förmågan att leverera önskad termisk dos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Differentiellt genuttryck. Differentiellt genuttryck efter behandling med in vitro (A) och in vivo (B) mNP hypertermi. Dessa vulkandiagram representerar genetiska förändringar på en log 2 x-axel, med betydelse på y-axeln, för både in vitro- och in vivo mNPH-metoder. Varje cirkel representerar en annan gen, med de 20 mest signifikanta differentiellt uttryckta generna märkta. Ju längre genen är från noll på x-axeln, desto större är vikförändringen, och ju högre genen är på y-axeln, desto lägre p-värde. Även om båda hade samma termiska dos ledde hypertermi in vivo till större genuttrycksförändringar än in vitro. Dessa diagram är exempel på biologiska data som kan genereras med hjälp av det beskrivna protokollet. Vulkantomten in vitro har anpassats från ref.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utformningen och implementeringen av detta system ger möjlighet att genomföra exakta och reproducerbara in vitro- och in vivo magnetiska nanopartikelhypertermiexperiment. Det är viktigt att systemet är utformat så att AMF-frekvensen och fältstyrkan är tillräckligt anpassade till den magnetiska nanopartikeltypen, koncentrationen och vävnadens placering och temperatur som önskas. Dessutom är noggrann övervakning av temperaturen i realtid avgörande för säkerheten och beräkningen av en exakt termisk dos (kumulativa ekvivalenta minuter vid 43 °C/ CEM). Placeringen av sonder som visas i figur 1 möjliggör realtidsövervakning av termisk dos och kärnkroppstemperatur enligt figur 2.
Det första steget i exakt leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi är att bygga ett säkert system för djur och operatörer. Alla komponenter i systemet bör också vara väl förstådda ur drifts- och leveranssynpunkt. I den här situationen innebär det att förstå potentialen för AMF-virvelströmmar och veta var magnetiska partiklar finns. Antennerna, eller spolarna, är en nyckelfaktor i fältets form och styrka, och kylsystemet som används är viktigt för att förhindra överhettning av spolen20. Fältstyrkan utanför ledaren är direkt proportionell mot strömstyrkan som strömmar genom ledaren. Magnetfältstyrkan vid vilken punkt som helst i utrymmet som omger ledaren är vektorsumman av de fält som produceras av ledarna i det omgivande området. Magnetfältet produceras i rätt vinkel mot strömflödet och styrkan minskar exponentiellt, som en funktion av avståndet från ledaren, enligt Biot-Savarts inversa kvadratregel21. Således används fyrkantiga slangar för in vivo hypertermi för ett mer enhetligt fält i spolen. Att skapa ett magnetfält med den styrka och volym som behövs för ett potentiellt kliniskt relevant system kräver en hög elektrisk ström. Därför måste antennkonstruktioner kunna rymma betydande elektriska effektnivåer. AMF-antenner måste också vara konstruerade så att deras induktans faller inom kraftgeneratorns acceptabla intervall. Vid de frekvenser som vanligtvis används är det mesta av strömflödet på antennledarens yta, vilket innebär att ytan påverkar den resistiva uppvärmningen som kan minimeras genom att eliminera ytfel. Denna resistiva uppvärmning innebär också att ett kylsystem behövs för att säkerställa att spolen och miljön inte överhettas.
En begränsning av vår systemdesign är att den inte tillåter ett totalt frekvensområde och magnetfält, men det gör det möjligt att generera fält som är lämpliga för celler, gnagare och stora djur. Specifikt är den maximala fältstyrkan som är tillgänglig från alla induktionsvärmesystem direkt relaterad till strömflödet i antennen (spolen). AMF-generatorer är klassade i kilowatt, som beräknas genom att multiplicera den tillgängliga spänningen med den tillgängliga strömmen (ampère). Så ett 10kW-system med en gräns på 500 V skulle ha en maximal strömstyrka på 20 A. Spolarnas design kommer att avgöra vilken gräns som uppnås först, och därmed systemgränsen. Magnetfältstyrkan som skapas av vilken ström som helst minskar exponentiellt som en funktion av avståndet från ledaren. Därför skulle en spole med större diameter med samma geometri som en spole med mindre diameter, som körs på samma system, ha en lägre fältstyrka i mitten av spolen. Således begränsas den erforderliga magnetfältstorleken och styrkan av AMF-generatorns kapacitet. Att bygga en större spole och använda mer kraft leder till ytterligare problem, främst virvelströmsuppvärmning.
Det finns flera säkerhetsproblem som måste åtgärdas när du använder detta system för att skydda användare, djur och själva systemet. För det första måste tillräcklig rumsventilation bibehållas under användning av anestesi. För det andra måste alla områden som är associerade med spolen vara fria från metall och eller ledare inklusive blandningar med hög saltlösning. Användare måste ta bort ringar och andra smycken när de arbetar runt AMF, och prover bör inte innehålla någon typ av metall. Av största vikt bör personer med pacemakers eller andra implanterade enheter eller föremål rådgöra med sin läkare innan de arbetar runt AMF. För att skydda systemet bör ett felsäkert system användas som säkerställer att generatorns och spolens kylbehov tillgodoses innan strömmen appliceras. Dessutom bör en termisk kameraöversikt användas för att upptäcka oavsiktlig uppvärmning.
För in vitro-studier är de viktigaste stegen att följa koncentrationen av järn i celler, koncentrationen av celler, AMF-parametrar och termisk dosbedömning. Celler kan behandlas/värmas upp med magnetisk nanopartikelhypertermi genom att placera de magnetiska nanopartiklarna i supernatanten, cellerna eller båda. Mängden magnetisk nanopartikeluppvärmning beror på nivån av magnetiska nanopartiklar/Fe. Om önskan är att endast behandla celler med internaliserat järn är vår erfarenhet att enskilda cancerceller endast kommer att ta upp ett begränsat antal magnetiska nanopartiklar och att även när upptaget är optimalt måste cellerna aggregeras/pelleteras för att skapa celluppvärmningssituation, även med optimerad AMF. Att hålla temperaturen på media och celler på biologiskt relevanta nivåer (när de inte värms upp) är också viktigt för noggrann mätning av sann uppvärmning. Den 14-varvs solenoidspole som beskrivs här gör det möjligt att upprätthålla biologiskt relevanta temperaturer genom att sänka ner proverna i en termiskt kontrollerad vattenpelare.
För in vivo-studierna är det nyckelfaktorer att bibehålla djurets kärntemperatur och noggrant mäta temperaturen i tumören. Detta djurinneslutningssystem och spolens design eliminerar termisk drift i djurets miljö på grund av spol- / effektinställningar och hjälper till att upprätthålla normal kärnkroppstemperatur. Att upprätthålla kroppens kärntemperatur är avgörande för meningsfulla experimentresultat. Den rektala sonden möjliggör övervakning i realtid av djurets kärntemperatur. Vid anestesi minskar ett djurs kärntemperatur i sig. För att hantera denna situation utvecklade vi ett miljövärmesystem som levererar varm luft runt djurinneslutningskärlet, vilket gör att kärntemperaturen kan hålla sig inom det normala intervallet. Att upprätthålla normal kärntemperatur är avgörande för att säkerställa korrekt tolkning av hypertermibehandlingsresultat och eliminering av miljöfaktorer. Placeringen av temperaturövervakningsproberna på flera ställen i målvävnaden/tumören är viktig för att få en korrekt bedömning av den uppnådda temperaturen och termiska dosen. Eftersom det är extremt svårt om inte omöjligt att distribuera magnetiska nanopartiklar homogent inom en tumör, är det viktigt att känna till uppvärmningsparametrarna på flera platser för att uppnå en konsekvent och exakt termisk dos av vävnad / tumör. Det är viktigt att notera att koncentrationen för in vitro- och in vivo-studier varierar. Denna variation beror på att det finns färre gränser i cellodling med celler som har mer tillgång till mNPs, så en lägre koncentration kan användas. In vivo är en högre koncentration nödvändig på grund av tumörernas heterogena natur och den komplicerade 3D-morfologin. Att använda samma koncentration av partiklar in vivo och in vitro skulle därför leda till att mycket färre tas upp av celler.
Detta manuskript beskriver de parametrar och instrument som krävs för att utveckla en effektiv och flexibel alternerande magnetfältgenerator och spolsystem för magnetiska nanopartikelhypertermibehandlingar. Detta system kan användas för både in vitro- och in vivo-studier. Systemet är effektivt för lokaliserad/riktad hypertermi och sparsamhet med normal vävnad vilket gör det tilltalande, jämfört med andra AMF-mNP-hypertermisystem. Dessa hypertermibehandlingar kan ändras för att undersöka effekterna av olika doser, med en mängd olika nanopartiklar eller nanobärare och tilläggsbehandlingar. Eftersom vävnadsuppvärmning, särskilt magnetisk nanopartikeluppvärmning, kan påverkas av så många variabler är det viktigt att förstå parametrarna i en undersökning. Om dessa kriterier uppfylls kan magnetisk nanopartikelhypertermi hantera många molekylära, cellulära och kliniska situationer, inklusive oberoende och adjuvant tumörkontroll. Även om de metoder som beskrivs här kräver betydande ansträngningar, om riktlinjerna följs, kan den fulla potentialen för mNP-hypertermi realiseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien finansierades av bidragsnummer: NCI P30 CA023108 och NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
